Extracto
Antecedentes
La proteína Ergp55 pertenece a la familia del factor de transcripción Ets. Los Ets proteínas son altamente conservados en su dominio de unión a ADN y participan en diversos procesos y regulación del metabolismo del cáncer de desarrollo. Para el estudio de la estructura y el mecanismo de unión al ADN de la proteína autoinhibition Ergp55, hemos producido longitud completa y polipéptidos más pequeños de la proteína Ergp55 en
E. coli Opiniones y caracterizados mediante diferentes técnicas biofísicas.
Resultados
Los polipéptidos Ergp55 contienen gran cantidad de estructuras de hélice alfa y espirales según lo medido por espectroscopia dichorism circular. La longitud total Ergp55 forma una molécula flexible y alargado según lo revelado por el modelado molecular, simulación de dinámica y algoritmos de predicción estructurales. Los análisis de unión de polipéptidos Ergp55 con secuencias de ADN diana de E74 y cfos promotores indican que los fragmentos más largos de Ergp55 (más allá del dominio Ets) mostraron la evidencia de auto-inhibición. Este estudio también reveló los componentes de las proteínas que median Ergp55 auto-inhibición.
Importancia
El presente estudio ayudará en el diseño de los compuestos que estabilizan la forma inhibida de Ergp55 e inhiben su unión al promotor DNA. Asimismo, contribuirá en el desarrollo de fármacos dirigidos a Ergp55 para el tratamiento del cáncer de próstata
Visto:. Gangwar SP, Dey S, Saxena AK (2012) modelado estructural y de unión al ADN Análisis de autoinhibición Ergp55, un factor crítico en la transcripción Cancer de prostata. PLoS ONE 7 (6): e39850. doi: 10.1371 /journal.pone.0039850
Editor: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Mayo, 2012; Aceptado: 31-may de 2012; Publicado: 28 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Gangwar et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo recibió el apoyo de subvención del Departamento de Ciencia y Tecnología (DST) Nueva Delhi, India (n-SR /SO /SA-05/2009). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las proteínas de la familia Ets comparten muy conservadas dominio de unión al ADN hélice-giro-hélice alada y se unen al núcleo secuencia de ADN consenso 5'-GGA (a /T) 3 '[1]. Las proteínas de Erg pertenecen a la familia del factor de transcripción Ets. gen ERG se reordena en la leucemia mieloide humana [2] y en el 5-10% de los pacientes con sarcoma de Ewing [3]. En ambos casos, translocaciones cromosómicas resultados en la expresión de proteínas de fusión oncogénicos compuestas de Erg y miembro de Tet subfamilia de proteínas de unión de ARN. proteína Erg es esencial para la hematopoyesis definitiva, la función de células madre hematopoyéticas de adultos y el mantenimiento de los números de periféricos normales de plaquetas [4]. Las transcripciones de oncogenes de fusión TMPRSS2-ERG observados en las células de cáncer de próstata se asocian significativamente con cáncer agresivo, diseminación metastásica y una mayor probabilidad de muerte [5].
El gen codifica Erg cinco proteínas, Erg-1, Erg-2 , Ergp55, Ergp49 y Ergp38 como resultado de diferente corte y empalme, de poliadenilación o codón de iniciación. La isoforma Ergp55 contiene cuatro dominios funcionales, que están implicados en la unión al ADN, la activación de la transcripción y la regulación negativa de la transactivación [6]. Las formas de la proteína Ergp55 dímero consigo misma y con otras dos isoformas Ergp49 y Ergp38, a través de PNT y el dominio Ets [7]. El dominio central de Ergp55 comporta dominio como inhibidor sobre la dimerización y su eliminación mejora la propiedad de transactivación (7). Los restos críticos de Ets dominio de Ergp55, que median Ergp55-jun /fos-ADN formación de complejos ternarios, se han identificado y caracterizado [8].
Hasta el momento, la estructura terciaria de cualquier proteína de longitud completa Ets es no determinado. Sin embargo, las estructuras de los dominios de unión al ADN de varias proteínas Ets se han determinado utilizando cristalografía de rayos X y las técnicas de resonancia magnética nuclear [9] - [16]. El análisis de todo el GONOME de familia Ets-ADN vinculante
in vitro
y
in vivo
ha sido estudiado recientemente [17].
El mecanismo exacto por el cual, Ergp55 proteína actúa sobre la transcripción no se entiende. Para comprender la estructura y el mecanismo de unión a ADN de autoinhibition Ergp55, se realizó dichorism circular, modelización molecular y análisis de predicción estructural teórica sobre polipéptidos Ergp55. Para entender el mecanismo autoinhibition de unión al ADN, los estudios de unión de polipéptidos Ergp55 con secuencias de ADN de E74 y promotores cfos se llevaron a cabo. Nuestros resultados indican que los polipéptidos (i) Ergp55 contiene alto porcentaje de α-hélice y las estructuras helicoidales aleatorias (ii) de longitud completa Ergp55 es una molécula flexible y alargado (iii) los fragmentos más largos más allá del dominio Ets canónica de Ergp55 mostró la evidencia de autoinhibition.
Materiales y Métodos
Construcción de plásmidos Ergp55
La longitud total de Erg
1-479 y Erg
112-399 genes fueron clonados en pET28a (+ ) vectores. El Erg
1-399 y Erg
307 a 399 genes fueron clonados en el vector de expresión pRSETA y pET21a (+). Todos los genes mutantes de deleción se amplificaron a partir de larga duración Erg
1-479 plásmido utilizando la reacción en cadena de la polimerasa.
(A) Se muestra aquí la secuencias de aminoácidos de longitud completa Ergp55 sin la etiqueta 6xHis y sitio de escisión. Los residuos se pusieron de relieve de acuerdo con el tamaño de los dominios Ergp55, defectos del tubo neural (amarillo), PNT (verde), CAE /CD (azul /cian), Ets (rojo) y CTD (negro). (B) Se muestra aquí las construcciones Ergp55 utilizadas en los experimentos (esquema de colores mismas como en la Fig. 1A). Los residuos marcados que define la secuencia de inicio y final de las construcciones.
Aestericks
denotan la posición de la etiqueta 6xHis en diversas construcciones Ergp55.
Purificación de polipéptidos Ergp55
El Erg
1-479, Erg
1-399, Erg
112-399 y Erg
307-399 plásmidos se transformaron en
e. coli
. BL21 (DE3) células. Las células se cultivaron en 3 litros de Luria Bertani que contiene los medios de comunicación antibióticos apropiados a 37 ° C, hasta que OD
600 alcanzó a 0,6. El mM IPTG 0.125 fue inducida a 37 ° C y la cultura shaked aún más durante 4 horas a 220 rpm. Las células se recogieron por centrifugación a 6000x
g
de 10 ° min a 4 ° C. Las células se suspendieron en 50 ml de tampón de lisis que contiene (Tris-HCl 25 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, 1 mM de benzamidina-HCl, 0,1% de Triton X-100, 5% de glicerol, 3 mM 2-mercaptoetanol, de fenilmetilsulfonilo 1 mM fluoruro y 0,5 mg /ml de lisozima) y se rompieron por sonicación a 4 ° C. El lisado crudo se centrifuga a 25000 ×
g
durante 20 min a 4 ° C. El sobrenadante se cargó en una columna de Ni-NTA, pre-equilibrada con tampón de unión (Tris-HCl 25 pH 8,0, NaCl 300 mM, 1 mM de benzamidina-HCl, 5% de glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanol, 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo y imidazol 10 mM). Las proteínas se eluyeron de la columna con tampón de elución (Tris-HCl 25 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, 1 mM de benzamidina-HCl, 5% de glicerol, 3 mM 2-mercaptoetanol, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM e imidazol 250 mM). Las fracciones eluidas se reunieron, se concentraron y se cargaron en una columna HR de filtración en gel Sephacryl S-200 pre-equilibrada en tampón (Tris-HCl 25 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, 3 mM 2-mercaptoetanol y 5% de glicerol). Las proteínas purificadas se concentraron a 10 mg ml utilizando Amicon dispositivo de filtro /de ultra centrífuga (corte de PM 10 kDa). La concentración de proteínas se midió por la radiación UV a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado con el software EXPASY (http://us.expasy.org/tools/protparam.html).
El cromatograma de (A) completa Erg longitud
1-479 (B) Erg
1-399 (C) Erg
112-399 y (D) se muestran Erg
307-399 polipéptidos. El análisis SDS-PAGE y el peso molecular calculado de cada proteína se indican en cada cromatograma.
secuenciación de la proteína N-terminal y de pulverización iónica de espectrometría de masas confirmó la identidad y pureza de los polipéptidos Ergp55. La concentración de proteína se determinó usando la absorbancia a 280 nm. Azul de Coomassie brillante manchado análisis SDS-PAGE indicó que todos los polipéptidos se purificaron Ergp55% de pureza mayor que 95. Todas las proteínas se almacenaron a -20 ° C.
Se realizaron experimentos de resonancia de plasmones de superficie
estudios
biosensores usando BIAcore (Pharmacia Biosensor Biacore AB, Uppsala Suecia) Equipo de 2000 [18]. Todos los experimentos se realizaron a 25 ° C en HBS-tampón que contenía [10 mM HEPES pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 50 mM, 0,005% P20 como agente tensioactivo). Dado que todos los polipéptidos Ergp55 contienen la etiqueta 6xHis ya sea en N- o C-terminal, el chip sensor que contiene alta densidad de inmovilizado Ni-NTA es una etiqueta ideal para inmovilizar estas proteínas. Inicialmente, las células de flujo del chip se activaron mediante el paso de solución de cloruro de níquel sobre él. 40 ul de cada polipéptido Ergp55
por ejemplo
., Erg
1-479 (0,14 ug /ul), Erg
1-399 (0,19 ug /ul), Erg
112-399 (0,92 ug /ul) y Erg
307-399 (0,17 ug /ul) se inyectaron en diferentes celdas de flujo de chip de Ni-NTA a un caudal de 10 ul /min.
en las figuras (a ) Erg
1-479 (B) Erg
1-399 (C) Erg
112-399 y (D) Erg
307-399 polipéptidos fueron inmovilizadas en el chip de Ni-NTA. Tres concentraciones (1, 2, 3 M) de la secuencia de ADN del promotor E74 inyecta en cada polipéptido Ergp55 inmovilizado.
En diferentes células de flujo de chip de Ni-NTA, a raíz de la unidad UR de cada polipéptido se Ergp55 inmovilizada
por ejemplo
., Erg
1-479 (2904 RU), Erg
1-399 (2848 RU), Erg
112-399 (2825 RU) y Erg
307-399 (247 RU), donde 1 RU corresponde a la proteína inmovilizada de la concentración de aproximadamente 1 pg /mm. Los experimentos de unión se realizaron con tres concentraciones diferentes [1, 2, 3 M) de secuencia de ADN del promotor E74 (5 'TACCGGAAGT 3') en HBS-buffer y se inyectaron sobre polipéptidos Ergp55 inmovilizados a un caudal de 10 l /min. experimento similar se realizó con la secuencia de ADN de la secuencia de promotor cfos (5 'GACAGGATGTG 3'). El Sensograma dejó funcionar durante otros 4 minutos. La regeneración de la superficie del biosensor se realizó utilizando 30 s pulso de NaOH 1 mM a un caudal de 10 l /min. Asociados y disociación constantes cinéticas se calcularon mediante software BIAeveluation 3,0 usando modelo simple de Langmuir 01:01 con la suposición, que la densidad de polipéptidos Ergp55 en el chip sensor no fuera lo suficientemente alta como para apoyar de unión a ADN bivalente.
En cifras ( a) Erg
1-479 (B) Erg
1-399 (C) Erg
112-399 y (D) Erg
307-399 polipéptidos se inmovilizan en el chip de Ni-NTA. Tres concentraciones diferentes (1, 2, 3 M) de la secuencia de ADN del promotor cfos inyectada en cada polipéptido Ergp55 inmovilizado.
dichorism circular
mediciones de CD se registraron utilizando Chirascan
TM CD espectropolarímetro (Applied Fotofísica) con un baño de agua para mantener la temperatura constante. Los polipéptidos Ergp55 se diluyeron a 0,2 mg /ml en tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 8,0 y se cargó en 0,1 cm cubeta de cuarzo. La pieza en bruto de todos los experimentos fue tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 8,0. El espectro final fue de un promedio de tres exploración secuencial
.
(A) los espectros de CD de Erg
1-479, Erg
1-399, Erg
112-399 y Erg
307-399 polipéptidos registraron a partir de 200 nm a 260 nm. (B) Temperatura inducida despliegue de la proteína de longitud completa Ergp55. La trama (interior) que contiene elipticidad residual media en función de la temperatura indica la desnaturalización de alfa-hélices de longitud completa plegada Ergp55.
Para el estudio de la desnaturalización térmica de larga duración Ergp55, los espectros de CD se registraron a los 10 ° C incremento a partir de 10 ° C a 90 ° C. Antes de la medición, la cubeta de muestra se equilibró a cada temperatura. Las lecturas de temperatura se tomaron dentro del soporte de cubetas de acuerdo con la temperatura del baño de agua. Todos los datos de CD se convirtieron en el sentido de elipticidad de residuos (deg. Cm
2 /dmol). El servidor Dichroweb [19] se utilizó para estimar la cantidad de estructura secundaria en polipéptidos Ergp55 partir de los espectros de CD.
La estructura secundaria de predicción
El SOPMA [20], GOR [21] y PSIPRED [ ,,,0],22] algoritmos fueron utilizados para predecir el contenido de estructura secundaria de longitud completa Ergp55, que mostró ~21% α-hélice, 12-15% β-lámina y las estructuras de bobina al azar 65 a 69%.
(a) el análisis del programa PSIPRED de longitud completa Ergp55. (B) Modelo estructural de larga duración Ergp55 tras el análisis molecular modelado y simulación de dinámica mediante el programa GROMACS (C) La predicción desordenada hecha por DISOPRED para (a), defectos del tubo neural (b), PNT (c), CAE /CD (d), ETS y (e), las regiones de CTD Ergp55.
Modelado de polipéptidos Ergp55
servidor Phyre [23] se utilizó para obtener la estructura de la proteína Ergp55 longitud completa (1-479 residuos). El servidor produjo la estructura de dominio PNT (95-221 residuos) de Ergp55 usando la plantilla AP-2YTU (estructura de la solución de la SAM-PNT dominio del amigo humano integración leucemia factor-1 de factor de transcripción, aún no publicado). La estructura de la solución de RMN del dominio PNT (108-201 residuos) se obtuvo a partir del banco de datos de proteínas (PDB-1SVO) [24]. El servidor Phyre también produjo la estructura de Ets dominio (284-412 residuos) de Ergp55 usando la plantilla AP-2NNY (Reglamento del factor de transcripción Ets-1 por el ADN homodimerización mediada) [13]. La estructura de RMN de Ets dominio de Fli1 (306-403 residuos) se obtuvo a partir del banco de datos de proteínas (PDB-1FliA) [25]. El modelado estructural del N-terminal (1-94 residuos), dominio central (222-283 residuos) y C-terminal (residuos 413-479) de Ergp55 no se intentó debido a la falta de modelo de entrada.
el Modelador [26] y LOMETS roscar [27] se utilizaron programas para construir la estructura de longitud completa usando Ergp55 siguientes entradas (i) modelo estructural de PNT dominio (95-221 residuos) de Ergp55 (ii) el modelo estructural del dominio Ets ( 284-412 residuos) de Ergp55 (iii) la estructura de RMN de PNT dominio (108-201 residuos) de Ergp55 y (iv) la estructura de RMN de Ets dominio (306-403 residuos) de Fli1. minimización de energía se realizó en Ergp55 modelada usando el programa Gromacs versión 4.0.5 [28]. 100 pasos de más empinada decente y 500 pasos de algoritmos de gradiente conjugado se utilizaron en el cálculo de la reducción al mínimo de energía.
Simulaciones de dinámica molecular
La dinámica molecular (MD) 10 ns de simulación se realizó en el modelo Ergp55 reducido al mínimo el uso de GROMACS programa (versión 4.0.5) con el campo de fuerza Gromacs43a2 [28]. El modelo Ergp55 se sumergió en una caja cúbica que se extiende 0,5 nm desde la superficie de la proteína y solvatados con las moléculas de agua SPC explícitas. se añadieron los iones de cloruro y de sodio para neutralizar los sistemas, que a continuación, se simularon las condiciones de contorno periódicas. El modelo consiste en Ergp55 solvatado 4832 átomos de la proteína rodeadas de ~390, 000 moléculas de agua. Antes de ejecutar la simulación, el sistema entero fue la energía minimizada por 200 iteraciones de los descensos más pronunciados y luego se equilibró durante 20 ps átomos de la proteína de mantenimiento refrenado. Todos los sistemas se retiraron de la proteína y la temperatura se aumentó gradualmente en 10 pasos distintos de 5 ps simulaciones cada uno.
Acoplamiento
Berendsen fue empleado para mantener una temperatura constante de 300 K con una constante de acoplamiento τ de 0,1 ps. Van der Waals se modelaron usando 6-12 potencial de Lennard-Jones con el corte de 1 nm. El culombio de corte fue de 1,0. El paso de tiempo empleado fue de 2 fs y las coordenadas se guarda cada 5 ps para el análisis de las trayectorias de MD.
La estereoquímica del modelo simulado Ergp55 se comprobó mediante el programa PROCHECK de la suite CCP4 [29]. composición de la estructura secundaria se midió por el programa DSSP [30] y la estructura de visualización por el programa PyMOL [31].
Resultados
Purificación de polipéptidos recombinantes Ergp55
Hemos producido longitud completa y polipéptidos más pequeños (que contiene subconjunto de dominios predichos) de Ergp55 en
E. coli
y se purificó usando técnicas cromatográficas estándar (Fig. 1A-B). Durante la cromatografía de exclusión por tamaño, el Erg purificada
1-479, Erg
1-399, Erg
112-399 y Erg
307-399 polipéptidos eluyó a los volúmenes correspondientes a sus pesos moleculares (fig. 2A-D). La longitud total de Erg
1-479 eluye en el tamaño de 53,8 kD, Erg
1-399 polipéptido eluyó a 51,1 kD, Erg
112-399 eluyó a 44,9 kD y Erg
112-399 eluyó a 15,1 kD. El Erg
1-479 y Erg
1-399 polipéptidos tienen tendencia a degradarse si se mantiene durante 7 días a 4 ° C. El Erg
112-399 y Erg
307-399 polipéptidos no se degrada con el tiempo y más estable que Erg
1-479 y Erg polipéptidos
1-399.
DNA Los estudios de unión utilizando E74 y cfos secuencias promotoras
La funcionalidad de polipéptidos Ergp55 purificadas se evaluó por medio de experimentos de unión a ADN utilizando la técnica de resonancia de plasmones superficiales. El observado
K
D
valor de polipéptidos Ergp55 con la secuencia de ADN del promotor E74 fueron
por ejemplo
., Erg
1 a 479 ~ 704 nM, Erg
1- 399 ~ 217 nM, Erg
112 a 399 ~ 115 nM y Erg
307-399 ~ 65 nM (Fig. 3A-D). Estos resultados indicaron que Ets dominio de Ergp55 (Erg
307-399) tiene la mayor afinidad por la secuencia de ADN promotora E74. La afinidad de unión de ADN disminuye ~ 2 veces para Erg
112-399 polipéptido, ~ 3 veces por Erg
1-399 polipéptido y ~ 10 veces de larga duración Erg
1 a 479, en comparación con el Erg
307-399 polipéptido (Ets dominio). Estos resultados indican que la N- así como C- terminal de dominios con respecto a dominio Ets están involucrados en auto-inhibición de la unión del ADN a la proteína Ergp55.
El observado
K
D
valor de polipéptidos Ergp55 con cfos secuencia de promotor fuera
por ejemplo
., Erg
1-479 ~ 232 m, Erg
1-399 ~ 196 m, Erg
112-399 ~ 38 M y Erg
307-399 ~ 0,45 M (Fig. 4A-D). Estos resultados también indican que Ets dominio tiene la mayor afinidad por secuencias de ADN de cfos promotor. Ambos dominios N- y C-terminales con respecto al dominio Ets están involucrados en la inhibición de los responsables financieros de ADN que se unen a proteínas Ergp55.
mediciones de CD de polipéptidos Ergp55
para identificar el contenido de estructura secundaria en Ergp55 polipéptidos, se utilizó la espectroscopía de CD UV lejano (Fig. 5A). Los datos de CD se des-convoluida usando el servidor web DICHROWEB [19] y el porcentaje de α-hélice, β-lámina y estructuras helicoidales aleatorias fueron estimados. Los espectros de CD de larga duración Erg
1-479 (Fig. 5A) mostró dos mínimos en torno a 208 nm y 222 nm, una característica de la estructura α-helicoidal. Deconvolución de los datos predice ~ 35% α-hélice, el 15% β-hoja y estructuras helicoidales al azar 49% en toda su longitud Ergp55. Los datos de CD de Erg
1-399 polipéptido predice estructuras helicoidales al azar ~ 25% α-hélice, el 17% β-hoja y el 57%, lo que muestra menos α-hélice y la estructura β-hoja en comparación con la longitud completa de Erg
1-479 estructura.
En caso de Erg
112-399 polipéptido, los datos de CD estima ~29% α-hélice, el 15% β-lámina y estructuras helicoidales al azar 55%. Este polipéptido contiene menos α-hélice, estructura de β-hoja similar en comparación con la longitud completa de Erg
1-479. Para Erg
307-399 polipéptido, los datos de CD estima ~31% α-hélice, el 10% β-lámina y estructuras helicoidales al azar 59%, que tiene menos α-hélice y la estructura β-hoja en comparación con la longitud completa de Erg
1-479 estructura. Sin embargo, estos valores están cerca de contenido de estructura secundaria en la estructura cristalina de Ets dominio de FLI-1 (35,7% α-hélice, 4,1% β-hoja, 60,2% espiral aleatoria). El dominio Ets de FLI-1 es el homólogo más cercano a Ets dominio de Ergp55 [32].
termoestabilidad de longitud completa Ergp55
Para evaluar la estabilidad térmica de larga duración Ergp55, una medida de la radiación UV espectro de CD de la proteína se midió de 10 a 90 ° C (Fig. 5B). Está claro a partir de espectros que la estructura secundaria de Ergp55 desnaturaliza como la temperatura aumenta. Cuando elipticidad residual media a 222 nm se representa frente a la temperatura, el punto de la curva sigmoidal de inflexión indica la T
m de 45 ± 2 ° C de longitud completa Ergp55.
Modelización molecular y simulación dinámica de longitud completa Ergp55
La predicción de la estructura secundaria de la longitud completa Ergp55 usando el programa PSIPRED se muestra en la (Fig. 6A). Los programas Modeler y enhebrado automático LOMETS se utilizaron para construir longitud completa modelo Ergp55 usando (i) la estructura de 95-221 residuos de Ergp55 usando la plantilla AP-2YTU (no publicado) que tiene 57% de identidad de secuencia de (ii) la estructura de 284- 412 residuos de Ergp55 usando plantilla AP-2NNY [13] que tiene 40% de identidad de secuencia y (iii) la estructura de RMN de 108-201 residuos de Ergp55 y (iv) la estructura de RMN de 306-403 residuos de Ets dominio de FLI-1, que tiene 90 % de identidad de secuencia. minimización de energía y análisis de dinámica de simulaciones se realizaron en construido modelo Ergp55, que produjo una estructura flexible y alargado (Fig. 6B). La estructura Ergp55 se mantuvo muy estable durante todo el tiempo de simulación, como lo confirman todos los indicadores comúnmente utilizados para analizar la simulación MD.
Los 93% de residuos de Egp55 mentira modelo en la región más favorecida del gráfico de Ramachandran y una prosa Z- puntuación de -4,87. DISOPRED [33] El análisis del modelo de Ergp55 indicó que el N-terminal (residuos 1-118) y C-terminal (residuos 397-479) son en gran parte desordenada (excepto N-terminal 4-23 residuos) y la estructura Ergp55 restante (119-396 residuos) fueron ordenados (Fig. 6C). El dominio PNT estructurado contiene disposición terciaria de cuatro alfa-hélices, característica de gran grupo de SAM de dominio [34]. El dominio Ets consta de cuatro alfa-hélices y fourβ técnica, una característica de las proteínas de la familia Ets. En N-terminal de dominio, 15 tramo residuo predicho para formar α-hélice y 3 residuos de hélice larga (219-221 residuos) se observan en de CAE dominio /CD de Ergp55. Los tramos de los residuos en el dominio C-terminal de Ergp55 predice que tienen estructura de bobina única aleatorio.
El terminal N- y dominio C-terminal de Ergp55 están posicionados lejos de dominio Ets. El surco de unión al ADN de dominio Ets está expuesto al solvente y libre de unirse a secuencias de ADN promotor. El dominio CAE /CD está colocado entre PNT y dominio Ets para regular la actividad de Ergp55. Los dominios N-terminal y C-terminal de Ergp55 se colocan en una región que no impiden la actividad de unión al ADN de dominio Ets y desempeñar un papel en la activación transcripcional y localización de Ergp55.
Discusión
en el estudio actual, se han expresado de cuerpo entero y polipéptidos más pequeños de Ergp55 en
e. coli
. Las combinaciones de dos etapas de cromatografía (Ni-NTA de afinidad y cromatografía de exclusión de tamaño) han dado polipéptidos Ergp55 puros más de 95% basado en la espectrometría de masas y análisis de SDS-PAGE. Antes de los estudios estructurales, la actividad de polipéptidos Ergp55 purificados se verifica por los estudios que utilizan secuencias de ADN de E74 y CFO promotores de unión. La técnica de resonancia de plasmón superficial se utiliza para el análisis de unión. Estos resultados indican que los polipéptidos producidos en Ergp55
E. coli
eran de buena conformación y se unen específicamente a secuencias de ADN de E74 y directores financieros promotores con diferentes afinidades.
autoinhibition de Ergp55 de unión al ADN.
En el caso de E74 secuencia promotora, después de
K
D se observaron valores para
Ergp55 polipéptidos (i) Erg
307-399, 65 nM (ii) Erg
112 a 399, 115 nM (iii) erg
1 a 399, 217 nM y (iv) de longitud completa erg
1 a 479, 704 nM. La comparación de (i) y (ii) indicó que la región N-terminal (dominios PNT + CAE /CD) que precede al dominio Ets inhiben la ADN E74 de unión al dominio Ets. La comparación de (ii) y (iii) mostró la evidencia de aumento de la inhibición de unión a ADN por tener dominio NTD en Erg
1-399 polipéptido. La comparación de (iii) y (iv) indican que la adición de dominio CTD en Erg
polipéptido 1-399 mostraron una mayor inhibición en la unión al ADN al dominio Ets. Estos resultados indican que el ADN E74 unión a Ergp55 está influenciada negativamente por CAE /CD, PNT y dominios NTD situado en N-terminal y C-terminal de dominio ubicado en Ergp55 CTD.
Con la secuencia de ADN del promotor cfos, siguiendo
K
D
valores se obtuvieron para Ergp55 polipéptidos (i) Erg
307-399, 0,4 M (ii) Erg
112 a 399, 37 mM (iii) Erg
1-399, 196 M y (iv) de longitud completa Erg
1 a 479, 232 mM. Estos resultados indican que se unen secuencia cfos promotor con diferente afinidad a polipéptidos que Ergp55 secuencia promotora E74, sin embargo mecanismo de inhibición de unión a ADN fue similar como se observó en el caso de la secuencia de ADN promotora E74
.
A DNA cooperativamente actuando región inhibición ( 468-510 residuos) fue identificado en el C-terminal de Ets-1 factor de transcripción [34]. En caso de ERM y transcripción PEA3 factores, dos principales dominios situados en N- y C-terminal con respecto a su dominio ETS-inhibición de ADN afinidad de unión [35] - [38]. Un dominio corresponde al residuo 280-360 residuos de factor de transcripción ERM, que participan en la inhibición de la ADN ERM capacidad de unión. Estos dominios son ricos en residuos de prolina en general estructuras alfa-helicoidal carentes. El mecanismo por el cual dos dominios cooperativamente inhiben ADN ERM de unión es diferente a la observada en el caso de Ets-1 factor de transcripción. La actividad de unión al ADN de Ets dominio depende de módulo autoinhibitory [39]. La afinidad de unión del dominio Ets Ergp55 a E74 y cfos promotor de ADN fue consistente con la observación obtenida en el caso de los factores de transcripción anteriores.
Análisis dichorism circular de polipéptidos Ergp55.
La técnica dichorism circular era utilizado para identificar las estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos Ergp55. La longitud total y polipéptidos Ergp55 más pequeños contienen alta α-helicoidal y estructuras helicoidales aleatorias. Los datos de CD estima un 35% de α-hélice y estructuras helicoidales al azar 49% en proteínas Ergp55 longitud completa. Los exámenes de estabilidad térmica y efecto de la temperatura sobre la proteína de longitud completa Ergp55 indicaron que la proteína se sometió a una alteración de la estructura secundaria por calentamiento. La estructura secundaria se recuperó después de enfriar la proteína a partir de 80 ° C a 20 ° C. el cambio por debajo de la temperatura es poco probable que tenga algún efecto sobre la estructura secundaria de la proteína Ergp55.
Modelado y simulación de la dinámica de longitud completa Ergp55.
El análisis de modelado y simulación de dinámica molecular indicó que la longitud total Ergp55 adquiere una estructura flexible y altamente alargada. Solamente los dominios PNT y Ets se estructuran en proteínas y se observan largas regiones flexibles en N- y C-terminal de Ergp55. La estructura de dominio de PNT Ergp55 consta de cuatro hélices haz Sam como la estructura (34). El dominio Ets de Ergp55 se estructura en hélice-giro-hélice alada con α esquema
1β
1β
2α
2α
3β
3β
4α
4 [40] - [41]. Los dominios /CD centrales CAE contienen una pequeña hélice en la posición 220. El análisis de predicción secundaria y desordenado en Ergp55 también apoyó el hallazgo observado en estudios de modelado y simulación dinámica de Ergp55. Todas estas observaciones apoyan la flexible, no globularity y estructura muy alargada de la proteína Ergp55.
En conclusión, se ha caracterizado el recombinante de longitud completa y polipéptidos más pequeños de Ergp55 producido en
E. coli
. Los polipéptidos se purificaron Ergp55 mayor que 95% de pureza como se determina por espectrometría de masas y análisis de SDS-PAGE. Los datos estructurales presentadas aquí mostraron la evidencia de la estructura flexible y altamente alargada de proteína Ergp55 longitud completa. El análisis de unión usando secuencias de ADN de E74 y cfos promotores indican que los fragmentos más largos de Ergp55 (más allá del dominio Ets canónica) mostraron la evidencia de autoinhibition.
Reconocimientos
Los autores agradecen a Sita R. Meena Pratibha y por sus sugerencias en el proyecto actual. Reconocemos la ayuda de la instalación de instrumentación avanzada de investigación (AIRF) y la instalación de la instrumentación central (CIF) de la Universidad Jawaharlal Nehru de lo que nos permite realizar el experimento de CD. Los autores agradecen a las instalaciones de equipos SPR AIIMS, Nueva Delhi para que nos permite manejar los experimentos de unión al ADN.