Extracto
El cáncer de pene (PEEC) es una entidad tumor relativamente poco frecuente, pero posee altas tasas de morbilidad y mortalidad, especialmente en los países en desarrollo. Hasta la fecha, las vías de señalización patógenos concretos y los mecanismos básicos implicados en la tumorigénesis y la progresión de PEEC aún no se han dilucidado. Varios estudios sugieren miRNAs, que modulan la expresión de genes a nivel postranscripcional, fueron frecuentemente mal regulado y expresado de forma aberrante en los cánceres humanos. Sin embargo, el perfil de miARN en PEÇA humano no se ha informado antes. En el presente estudio, el perfil de miARN se obtuvo a partir de 10 tejidos cancerosos fresco del pene y coincide con los tejidos no cancerosos adyacentes a través de secuenciación de próxima generación. Como resultado, se identificaron un total de 751 y 806 miRNAs anotados en los tejidos del pene normal y canceroso, respectivamente. Entre los cuales, se identificaron 56 miRNAs con significativamente diferentes niveles de expresión entre los tejidos emparejados. Posteriormente, se seleccionaron al azar varios miRNAs anotadas y validaron utilizando cuantitativa en tiempo real PCR. En comparación con las publicaciones anteriores con respecto a la expresión miRNAs alterados en varios tipos de cáncer y especialmente cánceres genitourinarios (próstata, vejiga, riñón, testículos), la más mayoría de miRNAs desregulados mostró el patrón de expresión similar en cáncer de pene. Por otra parte, los análisis de la bioinformática sugirieron que los genes diana putativos de miRNAs expresados diferencialmente entre los tejidos del pene normales cancerosas y emparejados estaban fuertemente asociadas con la unión celular, la proliferación, el crecimiento, así como la inestabilidad genómica y así sucesivamente, por la modulación de Wnt, MAPK, p53, PI3K -Akt, las vías de Notch y TGF-β señalización, que fueron todos bien establecidos para participar en la iniciación y progresión del cáncer. Nuestro trabajo presenta una visión global de la diferencialmente expresado miRNAs y redes potencialmente reguladoras de sus genes diana para aclarar la transformación patógena del pene normal a PEEC, que los recursos de investigación también proporciona nuevos conocimientos sobre las futuras investigaciones destinadas a explorar los mecanismos a fondo de miRNAs y otros pequeños RNAs incluyendo piRNAs en la regulación de la carcinogénesis del pene y theragnosis específica de la diana efectiva
Visto:. Zhang L, P Wei, Shen X, Zhang y, Xu B, Zhou J, et al. (2015) MicroARN perfil de expresión en el cáncer de pene revelado por próxima generación de RNA Secuenciación. PLoS ONE 10 (7): e0131336. doi: 10.1371 /journal.pone.0131336
Editor: Yu Xue, Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología, CHINA
Recibido: 10 Febrero, 2015; Aceptado: 1 de junio de 2015; Publicado: 9 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Toda la secuenciación prima archivos están disponibles en la base de datos ArrayExpress (número de acceso: E-MTAB-3087)
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81401518, N ° 31430028, http: //www.nsfc.gov.cn/) (LZ); la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81170698, Nº 81370856, http://www.nsfc.gov.cn/) (CZL); la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 31370983, http://www.nsfc.gov.cn/) (DHZ); Fundación de Anhui Provincial de Ciencias Naturales (No.1408085QH180, http://www.ahkjt.gov.cn/) (LZ), el Programa de temas clave clínica del Ministerio de Salud Pública de China (Urología, http: //www.nhfpc .gov.cn /) (CZL), el proyecto de cultivo para la SNCF en la Universidad médica de Anhui (núm 2013KJ14, http://www.ayfy.com) (LZ) y el proyecto clave del Ministerio de Educación de china (Nº 212.080, http://www.moe.edu.cn/) (DHZ). Los donantes no tenían papeles en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la investigación molecular ha surgido como una herramienta prometedora para la comprensión en profundidad sobre la carcinogénesis, con sus componentes celulares, las vías y los objetivos farmacéuticos en la terapéutica del cáncer de señalización. Por desgracia, el notable progreso no ha abarcado todos los tipos de cáncer. El cáncer de pene (PEEC) es una entidad tumoral tales relativamente raro en los países desarrollados del mundo, sólo alrededor de 1.640 casos de cáncer de pene se ha diagnosticado recientemente y 320 muertes relacionadas con el cáncer se estimó en 2014 en los Estados Unidos a nivel nacional [1]. Mientras que, las tasas de morbilidad y mortalidad de PEEC en la mayoría de los países en desarrollo fueron considerablemente más altos, lo que representa un aumento de 3-10 veces en las tasas de los países desarrollados en las últimas décadas [2]. El cáncer de pene se asocia con varios factores de riesgo establecidos, como la infección por virus del papiloma humano (VPH), la falta de higiene, fimosis con la inflamación crónica, tabaquismo y algunas alteraciones epigenéticas incluyendo modificaciones de metilación de las histonas [3,4]. Además, se han identificado unos pocos genes durante la carcinogénesis, la proliferación, invasión y metástasis de PEEC. Por ejemplo, p53, ciclina dependiente inhibidor de quinasa 2A (CDKN2A) y metalopeptidasa matriz 9 (MMP-9) fueron demostrado jugar un papel crucial en rutas cancerígenos Protocolo y transición epitelio-mesenquimal (EMT), respectivamente [5]. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, una amplia investigación adicional para aclarar aún más los mecanismos exactos de los cambios moleculares que subyacen a la iniciación, desarrollo y progresión del Protocolo es imperativo para nosotros para explorar novedoso y valioso de detección preventiva, temprana, terapias dirigidas y la predicción del pronóstico acerca de este genitourinario trastorno.
microARN maduro (miRNAs) son un grupo de expresarse de manera endógena, evolutivamente conservados, de cadena sencilla y no codificante ARN pequeños (smRNAs, aproximadamente 19-23 nucleótidos de longitud) que actúan como reguladores de genes postranscripcional la expresión en una amplia gama de organismos [6]. Hasta la fecha, más de 1000 miRNAs humanos se han identificado y tremendas observaciones se han logrado en la conexión de los niveles alternativos y la expresión aberrante de miRNAs con el inicio y la progresión de las enfermedades humanas, especialmente para los diversos tipos de tipos de cáncer [7-9], como no menos de media genes miARN se encuentran en las regiones asociadas con el cáncer o en los sitios frágiles en todo el genoma [10]. miARN desregulación en la biología del tumor se observó por primera vez en los genes miARN-15a y miRNA-16-1 en el locus 13q14, ambos de los cuales dos miRNAs dirigidos linfoma de células B 2 (Bcl-2) mRNA fueron eliminados o regulados a la baja en la mayor parte de la mayoría crónica linfocítica crónica (LLC) de los casos, lo que resulta en la tumorigénesis mediante la reducción de las actividades de apoptosis [11]. En la actualidad, se ha aceptado ampliamente que distintos tipos de cáncer, las etapas, los grados de regresión o estados de diferenciación posible que poseen perfiles de expresión de los genes miARN individuales, que contienen una gran promesa en la actuación biomarcadores moleculares como fiables para el diagnóstico del cáncer y también puede revelar nuevas vías de señalización patógena correlacionados con la carcinogénesis y la progresión para la terapéutica moleculares específicos [12]. Desde entonces, una variedad de técnicas se han introducido para llevar a cabo miARN perfiles. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR), análisis y microarrays Blot del Norte han sido nunca utilizado ampliamente para estudios de perfiles de miARN [13]. Recientemente, un llamado secuenciación de próxima generación de tecnología recientemente desarrollada (NGS) ha atraído mucha atención en los pequeños ARN de perfiles (smRNA) debido a sus ventajas únicas en la especificidad de la prueba, la sensibilidad y la novela de identificación smRNAs [14-16]. A través del cual, podemos detectar casi todos los smRNAs como miRNAs conocidos y novedosos, incluso con muy baja abundancia, pequeños ARN citoplásmicos (scRNAs), ARN nucleares (snARN), ARN nucleolar (snoRNAs) y ARNs Piwi-interactuando (piRNAs) [17] .
en el presente estudio, hemos dirigido a llenar el vacío de información sobre el perfil de miARN en el cáncer de pene humano y se evalúa una posible correlación entre los niveles de expresión de los genes miARN diferenciados con la tumorigénesis y progresión. Mediante la aplicación de la secuenciación de próxima generación de la tecnología (NGS), se realizó smRNA-ss para las diez muestras apareadas fresco congelado de carcinoma de células escamosas de pene y combinarse histológicamente los tejidos del pene, que eran normales adyacentes al cáncer. Hemos abordado la información general de los perfiles de expresión de genes miARN tanto en los tejidos del pene emparejadas y especialmente encontrado que un número de miRNAs se expresaron de manera aberrante en los cánceres de pene en comparación con los tejidos normales emparejados. Cabe destacar que el análisis de la ontología de genes (GO) de posibles genes miARN indicó que los miRNAs desregulados en los procesos biológicos enriquecidos, funciones moleculares y componentes celulares estaban involucrados en el crecimiento celular, la forma celular, axonogenesis, la regulación de la actividad de la proteína y la angiogénesis, que en conjunto participaron en el transformación de células normales a lesiones malignas. Además, la Enciclopedia de Kyoto de genes y genomas análisis de vía (KEGG) enriquecido con éxito varias vías asociadas con el cáncer que fueron fuertemente todo bien documentados para participar en la iniciación del cáncer, el desarrollo, la invasión, metástasis y terapia también prometedor. Nuestros resultados proporcionan una valiosa fuente de investigación para dilucidar aún más las funciones de regulación de miRNAs en la tumorigénesis y la progresión del pene, lo que también representa una gran promesa para facilitar el desarrollo de nuevos biomarcadores de diagnóstico y estrategias terapéuticas efectivas para PEEC.
Materiales y Métodos
Ética declaración
consentimientos informados fueron firmados por todos los trece a los propios pacientes con carcinoma epidermoide de pene que habían recibido penectomía parcial y se evaluó exhaustivamente la investigación y luego aprobados estrictamente de acuerdo con las regulaciones por parte del Comités de ética de la Investigación humana de la primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Anhui (Aprobación Nº PJ20140906).
colección de muestras clínicas de cáncer
del pene y las muestras no malignas emparejados se obtuvieron de un total de 13 pacientes que se sometieron a penectomía parcial 2013-2015 en el Departamento de Urología, el primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Anhui. Inmediatamente después de la cirugía, cancerosos y tejidos del pene normal correspondiente se almacenaron por separado en solución RNAlater (Ambion, EE.UU.) y se congelaron a -80 ° C de acuerdo con un procedimiento de operación estándar (SOP) guiado por la uropathologist. Brevemente, se incluyeron los tejidos tumorales que contienen las lesiones tumorales más de 80% para otros análisis. En consecuencia, los tejidos adyacentes normales emparejados se obtuvieron de los que al menos 1.0 cm de distancia de los tejidos tumorales visibles en pene. Cada tejidos cancerosos y no malignos fueron diagnosticados histopatológicamente por hematoxilina-eosina (HE) -staining.
smRNA construcción de la biblioteca y la secuenciación profunda
El ARN total se obtiene de diez pares de pene fresco congelado cánceres y emparejaron los tejidos del pene histológicamente normal utilizando reactivo TRIzol (Life Technologies, EE.UU.). ARN calificado con relación A260 /A280 más de 1,8 fue evaluada posteriormente para la integridad del ARN mediante la realización del ensayo de chip de ADN. Dos bibliotecas smRNA se construyeron a partir de ARN agrupados e integrados de diez personas por cada grupo (tejidos del pene normales y cancerosas emparejados) mediante el uso de un kit de preparación de muestras smRNA (Illumina, EE.UU.) siguiendo los protocolos estándar con modificaciones específicas [15]. Brevemente, las fracciones apropiadas variaron de 18 nt a 28 nt se separaron, se purificó a través de 15% (w /v) electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida y luego ligado a adaptadores de ARN (5'-y 3'-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG) seguido por RT-PCR amplificación. A continuación, los productos de PCR se purificaron adicionalmente en geles de agarosa para establecer las bibliotecas. Por último, las dos bibliotecas que construyen a partir de diez tejidos cancerosos del pene (agrupados y homogeneizados a una biblioteca) y diez tejidos del pene normal adyacente emparejados (agrupados y homogeneizados a otra biblioteca) se secuenciaron mediante la aplicación de Illumina HiSeq 2000 (Illumina, EE.UU.) a Pekín Genómica siguiendo estrictamente los protocolos estándar Institute (Shenzhen, china) [18].
analiza los datos de NGS y novedosas miRNAs identificación
los datos de secuenciación smRNA se analizaron adicionalmente en referencia a los métodos descritos en las publicaciones anteriores [15-18]. Concretamente, después de eliminar 5 'adaptador y el recorte de secuencias 3' aceptor, Quitar contaminada y de baja calidad lee (Q & lt; 10, el valor de la calidad se calcula Q código-64 = carácter ASCII) tal como se lee sin fragmento de inserción o poli contiene ( a) se extiende, las etiquetas únicas calificados fueron asignadas a GRCh37.p5 mediante la introducción de la herramienta SOAP2.0 ultrarrápida (http://soap.genomics.org.cn) [19]. Etiquetas con no más de un desajuste se escogieron para su posterior análisis. Los conocidos miRNAs conservadas se identificaron mediante la alineación de las etiquetas asignadas a la herramienta miRBase (versión 18.0) en
Homo sapiens
[20], y las etiquetas no coincidentes en miRBase posteriormente alineados en contra de las secuencias de otros ARN no codificantes (ARNr, ARNt, snARNs, snoRNAs) presentó en la base de datos de Rfam (http://www.sanger.ac.uk/resources/databases/rfam.html) [21], se repite la base de datos, así como la base de datos piRNA [22]. En consideración de algunas etiquetas smRNA podrían asignarse a más de una categoría, seguimos las reglas de prioridad que se describen en la publicación anterior para garantizar que cada smRNA única fue asignada a la anotación única de la siguiente manera: miARN, Rfam, repeticiones, piRNA y ARNm (122.228 .158.106 /mr2_dev) [23].
Después de identificar los miRNAs conocidos, el resto de secuencias de todas las muestras normales del pene cancerosas y no coincidentes con apuntes sobre la bases de datos de los antes mencionados fueron recogidos de las dos bibliotecas se alineen con el transcriptoma humano integrado para predecir la novela miRNAs. Todas las estructuras de horquilla similar a las etiquetas que contienen smRNA no clasificados consistentes en no menos de 45 lee se prevé utilizar herramienta de predicción de pre-microARN clásica Mireap (http://sourceforge.net/projects/mireap/) [24] estrictamente de acuerdo con las siguientes reglas: 1) Longitud de secuencias de genes miARN cubre del 18 al 26 nt; 2) La energía libre de un precursor de miARN es menos de -18 kcal /mol; 3) Bulge permitió miARN y el precursor emparejado miARN * es inferior a 4; 4) Espacio entre miARN y el precursor emparejado miARN * no es más de 35 nt. Mientras tanto, el ARN Fold (http://rna.tbi.univie.ac.at/RNA/RNAfold.html) [25], un programa calcula el mínimo de energía libre (MFE) y trazas de una estructura secundaria óptima, se prestó para predecir todas las estructuras secundarias esenciales de los posibles precursores miARN. Todos los datos brutos generados por la secuenciación de próxima generación se ha depositado en la base de datos designada ArrayExpress (número de acceso: E-MTAB-3087).
Bioinformática análisis de miRNAs expresados diferencialmente
Los enfoques descritos en nuestra publicación anterior para los análisis bioinformáticos se introdujeron para realizar la predicción de genes diana en el presente estudio [17-18]. En pocas palabras, los genes específicos de miRNAs expresados diferencialmente de los tejidos del pene normales y cancerosas emparejados se prevé utilizar Metas microcosmos, anteriormente llamados objetivos miRBase (http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/) [26-27 ], TargetSpy (http://targetspy.org/) [28] y Miranda (http://www.microrna.org) [29]. Las predicciones concretas fueron estrictamente de acuerdo con las normas que se describen de la siguiente manera: 1) Cualquier desajuste no se debe encontrar en la región de la semilla; 2) La energía libre del dúplex /genes miARN objetivo debe ser inferior a -20 Kcal /mol; 3) La puntuación total para un par de miARN-mRNA debe ser superior a 140 [17-18].
A continuación, el GO términos enriquecido (http://www.geneontology.org) [30] y las vías KEGG ( http://www.genome.jp/kegg/) [31] se realizaron análisis de los genes objetivo previsto de miRNAs expresados diferencialmente de especímenes normales y cancerosas del pene. En concreto, después de la cartografía de los posibles genes diana para el conjunto de datos de anotaciones GO y KEGG vías, la clasificación de los procesos biológicos enriquecidos y las vías de señalización a través de pruebas Hipergeométrica y Fisher, los ratios de enriquecimiento y valores de p para GO y KEGG se calculan a través de la introducción de la idénticos fórmula mencionada en el informe anterior [17], a continuación, el ajuste Tasa de Falso Descubrimiento (FDR) se realizó para evaluar la significación de las diferencias en múltiples ensayos [32]. Con el tiempo, los términos y las vías principales GO se identificaron sólo bajo la circunstancia de que ratio≥2.0 enriquecimiento y FDR valor de p & lt; 0,05 simultáneamente
verificación de QRT-PCR para los genes miARN expresión alterada
miRNAs maduro. la cuantificación se realizó por la rutina cuantitativa en tiempo real de PCR usando un Sistema de Applied Biosystems StepOne real-Time PCR (Applied Biosystems, EE.UU.) y un kit SYBR premezcla Ex-Taq II (Takara, Japón) con condiciones de reacción optimizadas y usando los cebadores específicos enumerados en la Tabla S1. Brevemente, el ARN total fue extraído a partir de 13 tejidos del pene normales y cancerosas emparejados pareadas. Entre los cuales, el ARN extraído de los diez pacientes idénticas aplicadas a NGS se reunió y se valida, mientras que cada ARN total de otros tres pacientes se utilizó por separado para análisis adicionales. Después de la síntesis de ADNc, triplicarán reacciones se realizaron a 95 ° C /10 min, los 40 ciclos de amplificación posteriores se llevaron a cabo a 95 ° C /15 s y 60 ° C /60 s. Mientras tanto, U6 snRNA se prestó como un control interno para normalizar la expresión de los genes miARN. Para el análisis de datos, el ciclo umbral (Ct) se define como los ciclos fraccionarios cuando la fluorescencia pasa un umbral fijo y se aplica adicionalmente para calcular las abundancias relativas de los genes miARN (△△ Ct = Ct
miARN-CTSN
RNAU6). Expresión relativa de pliegue cambios se calcularon utilizando 2
- △△ fórmula Ct [16]. Se analizaron las diferencias de concentración entre miARN tejidos del pene cancerosas y normales utilizando prueba t no pareada [18]. Cuando se encontró un valor de p sea inferior a 0,05, que sería considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Información general de todo el genoma de datos smRNA-secuenciación de las muestras pareadas del pene
Todos los smRNAs de 18-32 nucleótidos de las muestras congeladas frescas pareadas de carcinoma de células escamosas del pene (en lo sucesivo, "los tejidos cancerosos") y el grupo tejidos del pene histológicamente normales adyacentes al cáncer (en lo sucesivo, "los tejidos normales" ), que han sido diagnosticados histopatológicamente por HE-tinción (figura 1), fueron secuenciados de profundidad con el fin de obtener una visión global del perfil smRNAs.
tinción HE ilustra los tejidos del pene normales adyacentes representativos (izquierda) y especímenes de pene cancerosas (derecha) de tres pacientes, respectivamente.
para cada muestra, 13.796.889 (15.702.009 de lecturas) y 14.051.355 secuencia de lecturas (de un total de 15.698.197 lecturas) alineados con el genoma humano secuencia de datos fueron obtenido, lo que representa 704 514 (de un total de 966.914) y 787,447 (1,090,353) de etiquetas únicas, respectivamente (S2 Tabla). Entre los cuales, 6.898 etiquetas únicas que corresponden a 4.795.955 lee y 7.173 etiquetas únicas que corresponden a 3.815.482 lee fueron combinados con miRNAs conocidos para los tejidos normales y cancerosas, respectivamente. Mientras tanto, 5.877 correspondiente a 172.216 lecturas y 6.272 correspondiente a 119.724 lecturas fueron emparejados a piRNAs conocidos para los tejidos normales y cancerosas, respectivamente. El resto de las secuencias fueron emparejados en otros tipos de ARN, incluyendo mRNAs, rRNAs, sRNAs, snARN, snoRNAs, ARNt, repeticiones y así sucesivamente (Figura 2 y la Tabla S2). Entre los cuales, se repite el consistían principalmente ARNr ya sea con base en el total lee o etiquetas únicas (S3 Tabla).
Se obtuvieron las etiquetas únicas y el total se lee alineado con la secuencia del genoma humano conjunto de datos. El mapeado etiquetas únicas y limpio lecturas fueron anotados y clasificados como miARN, piRNA, ARNr, sRNA, snRNA, snoRNA, ARNt, repeticiones, etc. basado en la comparación con bases de datos analíticos, etiquetas parciales y las lecturas no fueron anotados.
La mayoría de ellos eran limpias lee 22 nt en tamaño, seguido constantemente por fragmentos de ARN de 23 nt y 21-nt (S1) Fig. Además, para entender el patrón de distribución de todas las etiquetas únicas en los cromosomas, se evaluó la ubicación detallada de cada etiqueta en el cromosoma. Como resultado, las distribuciones de cromosomas entre los tejidos cancerosos y normales fueron generalmente los mismos. Concretamente, en los tejidos del pene cancerosas, cromosoma 1 albergaba la mayoría de las etiquetas únicas, seguido por el cromosoma 2, 11, 12 y 17, de manera correspondiente, la mayoría de las etiquetas únicas localizados en el cromosoma 1, 2, 17, 12, 11 en el adyacente tejidos del pene normales (figura S2).
Características de los principales abundantes conocidos y nuevos miRNAs
Para analizar los miRNAs más abundantes en los tejidos del pene, encontrarás los mejores 20 miRNAs altamente expresados con relativamente más lecturas contar en orden decreciente de los 751 y 806 miRNAs conocidos en tejidos del pene normal y canceroso, respectivamente, que el perfil de expresión se indicó por tanto la absoluta lee contar y la lee el recuento de lecturas por millón recuento. En los tejidos del pene normales, let-7a-5p, let-7F-5p, let-7b-5p, let-7c-5p, miR-140-3p, let-7 g-5p, let-7e-5p, miR-103a -3P, miR-320a, miR-143-3p eran los mejores miRNAs abundantes. En consecuencia, los miRNAs altamente expresados en tejidos del pene cancerosas se dejaron-7F-5p, let-7a-5p, let-7b-5p, let-7c-5p, miR-140-3p, miR-199b-3p, let-7 g -5p, miR-199a-3p, let-7e-5p y miR-143-3p poseía abundantes los mejores niveles de expresión. A partir del cual, se encontró que los miRNAs más altamente expresado en los tejidos del pene normales y cancerosas fueron aproximadamente los mismos (Tabla 1), lo que indica el origen idéntica histológico de las muestras pareadas sometidos a la secuenciación profunda.
Para identificar potenciales nuevos miRNAs en los tejidos del pene, las etiquetas no clasificados se procesaron utilizando la herramienta Mireap. Sólo aquellos con etiquetas lee recuento de más de 50 y emparejando estrictamente los parámetros por defecto se clasificaron como candidatos de nuevos miRNAs maduros. Sobre la base de este análisis, cada 10 miARN precursores (cuyo potencial de tallo-bucle estructuras se muestra en S3 figura) que codifican las más abundantes novela predijo candidatos madura miARN con longitudes variaron del 22 al 24 nt fueron identificados por separado en las dos bibliotecas smRNA de tejidos del pene. Notablemente, 7 abundantemente expresado nuevos miRNAs se solapan entre tejidos cancerosos y emparejados adyacentes normales del pene (Tabla 2), lo que indica el origen y la localización cromosómica idéntica histológico de los miRNAs en ambos tejidos una vez más. Mientras tanto, estos nuevos miRNAs se originó a partir mismos precursores también han demostrado la heterogeneidad y la preferencia, mediante la generación de productos relativamente más maduros desde el extremos 3 'en comparación con los extremos 5' y entre los 10 mejores madura miRNAs novedosos, ya sea en los tejidos del pene, 9 miRNAs iniciaron con adenina o uridina (Tabla 2), lo que los patrones fueron consistentes con el informe anterior [17].
perfiles expresados diferencialmente de miRNAs en los cánceres de pene
al comparar los distintos niveles de miARN abundancia entre los tejidos normales y cancerosas, dos cantidades son frecuentes de gran importancia: uno es el p-valor correspondiente a las respuestas de la prueba t a la cuestión de si la diferencia estadísticamente significativa de los niveles de expresión entre los grupos apareados se puede lograr. El otro es el valor de factor de cambio (FC), lo que podría ilustrar lo que es la magnitud de la diferencia entre la abundancia miARN las muestras pareadas. Cabe destacar que, incluso muy grandes valores de FC pueden tener valores de p insignificantes de acuerdo con la prueba t causada por variabilidades considerables. Del mismo modo, relativamente pequeña magnitud de la diferencia puede significar también un pequeño p-valor debido a las repeticiones técnica altamente consistentes dentro de cada muestra. Por lo tanto, un método de visualización útil llamado "volcán parcela", que puede exhibir simultáneamente factor de cambio y los valores de p en el eje X y el eje Y por separado, se ha introducido para llevar a cabo nuestro análisis. En general, los puntos situados en las regiones superiores de la izquierda o superior derecha de la trama y se indica con el color verde debería llamar más la atención, ya que tenían tanto los valores de p pequeños (p & lt; 0,05) y altos valores de FC (FC≥2) . En este estudio comparativo, el resumen de la trama generada por el volcán perfiles de miRNAs en el cáncer de pene y los tejidos normales emparejados se muestra (figura S4). Como resultado, la diferencia significativa se encontraron niveles de expresión de miRNAs entre 98 Protocolo y muestras normales adyacentes del pene después del ajuste para múltiples pruebas. Mediante la aplicación de un filtrado adicional con un estricto corte de 50 lecturas contar en ambas muestras, se identificaron 56 miRNAs consistieron en 30 (53,6%) miRNAs que fueron regulados a la baja (Tabla 3) y 26 (46,4%) que fueron regulados al alza (Tabla 4) en los pacientes y podría discriminar carcinoma de pene de los tejidos normales emparejados.
entre los cuales, los miRNAs más abundante regulación a la baja en los tejidos del pene cancerosas fueron miR-320a, miR-205-5p, miR 145-5p, miR-423-5p y miR-23b-3p. De los miRNAs upregulated, miR-107, miR-223-3p, miR-340-5p, miR-424-5p y miR-944 fueron los 5 mejores miRNAs expresados de forma más abundante en los tejidos de cáncer de pene, entre los cuales, el miR-107 tenía un nivel de expresión en PEÇA superior a 30.000 lecturas recuento. Mientras tanto, el miR-107 fue también el miARN upregulated significativamente más que el registro (Relación de Cáncer /Normal)
2 fue de 3,83708. En consecuencia, el miR-508-3p era el miARN regulado por disminución más significativa como la expresión de miR-508-3p fue aun no se detectó en PEEC.
miARN expresión alterada en los tejidos del pene cancerosas validado por QRT-PCR
Para validar la expresión de los genes miARN alterado en PEÇA perfilado por smRNA-ss, QRT-PCR se realizó en los tejidos de cáncer de pene y corresponde histológicamente los tejidos normales. En primer lugar, para excluir las posibles diferencias individuales entre las muestras sometidas a la secuenciación, el 10 especímenes emparejados del pene de los pacientes también se mezclaron como una piscina para el ensayo validado. Posteriormente, elegimos al azar 5 upregulated y downregulated miRNAs 5 entre los miRNAs expresados diferencialmente para llevar a cabo el análisis de QRT-PCR y los niveles de expresión se presentan usando el pliegue del cambio normalizada de los tejidos cancerosos frente a tejidos normales. Los resultados revelaron que los niveles de expresión y alterado tendencia expresión de los 10 miRNAs desregulados fueron bastante consistentes con los resultados obtenidos a partir de la tecnología de NGS. De ambas técnicas, el miR-509-3p mostró el mayor factor de cambio de los niveles de expresión regulados negativamente en los tejidos del pene cancerosas, y miR-107 poseía el mayor factor de cambio de los niveles de expresión aumentada en los tejidos del pene cancerosas, que en conjunto indicó que los niveles de expresión de miRNAs detectadas por secuenciación smRNA-ss son fiables (S5 figura). Por otra parte, para validar el patrón de expresión de los genes miARN alterado revelada por los datos de NGS en pacientes individuales, recogimos 4 miRNAs desregulados para llevar a cabo el análisis de QRT-PCR y los niveles de expresión se presentaron utilizando el factor de cambio normalizado de los tejidos cancerosos frente a tejidos normales en cada paciente , respectivamente. De acuerdo con el resultado, se encontró que aunque los efectos basados en la población y las diferencias inherentes inevitablemente surgieron como el informe anterior [33], la tendencia de los patrones de expresión fue consistente con los hallazgos de NGS, como miR-107 y miR-223-3p mostró los niveles de expresión aumentada en los tejidos del pene cancerosas, mientras que miR-1247-5p y miR-509-3p mostraron los niveles de expresión regulados negativamente en los tejidos del pene cancerosas, que a su vez verificados los datos de secuenciación smRNA-seq (Fig S6).
GO enriquecimiento de análisis de los genes expresados diferencialmente en los tejidos del pene cancerosas y normales
las funciones biológicas esenciales de los genes diana putativos se clasificaron a través del sistema de ontología de genes. Puesto que los genes individuales se relacionan con GO términos distintos, se pensaba que los conjuntos de genes que mostraron los patrones de expresión similares desregulados en múltiples tipos de cáncer que son funcionalmente crucial para los procesos tumorigénicos [30]. Con el fin de comprender mejor los comportamientos biológicos de miRNAs conocidos desregulados, los posibles genes diana y funciones biológicas dirigidas por estos miRNAs se predijo mediante el uso de microcosmos, TargetSpy y softwares Miranda [26-29] (S1) de archivos. Después de ajustar el número de genes de cuentas totales anotado por un term≥10 GO específico, enriquecido ratio≥2.0 y FDR valor de p & lt; 0,05 para obtener el resultado más convincente para el análisis de enriquecimiento, los 10 GO términos más enriquecidos que incluyen procesos biológicos, celular componentes y funciones moleculares se presentan en la Tabla 5. entre los cuales, los genes diana putativos de miRNAs desregulados entre las muestras del pene cancerosas y normales parece estar asociado con la mayoría de los componentes celulares enriquecidas consistido en citoesqueletos como de unión adherente (que ancla de unión proteínas transmembrana y facilita el citoesqueleto de la célula de fijación), fibras de estrés (que consiste en filamentos de actina cortos), la unión célula-célula (que cruce que comunica en común conecta las células adyacentes). Mientras tanto, la función molecular más enriquecido entre los 10 términos de GO superior era de unión beta-catenina (que funciona como el comportamiento interactivo con beta-catenina de una manera selectiva y no covalente). Además, estos genes diana putativo estaban estrechamente relacionadas con una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo la regulación del crecimiento (que modula ampliamente el desarrollo del organismo), la regulación de la forma celular (que funciona como el comandante configuración de la superficie celular), axonogenesis (que proceso modula generalmente el axón de la morfogénesis y la determinación de forma), la regulación de la actividad de la proteína quinasa dependiente de ciclina (que procedimiento regula la actividad quinasa de serina /treonina exhaustivamente), la fosforilación peptidil-serina (que proceso media la conversión de peptidil-serina a peptidil-O-fosfo-L-serina) y la regulación de la angiogénesis positivo (el procedimiento que facilita la formación de vasos sanguíneos).
KEGG vía de análisis de los genes expresados diferencialmente en los tejidos del pene cancerosas y normales
Después de GO análisis, el objetivo putativo genes de estos miRNAs expresados diferencialmente en las muestras del pene cancerosas y normales fueron introducidos a KEGG para llevar a cabo un análisis de la vía de enriquecimiento, que finalmente mostró 22 genes diana que fueron anotados por miRNAs expresados diferencialmente, y 5 KEGG vías fueron enriquecidos. Sobre la base de la definición estadísticamente significativa con los valores de p & lt FDR; 0,05, se encontraron las vías más enriquecidos con anotaciones que estar estrechamente vinculado a "la formación del eje dorso-ventral (GRK-EGFR)" (que modula los efectores clave en la formación del eje, como Rho