modificación
Extracto
histona desempeña un papel fundamental en la regulación de genes, como se considera como marcadores epigenéticos globales, especialmente en genes relacionados con el tumor. Por lo tanto, los enfoques químicos destinados a enzimas modificadoras de histonas han surgido en el escenario principal del descubrimiento de fármacos contra el cáncer. Aquí, hemos investigado los potenciales terapéuticos y las funciones mecánicas del inhibidor de la histona deacetilasa recientemente desarrollado, CG200745, en células de cáncer de pulmón de células no pequeñas. El tratamiento con CG200745 aumentó el nivel global de la acetilación de histonas, lo que resulta en la inhibición de la proliferación celular. análisis chip-on-chip con un anticuerpo H4K16ac mostró alterada acetilación H4K16 en genes críticos para la inhibición del crecimiento celular, aunque la disminución en el sitio de inicio de la transcripción de un subconjunto de genes. H4K16ac alterada se asocia con cambios en la expresión de mRNA de los genes correspondientes, los cuales fueron validados en ensayos de RT-PCR y Western Blot cuantitativos. Nuestros resultados demuestran que CG200745 provoca la inhibición del crecimiento de células de NSCLC mediante la modificación epigenética de genes críticos en la supervivencia de las células cancerosas, proporcionando pistas cruciales como agentes quimioterapéuticos prometedores contra cáncer de pulmón
Visto:. Chun SM, Lee JY, Choi J, Lee JH, Hwang JJ, Kim CS, et al. (2015) La modulación epigenética con inhibidor de HDAC CG200745 induce la prevención de la proliferación de células no pequeñas células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (3): e0119379. doi: 10.1371 /journal.pone.0119379
Editor Académico: Wei-Guo Zhu, la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud, CHINA
Recibido: 22 Agosto, 2014; Aceptado 30 de enero de 2015; Publicado: 17 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Chun et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. donaciones compatibles para el estudio fueron la tecnología de la salud R Korean & amp; D Proyecto, Ministerio de Salud & amp; El bienestar, la República de Corea (HI06C0868, HI10C2014), líder de investigación extranjeros Programa del Instituto de Reclutamiento, Fondo de Fomento de la Investigación Básica y el Programa Básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (MEST ) (2011-0030105, KRF-2008-355-E00006, NRF-2014R1A1A2006192). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las modificaciones epigenéticas como la metilación CpG ADN o la acetilación de histonas son considerados como un paso importante en el desarrollo del cáncer y por lo tanto se han estudiado para descubrir biomarcadores del cáncer y Stratege terapéutica [1-3]. Una vez que la metilación de citosina se produce en dinucleótidos CpG mediante la acción de metil transferasa de ADN (DNMT), la citosina de metilo se mantiene a la siguiente generación debido a la falta de un ADN-de metil transferasa en mamíferos. La modificación de las histonas irreversible se ha utilizado también como un biomarcador para el diagnóstico o pronóstico de cáncer temprano, así como un objetivo eficaz en la terapéutica del cáncer [4,5]. La acetilación o metilación en residuos de lisina de H3 y H4 amino colas terminales son modificaciones de las histonas dominantes, y cada uno es responsable de la expresión de genes unidos. Por ejemplo, metilaciones en lisina 4 de H3 y lisina 27 de H3 se conocen como activador de la transcripción y la represión de eventos para genes unido histonas, respectivamente. acetilación de la histona en la lisina 16 de H4 está relacionada con la activación transcripcional y /o iniciación de la replicación de los genes correspondientes. En las células normales, la acetilación de la histona está controlada con precisión por la histona acetil transferasa (HAT) y la histona desacetilasa (HDAC). Hyper-acetilación de oncogenes o hipo-acetilación de genes supresores de tumores, sin embargo, se observa con frecuencia en varios tipos de cáncer. inhibidores de HDAC (HDACi) son los más desarrollados fármacos contra el cáncer dirigidas a la modulación epigenética y se aplican para el tratamiento de varios tipos de cáncer, en particular en tumores sólidos, como el de mama, colon, pulmón, y cáncer de ovario, así como en tumores hematológicos , tales como linfoma, leucemia, y mieloma [6-9]. Además, la desregulación epigenética en cáncer de pulmón está a menudo relacionada con la sobreexpresión de HDAC1 y la metilación aberrante de ciertos genes, resultando en la eficacia terapéutica de la terapia epigenética combinación de orientación metilación del ADN y la desacetilación de histonas. HDAC comprenden tres clases: Clase I, HDAC 1, 2, 3 y 8; Clase II, HDAC 4, 5, 6, 7, 9, y 10; y Clase III, 11 (HDAC sirtuinas 1-7) [10,11]. HDACi, tricostatina A (TSA) [12,13] o vorinostat (SAHA) [14-16] inhibir la clase I y II de las enzimas de HDAC, lo que resulta en la detención del crecimiento, la apoptosis, la diferenciación, y anti-angiogénesis de las células de cáncer, cuando se utiliza de forma independiente o en combinación con otros agentes anti-cáncer. Mecánicamente, la restauración de genes supresores de tumores silenciados o supresión de oncogenes activados en células de cáncer juega un papel crítico en los efectos anti-cáncer de las drogas. Esto es seguido por la inducción de la detención del ciclo celular en la fase G1 a través de la expresión de proteínas p21 y p27, o un retraso M G2 /transición a través de la regulación a la baja de la transcripción de la ciclina B1, Plk1, y survivina.
HDAC inhibidor CG200745, (E) -N (1) - (3- (dimetilamino) propil) -N (8) hidroxi-2 - ((naftaleno-1-Loxy) metil) oct-2-enediamide, se ha desarrollado recientemente y actualmente sometido a un ensayo clínico de fase. Su efecto inhibidor sobre el crecimiento celular se ha demostrado en varios tipos de células de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata, carcinoma de células renales, y células RKO (células de carcinoma de colon) en mono- y combinacional-terapia con otros medicamentos contra el cáncer [17-19]. El mecanismo subyacente a la inhibición del crecimiento celular de CG200745 en células RKO se ha demostrado que se producen de una manera dependiente de p53 [19]. Es importante destacar que, CG200745 aumenta la acetilación de p53 en los residuos de lisina K320, K373, y K382. CG200745 también indujo la acumulación de p53, promueve la transactivación dependiente de p53, y aumentó la expresión de proteínas codificadas por genes diana de p53,
MDM2
y
p21
(Waf1 /Cip1) en el cáncer de próstata humano Células. En el estudio actual, se evaluaron los efectos antitumorales y exploramos los objetivos directos de una CG200745 de células no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) para verificar indicación de cáncer adicional. Se analizó la proliferación celular y la alteración patrón de expresión génica a través de la desacetilación de histonas chip de ensayo en chip, en tiempo real cuantificación PCR y Western Blot. Nuestros resultados sugieren que el inhibidor de HDAC CG200745 provoca la reactivación epigenética de los genes críticos que son suprimidos transcripcionalmente en los cánceres, y por lo tanto puede ser un prometedor cáncer de NSCLC terapéutico.
Materiales y Métodos
Productos químicos y líneas celulares
Los inhibidores de HDAC (HDACI), hydroamic suberoilanilida (vorinostat, SAHA) y CG200745, fueron proporcionados por Crystal Co. Genómica (Seúl, Rep. de Corea). Estos compuestos se disolvieron en DMSO y se almacenaron a -20 ° C hasta su uso. líneas humanas de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y una línea de células bronquiales normales inmortalizada de células epiteliales (BEAS-2B) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Todas las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal, penicilina 100 U /ml, y 100μg /ml de estreptomicina con 5% de CO
2 a 37 ° C.
transferencia Western
50? g de extractos de células enteras se realizaron en geles de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon y se incubaron con anticuerpos primarios específicos contra H4K16ac, CCND1, p21, y la caspasa 3 (Cell Signaling, Beverly, MA), anti-H4S1 /K5 /K8 /K12Ac de Santa Cruz (Santa Cruz, CA) y β- actina de Sigma (St. Louis, MO). Después de la incubación con rábano picante apropiada anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa, se detectaron bandas usando el reactivo ECL (Amersham-GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA).
-PCR cuantitativa en tiempo real
preparación de ARN total y la síntesis de ADNc se realizó utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), y el superíndice III primer capítulo de síntesis Supermix (Invitrogen). Cuantitativa en tiempo real PCR se llevó a cabo utilizando la energía SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Grand Island, NY) en IQ5 multicolor sistema de detección en tiempo real (Bio-Rad) con cada uno de adelante y cartilla para
CCNA2
,
CCNB1
,
CCND1
,
CCNE2
,
CDK2
,
Bax-a
,
bcl 2
,
p16
,
p21
,
p27
, y
MXI1 gratis (Bionics, Seúl, Corea) (Tabla S1).
ensayo de citotoxicidad
El IC
50 de cada HDACi en las células de cáncer de pulmón se determinó mediante ensayo de proliferación celular utilizando CellTiter 96 AQ
ueous Una solución reactiva (Promega, Madison, WI) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de diferente período de incubación tiempo con HDACIs, se mide entonces la absorbancia a 490 nm en el Wallac 1420 Victor3 con software WorkOut 2.
FACS ensayo
El efecto de CG200745 en el ciclo celular se analizó NSCLC en citometría de flujo utilizando tinción con yoduro de propidio (PI). Después de la incubación con CG200745 o DMSO, las células se fijaron con etanol helado al 70% a 4 ° C durante la noche. El ADN genómico se tiñó con 30μg /ml PI y la fluorescencia se midió con una máquina de FACS Calibur (Becton-Dickinson, Mountain View, CA). La fluorescencia roja debido a ADN manchado-PI se recogió a 560 nm espejo dicroico y un filtro de paso de 600 nm (ancho de banda, 35 micras). Un total de 10.000 células se recogieron mediante FACS y se analizaron utilizando el teléfono Quest software 3.1 (Becton Dickinson).
inmunoprecipitación de cromatina (CHIP)
Los ensayos de chip se realizaron según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, las células tratadas con 3μM CG200745 o DMSO durante 24 h se precipitaron con un anticuerpo anti-acetil-H4K16 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). Después de la reticulación con formaldehído al 1%, la cromatina se fragmenta en 300 ~ 800 pb tamaño por sonicación en Bioruptor, UCD-200 (Diagenode, Denville. NJ). complejos de la cromatina /proteínas se precipitaron con una histona modificada anticuerpo y proteína específica A /G más perlas de agarosa inmovilizados. Después de la elución de las perlas, precipitados de ADN-proteínas fueron inversa reticulado, y el ADN se purificó con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Valencia, CA):
experimentos de microarrays de los productos de fichas:. Experimentos chip-on-chip
chip de ensayo en chip se realizó en un microarray de ADN de Agilent 244K × 2 como las instrucciones del fabricante (Agilent mamíferos chip-on-chip v.10 Protocolo). En pocas palabras, el control de entrada para los extractos de células enteras y los productos de chips purificados fueron amplificados por PCR de ligación mediada por el uso de un enlazador oligonucleótido artificial, después de hacer romos los extremos de ADN utilizando ADN polimerasa de T4. A continuación, los productos de entrada y el chip amplificados fueron marcadas con fluorescencia Sistema BioPrime total genómico de etiquetado (Invitrogen). La misma cantidad de ADN de entrada y el producto chip con diferentes colorantes fluorescentes se mezclaron con humano Cot-1 DNA (1 mg /ml), y se hibridó en un Agilent 488K promotor array (dos 244K arrays), que contiene ~ 17000 de los transcritos humanos definidos que abarca desde -5.5 kb a +2,5 kb del sitio de inicio de transcripción (TSS). imágenes hibridadas se visualizaron con el escáner de microarrays (Revolución de 4200;. Vidar Sistemas Cor, Herndon, VA)
Análisis de datos y el análisis de ontología
Histon acetilación de productos de chips y de entrada se analizó con el. módulo de chip de ADN de los Analíticos (Agilent, versión 4.0.81) con la normalización de Tukey biweight, modelo de error Whitehead y Whitehead modelo Barrio Per-array. En pocas palabras, log2 ratio para cada gen de productos de chips y de entrada se calculó sobre la media de las sondas en 1,000bp, teniendo en cuenta los genes con un valor de p inferior a 0,1 como valioso. Con el fin de describir el estado H4K16ac del sitio de inicio de transcripción (TSS), la distancia de cada sonda se simplifica de la siguiente manera: región entre -500-1000 ~ de la SAT se numera como-2, -500 ~ TSS tan-1, y TSS ~ + 500 como +1, como la posición TSS definida a partir de 11 a +10.
anotaciones funcionales a través de RT-PCR y Western Blot fueron seguidos por el análisis utilizando el DAVID (base de datos para anotación, y Visualización y Discovery integrado) de recursos de bioinformática y ontologías Gen (Función Molecular, Proceso biológico, célula componentes) de las vías de señalización. Se excluyeron todas las categorías que representan menos del 4% del número total de genes aplicados.
Resultados
CG200745 inhibe la proliferación de células de NSCLC
Para determinar los efectos inhibidores de CG200745 sobre la proliferación celular, se midió la IC
50 de CG200745 de las siguientes líneas celulares de cáncer de pulmón: Calu6, H358, H596, A549, HOP62, HOP92, H226, H460, H522 y, así como las células Beas2B. IC
50 valores de CG200745 en las células de cáncer de pulmón ensayadas fueron a niveles micromolares, y fueron comparables a los obtenidos a partir de el fármaco de referencia, SAHA (Tabla 1), lo que indica un efecto de supresión del crecimiento significativo de CG200745 en diversas líneas de células de NSCLC. Entre ellos, A549, Calu6, HOP92, y H522 células eran los más sensibles con IC
50 de & lt; 3 M. El efecto de CG200745 sobre la proliferación celular Calu6 fue confirmado como el número de células y la morfología en la microscopía óptica después de la exposición a 3 M CG200745 en diferentes períodos de tiempo (Fig. 1). Calu6 células mostraron crecimiento celular normal patrones de una manera dependiente del tiempo hasta 8 horas después del tratamiento de drogas. Sin embargo, después de 8 horas de tratamiento CG200745, se redujo la tasa de crecimiento de las células Calu6, y se observó muerte de las células con los cambios morfológicos. El efecto adverso de CG200745 sobre el crecimiento celular Calu6 se analizó mediante la realización de ensayo de MTT con diversas condiciones, lo que confirma que el medicamento reduce la proliferación celular a 40% de las células no tratadas (Fig. 1A).
Células
Calu6 crecido en placas de 6 pocillos se trataron con 3 M CG200745 para los períodos de tiempo indicados para analizar el efecto anti-proliferación de CG200745, y se observaron al microscopio. (B) El crecimiento de las células Calu6 en placas de 96 pocillos se analizaron mediante ensayo de MTS tras el tratamiento con diversas concentraciones de CG200745 (0 a 10μM) en tiempo de curso (0 a 48 horas). La significación estadística de los cambios en la viabilidad celular se calculó mediante la prueba t (*** indica p & lt; 0,001) guía empresas
CG200745 tratamiento induce G2 detención del ciclo celular /M y apoptosis en células Calu6
compuestos HDACi se sabe que inducen la detención del ciclo celular, un importante mecanismo de destino cáncer, en diversas células cancerosas. Para examinar si CG200745 inducida por la detención del ciclo en la línea celular Calu6, estas células se trataron con esta molécula HDACi para varios puntos de tiempo de 0 a 24 horas, seguido por análisis de citometría de flujo (FACS). Como se muestra en la Fig. 2A, un aumento en la población G2 /M se observó de una manera dependiente del tiempo. Calu6 células tratadas con CG200745 mostraron un aumento significativo del porcentaje de células en fase G2 /M (69%) en comparación con las células control no tratados (26%) (Fig. 2B y 2C). Estos resultados indican que CG200745 provoca la inhibición del crecimiento celular a través de G2 /detención del ciclo celular en fase M.
Células
Calu6 tratados con 3 M de CG200745 se analizaron ciclos celulares en citómetro de flujo. Cada histograma consiste en dos picos negros y una región rayada indica la fase G0 /G1, G2 /M fase, y la fase S, respectivamente. El efecto de CG200745 en la distribución del ciclo celular se analizó a diversos puntos de tiempo de (A), o en comparación con las células no tratadas (B) representan como una vista gráfica (C).
CG200745 ocasiona un aumento de la histona acetilación
Para examinar los efectos inhibidores de HDAC de CG200745 en células de cáncer de pulmón de células no pequeñas, nos trataron células Calu6 con diferentes concentraciones de CG200745 y analizados acetilación de histonas por el Western Blot, así como la actividad HAT y HDAC en varios puntos de tiempo. Como se muestra en la Fig. 3A, baja concentración de tratamiento CG200745 aumentó significativamente la acetilación de la histona H3 y H4 en varios lugares incluyendo K9 en H3, y K16, así como S1 /K5 /K8 /K12 en H4, de una manera dependiente del tiempo hasta 24 horas después de tratamiento en el análisis de Western Blot. Para confirmar los efectos inhibidores de la histona CG200745 de desacetilación, que mide la actividad HAT y HDAC en extractos nucleares de células Calu6 antes y después del tratamiento CG200745. En contraste con la actividad HAT sin cambios después del tratamiento CG200745 (Fig. 3B), la actividad HDAC en células Calu6 tratados con CG200745 fue significativamente más bajo que en las células control no tratadas (Fig. 3C), lo que indica que CG200745 aumento del nivel de acetilación de histonas debido a la inhibición de la actividad HDAC.
(a) el estado de acetilación de las histonas se analizaron en transferencia de Western de las células Calu6 tratados con varias concentraciones de CG200745 (0 a 10 mM) con anti-H3K9ac, anti-H4K16Ac, anti-H4S1 /anticuerpos K5 /K8 /K12Ac y /o anti-acetil H4. (B, C) las actividades de HAT y HDAC en el control y células tratadas con CG200745 se determinaron utilizando 50? G de extracto nuclear en el punto de tiempo indicado.
CG200745 induce cambios modificación de las histonas en células Calu6
H4K16ac es un activador conocido de la transcripción génica global. Para investigar si los genes que regulan la supervivencia celular se vieron afectados por la acetilación de histonas que resulta del tratamiento CG200745, hemos realizado chip de ensayo en chip usando un anticuerpo específico H4K16ac. Los genes unidos a H4K16ac se inmunoprecipitaron y se analizaron en microarrays de oligonucleótidos se centró en la región promotora. El objetivo principal de este experimento fue determinar cuántos y qué genes relacionados con el estado H4K16ac se ven afectados por el tratamiento CG200745. Como se muestra en la Tabla 2, se detectaron más de 10.000 genes vinculados a H4K16ac tanto en las células tratadas con Control- y CG200745, con los niveles de expresión de miles de genes que muestran cambios en el ensayo H4K16ac chip-on-chip después del tratamiento CG200745.
a continuación, examinamos el patrón de H4K16ac cambia en función de la distancia de la SAT por el trazado de un valor promedio diario de chip /de entrada para todas las sondas (Fig. 4), en la que el eje X indica la distancia desde el área de TSS como se describe en una sección anterior. El H4K16ac fue, sorprendentemente, la disminución en el área adyacente a la TSS, especialmente a-500 nt de la SAT, después del tratamiento CG200745, mientras que H4K16ac en el área distante de TSS hubo diferencias con él en las células de control no tratadas, que es común debido a la función de activación transcripcional de H4K16 (Fig. 4A). El registro proporción promedio de los datos /entrada de chip demostró claramente que un menor número de genes con H4K16ac a 500 nt de la SAT se observaron en las células tratadas en comparación con las células control, aunque un sitio de modificación importante de H4K16ac era aún evidente en todo el TSS (Fig. 4B) . Estos resultados se han confirmado en experimentos repetidos, lo que indica que el tratamiento CG200745 suprime H4K16 acetilación en 500 nt de la SAT de muchos genes.
H4K16 acetilación adyacente a la SAT se evaluó mediante el cálculo de la relación de registro de chip /media de entrada en el misma distancia de la SAT. Los números en el eje X indican la distancia de TSS. eje Y representa el coeficiente medio de registro de chip /entrada. (A) H4K16 estado de acetilación de los genes en los alrededores de TSS fue representado de forma individual en las células tratadas con Calu6 CG200745 o no tratados. (B) El nivel de acetilación de H4K16 se comparó entre CG200745 tratos y las células no tratadas de acuerdo a la distancia de la SAT. Dos experimentos se llevaron a cabo por separado para calcular la barra de error para cada posición.
La correlación entre los cambios en la expresión génica H4K16ac y después del tratamiento CG200745
expresión génica
H4K16ac inducida es impulsado por el desprendimiento de cromosómica ADN unido a las proteínas histonas, lo que resulta en la apertura de sitios de ADN para varios factores de transcripción. Bajo un estado hipo-acetilado, sin embargo, la carga positiva de los residuos de lisina en el extremo amino terminal de la cola de la histona actúa como una fuente para la unión a la carga negativa de la cadena principal de fosfato en el ADN cromosómico de alta afinidad. Esta estrecha unión permite la cromatina para formar estructuras más compactas, lo que resulta en la inhibición de la transcripción de genes relacionados. Como se muestra en la Tabla 2, los niveles H4K16ac de miles de genes se han cambiado después del tratamiento CG200745. Con el fin de verificar la correlación entre el estado de H4K16ac y la expresión del gen correspondiente, los niveles de mRNA fueron examinados para genes que se sometieron a cambios significativos H4K16ac alrededor del área de TSS. Como se muestra en la Tabla 3, los niveles de expresión de ARNm de
p
21,
GSN-b
, y
MXI1
, que habían mejorado sus H4K16ac, fueron todos aumentaron después del tratamiento CG200745 , mientras que otros genes con disminuyeron H4K16ac, como
HOXD11
,
HOXD9
, y
PIM1
, mostraron disminución de la expresión de ARNm. Además, la expresión de ARNm de
Hat1
, que mostró niveles similares H4K16ac con y sin tratamiento CG200745, no se ha cambiado.
Para confirmar aún más la correlación de la expresión de ARNm y los cambios en H4K16ac después del tratamiento CG200745, la expresión del ARNm de la
CCND1
y
p21 se evaluaron
genes. Los niveles H4K16ac del
CCND1
y
p21
-promoter región se analizaron en tratar (control) y células (CG5) Calu6 CG200745-tratadas utilizando toda una sonda del gen de microarrays. Como se muestra en la Fig. 5, el nivel H4K16ac en
CCND1
y
p21
genes después del tratamiento CG200745, especialmente cerca de la posición de los SAT, se encontró que ser alterado significativamente (Fig. 5A) y que se correlaciona con la expresión de mRNA cuando se mide cuantitativamente (Fig. 5B). La expresión de
MXI1
se incrementó después de 24 horas de tratamiento de CG200745 en el análisis semicuantitativo con dos conjuntos diferentes de cebadores (Fig. 5C). Los niveles de expresión de proteínas de
ciclina D1
y
p21
genes se redujeron drásticamente y aumenta, respectivamente, no sólo en las células Calu6 sino también en varias otras células de NSCLC, incluyendo A549, H358, H596 y células (Fig. 6). Además, el tratamiento CG200745 resultó en la activación de la caspasa apoptótica intrínseca 3, en células Calu6, así como en varias células de NSCLC, incluyendo A549, H358, H596 y células (Fig. 6A y 6B). En conjunto, estos datos mostraron que los niveles de expresión de ciertos genes fueron afectados por el tratamiento CG200745 a través del nivel H4K16ac en la región TSS.
(A) Los niveles de acetilación de H4K16 en CCND1 y
p
21 genes se designan de acuerdo con la distancia de la TSS en sin tratar (control) y células tratadas con CG200745 (CG5). (B) Los niveles de mRNA de la CCND1 y
p
21 genes se cuantificaron por tiempo real RT-PCR. (C) La expresión del gen MXI1 se determinó por RT-PCR en A549 y células Calu6.
células se analizaron en transferencia Western con ciclina D1, p21, caspasa-3, c-myc, acetil-H4, H3, y los anticuerpos beta-actina. Los lisados celulares de A549 tratado con el fármaco, Calu6 (A), y células H358 H596 (B) se compararon con las células no tratadas correspondiente.
Discusión
HDACI moléculas se han notificado a inducir una gama de efectos contra el cáncer, incluyendo la apoptosis de células tumorales, la detención del ciclo celular, la diferenciación, la senescencia, la modulación de la respuesta inmune, y la angiogénesis alterada [20]. Además, el uso de HDACi se ha demostrado que aumenta la sensibilidad de líneas celulares de NSCLC a gefitinib o erlotinib [21,22]. CG200745, (E) -N (1) - (3- (dimetilamino) propil) -N (8) hidroxi-2 - ((naftaleno-1-Loxy) metil) oct-2-enediamide, es un HDACi recientemente desarrollado , experimentando actualmente un ensayo clínico de fase. Su efecto inhibidor sobre el crecimiento celular se ha demostrado en varios tipos de células de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata, carcinoma de células renales, y células RKO (células de carcinoma de colon) en mono- y combinacional-terapia con otros medicamentos contra el cáncer [17-19]. Este fármaco en combinación con la regresión del tumor Docetaxel inducida en DU145 xenoinjerto de células de cáncer de próstata a través de la activación de la apoptosis. También, que causó la muerte celular en células de carcinoma de colon que expresan p53 de tipo salvaje por acetilación de p53. En nuestro estudio, hemos investigado los efectos antitumorales de HDACi en las células NSCLC a expandir potencialmente su aplicación clínica con indicaciones de tumores grandes. Nuestra intención era aún más para dilucidar el mecanismo subyacente de la novela inhibidor de HDAC que está ahora en ensayos clínicos para la leucemia y tumores sólidos, por lo que se lograría la aplicación clínica adecuada, como co-tratamiento y /o el tratamiento adyuvante con quimioterapia dirigidos. tratamiento HDACi indujo la inhibición del crecimiento de células de cáncer de pulmón, la detención del crecimiento celular en la fase G2 /M, y la apoptosis se evidencia por la caspasa 3 escisión en comparable IC
50 concentraciones a la de SAHA (también conocido como vorinostat), el único HDACi actualmente aprobado para el tratamiento clínico de linfoma cutáneo de células T [23-25]. Aunque todavía se produjo H4K16 acetilación ampliamente en regiones promotoras, curiosamente, CG200745 redujo específicamente en la acetilación de histonas H4K16-500 nucleótidos de la SST como se muestra por repetición de chip-on chip análisis. Estos resultados indican que la inhibición del crecimiento celular mediada por inhibidor de HDAC consiste en la regulación transcripcional de varios genes. El análisis en profundidad de los genes implicados en la regulación del ciclo celular, como
CCND1
,
p21
, y
MXI1
, mostraron que el tratamiento con CG200745 en transcripcional cambios en estos genes .
MXI1
, un antagonista de la
c-Myc oncogén
, codifica una proteína designada Mad2, que es un factor de transcripción en la red Myc-Max-Mad. El heterodímero Mxi /Mad se predice para antagonizar la función de Myc mediante la supresión de Max disponible para la actividad transcripcional myc. El factor de transcripción c-Myc se sobreexpresa en muchos tumores humanos, y su activación requiere la heterodimerización con su socio Max. C-myc se regula a través de la ubiquitinación y la degradación del proteasoma [26,27]. De hecho, la inhibición de Myc /Max unión por moléculas pequeñas ha sido identificado como un objetivo muy prometedor para la terapia del cáncer [28]. proliferación relacionados con MXI1 está mediada a través de IGFBP-3 de señalización [18], y el aumento de expresión FoxO3a regula al alza la expresión de miembros de la Mxi vía Mad /[29]. Por lo tanto, la expresión upregulated de MXI1 mediante tratamiento CG200745 puede jugar un papel en la regulación de la proliferación celular a través de la red Myc-Max-Mad.
La SAHA HDACi, se ha demostrado que disminuye los niveles de expresión de ERK1 /2 y MMP-9, aumentar los niveles de expresión de p53, que a su vez altera la proliferación celular y la apoptosis, y promover la acetilación de las histonas H3 y H4 en células de carcinoma de ovario [30]. Además, un estudio previo ha informado de que SAHA activa p53, pero no requiere p53 por sus efectos contra el cáncer. El mismo estudio demostró que los efectos citotóxicos inducidos por entinostat son parcialmente dependiente de p53, lo que indica que los diferentes compuestos HDACI tienen diferentes requisitos para p53 [31]. El mecanismo subyacente a la inhibición del crecimiento celular de CG200745 en células RKO se ha demostrado que se producen de una manera dependiente de p53 [19]. En ese estudio, CG200745 aumenta la acetilación de p53 en los residuos de lisina K320, K373, y K382. CG200745 también indujo la acumulación de p53, promueve la transactivación dependiente de p53, y aumentó la expresión de proteínas codificadas por genes diana de p53,
MDM2
y
p21
(Waf1 /Cip1) en el cáncer de próstata humano Células. Los efectos antitumorales de CG200745 en las células de NSCLC, sin embargo, se han encontrado en nuestra actual analiza para ser independiente del estado de mutación de los genes que codifican p53. Las células de NSCLC que utilizan, incluyendo p53 de tipo salvaje y nulo /células mutantes, mostraron una inhibición del crecimiento celular tras el tratamiento con un HDACi, lo que indica que CG200745 regula el crecimiento celular por mecanismos diferentes según el contexto celular.
En conclusión, los resultados de nuestro estudio presente ampliar la aplicabilidad general de CG200745 para el tratamiento de NSCLC, para lo cual es una nueva HDACi prometedor. Además, nuestros resultados demuestran que los efectos de esta HDACi pueden ocurrir a través de un mecanismo independiente de p53. Además, los datos muestran que HDACi puede suprimir la ruta de señalización de c-myc a través de la inducción de
MXI1
, pero este hallazgo requiere más investigación. Por último, el potencial de CG200745 para aumentar la potencia de los medicamentos contra el cáncer como parte de una terapia de combinación debe explorarse más
Apoyo a la Información
S1 tabla. Las secuencias de cebadores para la reacción RT-PCR cuantitativa
doi: 10.1371. /journal.pone.0119379.s001 gratis (DOCX)
Agradecimientos
donaciones compatibles para el estudio fueron los coreanos Tecnología I Medicina y D del Proyecto, Ministerio de salud & amp; El bienestar, la República de Corea (HI06C0868, HI10C2014), líder de investigación extranjeros Programa del Instituto de Reclutamiento, Fondo de Fomento de la Investigación Básica y el Programa Básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (MEST ) (2011-0030105, KRF-2008-355-E00006, NRF-2014R1A1A2006192).