Extracto
El aumento de la proliferación de las células cancerosas es directamente dependiente de la mayor actividad del retículo endoplasmático (ER) maquinaria que se encarga de plegamiento de proteínas, ensamblaje y transporte. De hecho, es tan crítica que las perturbaciones en el retículo endoplasmático pueden conducir a apoptosis. Este orgánulo cuidadosamente regulado representa un objetivo único de las células cancerosas sin dañar las células sanas. En este estudio, se evaluó un extracto estandarizado de la fruta del mangostán (MFE) para la modulación de proteínas de estrés ER en el cáncer de próstata. Dos líneas celulares de cáncer de próstata humano, LNCaP y 22Rv1, y las células epiteliales de la próstata (PrECs) obtenidos a partir de dos pacientes sometidos a prostatectomía radical se trataron con MFE. La citometría de flujo, MTT, BrdU y Western blot se utilizaron para evaluar la apoptosis celular, la viabilidad, la proliferación y el estrés ER. A continuación, se evaluó MFE para la estabilidad microsomal y la actividad anti-cáncer en ratones desnudos. MFE indujo apoptosis, disminución de la viabilidad y la proliferación en células de cáncer de próstata. MFE aumentó la expresión de las proteínas de estrés ER. Curiosamente, MFE promueve selectivamente estrés ER en las células de cáncer de próstata sin afectar PrECs. MFE suprimió el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de tumor sin toxicidad evidente. Mangostán extracto de la fruta promueve selectivamente el estrés del retículo endoplásmico de las células cancerosas sin afectar las células epiteliales de la próstata no tumorigénicas. Por otra parte, en un extracto de la fruta de mangostán en vivo ajuste reduce significativamente la formación de tumores de xenoinjertos
Visto:. Li G, Petiwala SM, Pierce RD, Nonn L, Johnson JJ (2013) modulación selectiva de retículo endoplasmático marcadores de estrés en la próstata Las células cancerosas de un extracto estandarizado de la fruta de mangostán. PLoS ONE 8 (12): e81572. doi: 10.1371 /journal.pone.0081572
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 12 de julio de 2013; Aceptado: 14 Octubre 2013; Publicado: 18 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud /Instituto Nacional del cáncer 1R03CA138953 (J. Johnson). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el aumento de la proliferación de las células cancerosas es directamente dependiente de la mayor actividad de la maquinaria retículo endoplasmático (ER) que es responsable de plegamiento de proteínas, montaje, y el transporte [1], [2]. De hecho, es tan crítico que la modulación de la síntesis de proteínas si no se regula adecuadamente puede conducir a la apoptosis [3] - [6]. Esto es especialmente cierto para las células cancerosas que se han acumulado una capacidad de superar los puntos de control del ciclo celular y la apoptosis [7]. A medida que la demanda de la síntesis de proteínas aumenta se produce un aumento proporcional en la "dejadez traslacional" que conduce a la acumulación de proteínas desplegadas y plegadas mal que alteran la homeostasis ER. Si no se controla, estas células experimentan apoptosis, sin embargo, está claro que no tienen intención de hacerlo. Como era de esperar, las células cancerosas desarrollan una solución que utiliza una vía de transducción de señales conocida como la "respuesta de la proteína desplegada (UPR)". Este proceso puede alterar la transcripción y traducción de proteínas restableciendo así la homeostasis ER - hasta cierto punto. Esto a su vez promueve la resistencia a la apoptosis y aumenta la supervivencia celular. Este fenómeno está bien establecida a través de muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de la próstata.
La teoría predominante de la UPR, que está regulada por varios diferentes de estrés ER proteínas /vías, es que una modulación positiva de estrés ER promoverá la supervivencia [2]. En esencia, esto es cierto, sin embargo, lo que puede ser más significativo es el grado en el que se modulan proteínas de estrés ER. Como se desprende de los estudios incluidos en este documento, así como los estudios realizados por otros investigadores, se presentan datos que sugieren que un aumento significativo de las proteínas de estrés ER dará lugar a la apoptosis en las células cancerosas.
En nuestros estudios hemos evaluado un extracto de el mangostán (
Garcinia mangostana
) de frutas y nos pareció que modulan de manera significativa las proteínas de estrés ER. Aún más interesante fue la respuesta aparentemente específico para aumentar las proteínas de estrés ER en las células de cáncer de próstata, mientras que la disminución de las proteínas de estrés ER en las células epiteliales de la próstata. Este efecto representa una relación compleja que existe en las células no cancerosas y cancerosas. Aquí presentamos evidencia de que un aumento en el CHOP ER proteína de respuesta al estrés /GADD153 es un enfoque viable para nuevas estrategias para el desarrollo de la terapéutica.
Materiales y Métodos
extracto de la fruta del mangostán, kits y anticuerpos
Extracto de fruta del mangostán (MFE) se obtuvo de Avesthagen, Inc. (Chatsworth, CA). Todos los anticuerpos para el análisis de Western blot, kit de ensayo de proliferación de células BrdU, y se escindió de la caspasa-3 kit ELISA se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). kit de ensayo de proteína BCA y los sustratos quimioluminiscentes se obtuvieron de Pierce (Rockford, IL). kit APO-DIRECT ™ se obtuvo de Phoenix Flow Sistemas (San Diego, CA). One-Step kit de RT-PCR se obtuvo de Life Technologies (Grand Island, NY). RNeasy mini kit y RNasa libre de DNasa set se obtuvieron de QIAGEN (Santa Clarita, CA).
cromatografía líquida
Para la determinación de la concentración de α-mangostin en las muestras de extracto de fruta de mangostán se analizaron en un módulo de separación de HPLC Waters 2695. Las separaciones se lograron usando un gradiente como [8] se describe anteriormente. Para la determinación de los niveles séricos de α-Mangostin, las muestras de suero se analizaron en una bomba de Thermoseparation SpectraSYSTEM P4000 con un AS 3000 automuestreador, un detector de Thermoseparation SpectraSYSTEM UV2000 a 243 nm, tiempo de ejecución 20 min, y 10 l de volumen de inyección a temperatura ambiente. Las separaciones se lograron con un sistema disolvente isocrático, a 1,0 ml /min, y un Capcell Pak C-18, 3 m, 4,6 x 250 mm de columna con inline Upchurch filtro de pre-columna. El límite de cuantificación y detección es 0,039 g /ml (es decir, 95 nM), y 0,0098 g /ml (es decir, el 23,9 nM), respectivamente
cultivo de células y el tratamiento
células
LNCaP y 22Rv1. se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Estas células se cultivaron en RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina /estreptomicina. Todas las células se mantuvieron en condiciones estándar de cultivo celular como se describe anteriormente [9]. Las células se cultivaron en medio antes mencionado complementado con una gama de dosis de MFE para tiempos deseados, a continuación, lista para experimentos posteriores.
primarias células epiteliales prostáticas y de tratamiento
células epiteliales prostáticas primarias (PrECs ) se establecieron a partir de tejido de la prostatectomía radical en la Universidad de Illinois en Chicago Medical Center como se describe anteriormente [10]. tejido fresco de la zona periférica fue seleccionado por un patólogo de acuerdo con un protocolo aprobado por el IRB. Brevemente, el tejido se digiere en colagenasa, y se sembró en placas recubiertas con colágeno en PrEGM medios de comunicación (Lonza, Walkersville, MD) para excrecencia de las células epiteliales. Se utilizaron todas las células en el paso secundario y ~ 70% de confluencia (densidad celular). PrECs fueron tratados con 15 mg /ml MFE durante 24 horas seguido de experimentos aguas abajo
La viabilidad celular
La viabilidad celular se determinó por 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il). - 2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT) como se describe anteriormente [11].
la proliferación celular
la proliferación celular se determinó mediante ensayo BrdU acuerdo con el manual del fabricante.
citometría de flujo
se utilizó el kit APO-DIRECT ™ (Phoenix Flow Systems, San Diego CA) para la medición de la apoptosis de las células tratadas por citometría de flujo [11]. Brevemente, 22Rv1 células se sembraron a 50 hasta 60% de confluencia y luego tratados con medio completo que contienen MFE. El kit fue seguida por las direcciones de protocolo.
transferencias de Western
lisados de células enteras de células tratadas se prepararon como se describe anteriormente [9], [12]. Los lisados se cuantificaron utilizando el ensayo BCA según el manual del fabricante. Un protocolo de transferencias Western común fue seguido. En pocas palabras, la misma cantidad de lisados se cargaron a cada pocillo de geles prefabricados 12% (Bio-Rad, Hercules, CA). Después de la transferencia, las membranas se bloquearon y se incubaron con el anticuerpo primario (1:1000) durante la noche a 4 ° C, se enjuagó brevemente, después se incubó con el anticuerpo secundario (1:2000) a temperatura ambiente durante 1 hr. Las membranas se lavaron, se incubaron con sustratos y expuesto en una cámara FluorChem E (ProteinSimple, Santa Clara, CA).
se sintetizaron RT-PCR
Los cebadores para XBP-1 y GAPDH RT-PCR por IDT (Coralville, IA) de acuerdo con estudios anteriores [13]. Las secuencias fueron; XBP-1 adelante, 5'-TTA CGA GAG AAA ACT CAT GGC C-3 ', XBP-1 hacia atrás, 5'-GGG TCC AAG TTG TCC AGA ATG C-3', GAPDH adelante, 5'-CAT CAC ACA GTC GCC ATC AC-3 ', GAPDH inversa, 5'-TCC ACC ACC TTG CTG CTG TA-3'. células LNCaP y 22Rv1 fueron tratados con 15 mg /ml MFE durante 24 horas. El ARN total se extrajo de las células tratadas y de control. Un microgramo de RNA total se utilizó como molde para una etapa de RT-PCR. el protocolo del fabricante fue seguida.
ELISA
exfoliados caspasa-3 en los niveles mismas cantidades de diferentes lisados celulares fueron detectados por ELISA. Se siguió el manual del fabricante.
Estabilidad de MFE estandarizado para alfa-mangostin en microsomas de hígado
0,5 mg /ml de microsomas hepáticos humanos (Invitrogen) y microsomas de hígado de ratón (BD Biosciences) se incubaron con la sustancia de ensayo, mangostin /MFE a una concentración final de 1 mM, en una solución que contiene 5 mM de ácido isocítrico, mM MgCl 5
2, 0,2 U /ml isocítrico ácido deshidrogenasa y 1 mM NADP + en tampón mM Tris-HCl 100 (pH 7,4). Los compuestos se incubaron con microsomas a 37 ° C durante 0, 10, 20 y 30 minutos por duplicado. Los tubos de control se incubaron sin NADP +. Después de la incubación, las muestras se sometieron a vórtice y se mantuvieron en hielo hasta el momento de la centrifugación a 17.000 g durante 15 minutos a 4 ° C. Después de la centrifugación los sobrenadantes se transfirieron en viales y se analizaron mediante el método LC-MS como se ha descrito antes.
En vivo
22Rv1 modelo de xenoinjerto de tumor
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices aprobadas por el Comité de Cuidado y uso de Animales de la Universidad de Illinois en Chicago. El protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales de la Universidad de Illinois en Chicago (Número de protocolo: ACC-11-019) para asegurar medidas se llevaron a cabo para aliviar el sufrimiento del animal. En la conclusión del estudio todos los ratones recibieron anestesia general por inhalación (es decir, isoflurano), seguido de CO
2 asfixia por el protocolo de los animales aprobado para la eutanasia. Todos los animales fueron controlados a diario, además de personal de cuidado de los animales. Atímicos (
nu /nu
) ratones desnudos macho (Laboratorio de Harlan, Madison, WI) siete y ocho semanas de edad fueron alojados en condiciones libres de patógenos con un 12 h luz /12 h oscuridad calendario y se alimentaron con una autoclave AIN-76A dieta
ad libitum
como se describe anteriormente [9], [12]. Se han usado 22Rv1 células para la determinación del
in vivo
efectos de MFE basado en el hecho de que estas células forman tumores rápida y reproducible en ratones desnudos con xenoinjertos de tumores. Catorce animales se dividieron aleatoriamente en dos grupos, con siete animales en cada grupo. Los animales del grupo 1 recibieron vehículo (100 l de aceite de semilla de algodón) por inyección intraperitoneal de administración (IP) y sirvieron como control. Los animales del grupo 2 recibieron extracto de fruta de mangostán (35 mg /kg) disuelto en aceite de semilla de algodón por IP dos veces a la semana. Los pesos corporales se registraron durante todo el estudio.
El análisis estadístico
Todo el análisis estadístico se realizó mediante el uso de software de VassarStats. Los datos se expresan como la media con desviación estándar para todos los grupos. La significación estadística de las diferencias en todas las mediciones entre el control y los grupos tratados fue determinada por ANOVA de una vía seguido por la prueba HSD de Tukey para comparaciones múltiples. Se utilizó la prueba t de Student pareada de par sabia comparaciones de grupos, según sea necesario. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras, y P & lt;. 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
HPLC del extracto de la fruta del mangostán
Por HPLC se determinó que contenía más de MFE 35% α-Mangostin y se usó durante todo el estudio (Fig 1A & amp;. B). Múltiples picos indican que MFE también contiene xantonas adicionales, tales como β-Mangostin y γ-Mangostin (Figura 1A & amp;. B).
[A], xantonas polifenólicos aislados de la fruta de mangostán. [B], HPLC Cromatograma del extracto de la fruta del mangostán. Sub-panel representa una expansión del perfil para revelar los componentes adicionales en el extracto.
Fruta del mangostán extracto de reducción de la viabilidad celular y la proliferación celular en las células cancerosas de la próstata
Hemos observado que tiene MFE toxicidad evidente en ambas células LNCaP y 22Rv1 bajo el microscopio (Fig. 2A). Usando el ensayo de MTT, se observó que disminuyó MFE 22Rv1 y LNCaP viabilidad celular en la dosis y de manera dependiente del tiempo con un mejor efecto en 22Rv1 células (Fig 2B & amp;. C). MFE también inhibió la proliferación de células LNCaP y 22Rv1 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 2D).
[A], las imágenes microscópicas de las células de cáncer de próstata tratados con MFE y no tratados, se indicaba dosis MFE. [B], las células LNCaP se trataron con dosis crecientes de MFE para 24, 48, o 72 hr, la viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT. [C], las células 22Rv1 fueron tratados con dosis crecientes de MFE para 24, 48, o 72 hr, la viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT. [D], ambos 22Rv1 y las células LNCaP se trataron con dosis crecientes de MFE, la proliferación celular se evaluó mediante un ensayo de BrdU. valores de absorbancia a 450 nm (A450) representan la proliferación de los números de células. Estos experimentos se realizaron por triplicado y se representan por la media junto con la desviación estándar.
apoptosis inducida por el extracto de la fruta del mangostán en las células de cáncer de próstata
A una dosis de 15 mg /ml de MFE, el porcentaje de células apoptóticas 22Rv1 era normal 37% determinada por citometría de flujo (Fig. 3A). En consecuencia, el nivel de marcador de apoptosis escinde células caspasa-3 y la expresión de la proteína pro-apoptótica Bax en 22Rv1 y LNCaP aumentó con la dosis MFE (Figura 3B & amp;. C). Estos resultados son consistentes con nuestra evaluación anterior de pura α-mangsotin [9].
[A], el porcentaje de células apoptóticas en MFE-tratadas y las células no tratadas se determinaron por citometría de flujo. dosis MFE era 15 mg /ml. [B], exfoliados caspasa-3 niveles en dosis crecientes de MFE trataron células LNCaP y 22Rv1. Los lisados celulares se prepararon a partir de células tratadas con MFE y troceados caspasa-3 niveles se evaluaron a partir mismas cantidades de los lisados celulares por ELISA, ver detalles
Materiales y Métodos
. los niveles de expresión relativos se indican como valores de absorbancia a 450 nm (A450). [C], la expresión de Bax en dosis crecientes de 22Rv1 tratada MFE y LNCaP. Los lisados celulares se prepararon a partir de células tratadas con MFE, la expresión de Bax se detectó por Western blot, y β-actina se utilizó como control de carga. Estos resultados son representantes de tres experimentos independientes.
extracto de la fruta del mangostán aumentó la expresión de proteínas de respuesta se desarrolló la proteína en células de cáncer de próstata
Ha sido bien establecido que el estrés ER activa UPR para restablecer homeostatsis celular. Por lo tanto, hemos examinado la expresión de importantes estrés ER /proteínas de la UPR en células de cáncer de próstata tratados con MFE (22Rv1 y LNCaP). La expresión de tres proteínas de la UPR importantes, pancreático ER quinasa (PKR) -como ER quinasa (PERK), enzima que requiere inositol-1 (IRE1) y la proteína homóloga C /EBP (CHOP), fueron gradualmente hasta reguladas con dosis crecientes de MFE en 22Rv1 y las células LNCaP (Fig. 3A).
extracto de mangostán fruta modula la ER-estrés específico de caspasa-4
se ha informado de que la caspasa-4 se localiza en la membrana ER y puede función como la caspasa-estrés específico ER en las células humanas [14]. Detectamos exfoliados caspasa-4 tanto en células LNCaP 22Rv1 y después de tratar las células con una gama de dosis de MFE durante 24 horas. Los resultados mostraron un aumento dependiente de la dosis de los niveles de caspasa-4 escindidos en las células tratadas con MFE (Fig. 3B).
extracto de la fruta del mangostán ER chaperones moduladas
que también investigó posibles cambios en la expresión de ER chaperones en las células del cáncer de próstata tratados con MFE. Bip (proteína de unión a inmunoglobulina), una chaperona ER críticos implicados en el estrés ER /UPR, fue hasta reguladas con dosis crecientes MFE (Fig. 3C). Calnexina es una proteína de membrana del RE para plegamiento apropiado y control de calidad [15]. Se observó un ligero aumento de la expresión de calnexina de 0 a 10 g /ml de MFE en ambas líneas celulares. Curiosamente, la expresión calnexina se redujo drásticamente en 15 g /ml de MFE en 22Rv1 células (Fig. 3C). proteína ER endoplásmico oxidoreductin-1 (Ero1-Lα) es una ER-oxidasa y hasta reguladas por CHOP para aumentar los niveles de proteínas mal plegadas [16]. MFE aumentó Ero1-Lα de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3C). MFE también aumentó otra chaperona ER, PDI de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3C). Estos datos demostraron que el MFE aumentó la expresión de chaperonas estrés ER en las células de cáncer de próstata.
extracto de la fruta del mangostán indujo empalmado XBP-1 en células de cáncer de próstata
en proteínas
Durante el estrés ER, unión X box 1 (XBP-1) mRNA se somete empalme para producir un factor de transcripción regulación al alza de los genes de la UPR. Por lo tanto se utilizó RT-PCR para detectar empalmado XBP-1 en las células LNCaP y 22Rv1 tratados con MFE. Empalmados y unspliced XBP-1 cDNA se observó tanto en las células tratadas sólo con unspliced XBP-1 de ADNc en células de control (Fig. 4D).
Células
22Rv1 y LNCaP se trataron con dosis crecientes de MFE o α-Mangostin durante 24 horas. Los lisados celulares se prepararon y se sometieron a transferencia de Western para la detección de la expresión de proteínas de estrés ER críticos. [A], la expresión de las proteínas de estrés ER en dosis crecientes de células LNCaP y 22Rv1 tratados con MFE. [B], exfoliados caspasa-4 niveles en dosis crecientes de células LNCaP y 22Rv1 tratados con MFE. [C], la expresión de múltiples chaperones ER en dosis crecientes de células LNCaP y 22Rv1 tratados con MFE. Beta-actina se utilizó como control de carga. Estos resultados son representantes de tres experimentos independientes. [D], el panel superior, diagrama esquemático de XBP-1 empalme durante el estrés ER. panel inferior, las imágenes en gel de agarosa de los productos de RT-PCR. células LNCaP y 22Rv1 fueron tratados con 15 mg /ml MFE durante 24 horas. El ARN total se extrajo y se sometió a RT-PCR. Se han usado XBP-1primers que abarcan la secuencia de corte y empalme. productos de RT-PCR se realizaron en un gel de agarosa al 2%. GAPDH se utilizó como control.
mangostán extracto de fruta de forma selectiva inducida por el estrés ER en las células de cáncer de próstata sin afectar a las células epiteliales de la próstata no cancerosas
A continuación, nuestro objetivo fue caracterizar el potencial MFE de promover el estrés ER en las células no cancerosas. células epiteliales de la próstata (PrECs) se aislaron a partir de la biopsia de próstata en dos pacientes con cáncer de próstata sometidos a prostatectomía radical. Las células fueron cultivadas a 60-70% de confluencia y luego se trató con MFE. Curiosamente, 15 g /ml de MFE disminuyeron significativamente la expresión PERK en PrECs de ambos pacientes, mientras que la misma dosis de MFE aumentó significativamente la expresión PERK en 22Rv1. Como una proteína de aguas abajo regulada por PERK, CHOP expresión no aumentó en PrECs tratados con MFE, mientras aumentado dramáticamente en las células tratadas con 22Rv1 MFE (Fig. 5). Estos datos demostraron que el MFE promueve selectivamente estrés ER /UPR en células de cáncer de próstata, pero no en las células epiteliales de próstata no cancerosas, lo que sugiere un efecto diferencial sobre la modulación de las proteínas de estrés ER en las células cancerosas frente a células no cancerosas
.
PrECs fueron aisladas de pacientes sometidos a prostatectomía radical. Las muestras fueron luego utilizados para preparar las células para el tratamiento con agentes de estudio. PrECs de dos pacientes diferentes de cáncer de próstata o 22Rv1 células se trataron con 15 mg /ml de MFE durante 24 horas y después se sometieron a Western blots. Beta-actina se utilizó como control de carga. Menos y más símbolos representan, respectivamente, la ausencia y la presencia de agentes indicados. Estos resultados son representantes de tres experimentos independientes.
Estabilidad de la α-mangostin en el extracto de la fruta del mangostán en presencia de microsomas de hígado
Para caracterizar el grado de metabolismo P450, α-mangostin y el extracto de mangostán fruta se incubó en presencia de microsomas de hígado de ratón y fuentes humanas. Para este experimento se evaluó microsomas de hígado como la administración de agente del estudio. A los 30 minutos, la estabilidad de α-mangostin en MFE se encontró disminución ligeramente en el ratón y el hígado humano microsomas un 30,8% y 17%, respectivamente (Fig 6A & amp;. B). Estos resultados sugieren que el metabolismo de fase I tiene un papel mínimo en el metabolismo de la α-mangostin, que es el más abundante en xantonas MFE. Estos datos sugirieron que el metabolismo de Fase II en los microsomas parece ser la principal vía de metabolismo MFE. Se prepararon
microsomas de hígado humano y de ratón como se describe en los materiales y métodos. Las barras negras representan el control respectivo para ese punto de tiempo individual. Las barras grises representan la estabilidad microsomal de α-Mangostin en la Fase I de enzimas del sistema, tanto en ratón y microsomas hepáticos humanos. Se realizó un 'sin preincubación' (datos no mostrados) y no tuvo ningún impacto en la interpretación de estos datos. [A], extracto de la fruta del mangostán (estandarizado a alfa-Mangostin) se incubó con microsomas de hígado de ratón. [B], extracto de la fruta del mangostán (estandarizado a alfa-Mangostin) se incubó con microsomas hepáticos humanos. [C], Doce animales fueron inyectados por vía subcutánea en cada flanco del ratón (es decir, dos tumores por ratón) con ~ 1 × 10
6 22Rv1 células para iniciar el crecimiento del tumor. Veinticuatro horas después de la implantación de células, los animales en cada cohorte recibidos por la administración intraperitoneal de vehículo o extracto de la fruta del mangostán (35 mg /kg). Los pesos corporales de los ratones desnudos atímicos tratados con vehículo de control o extracto de mangostán fruta (35 mg /kg) por vía intraperitoneal dos veces por semana se midieron dos veces a la semana. [D], el volumen medio de los tumores de los ratones tratados con el control y el extracto de fruta de mangostán se representaron durante días después de la inoculación de las células tumorales. Los puntos de datos representan la media de 12 tumores de seis ratones; barras representan la desviación estándar de la media, *
P
& lt; 0,01. [E], representantes de los ratones de control y grupo tratado con MFE.
extracto de la fruta del mangostán, inhibió el crecimiento de células de cáncer de próstata humano en ratones desnudos 22Rv1 atímicos sin toxicidad evidente
Para examinar la actividad anticancerígena de MFE
in vivo
, se construyeron modelos de xenoinjerto en ratones con células 22Rv1 y los trataron con MFE o vehículo. Comparado con el control, 35 mg /kg de MFE crecimiento del tumor inhibió significativamente (Fig 6D & amp;. E). Mientras tanto, no se observó diferencia significativa en los pesos corporales entre el grupo tratado con MFE y el grupo tratado con vehículo (Fig. 6C), lo que sugiere MFE tiene baja o ninguna toxicidad a una dosis eficaz.
Discusión
El mangostán (
Garcinia mangostana
) de fruta se informa que tiene una variedad de propiedades farmacológicas incluyendo el aumento de los índices de apoptosis en varias líneas celulares de cáncer de diferencia [17], [18]. Una variedad de polifenoles conocidos como xantonas que consisten en un sistema de anillo aromático tricíclico, junto con diversos isoprenilo, hidroxi, o grupos metoxi han sido aislados de mangostán. El xantonas más abundante es el α-mangostin, un xantonas isoprenylated, que ha recibido la mayor atención por sus propiedades promotoras de la salud [9], [19] - [23]. Al evaluar el fruto incluyendo el endocarpio y epicarpio junto con las hojas, corteza y raíces de más de 60 diferentes xantonas han sido aislados hasta la fecha desde el mangostán. Hemos informado anteriormente sobre la actividad anti-cáncer de α-mangostin en células de cáncer de próstata y de un modelo de ratón atímicos [9]. En este estudio anterior se observó α-mangostin para inhibir CyclinD1 /CDK4 y sugieren un posible mecanismo para la inhibición competitiva en el sitio de unión de CDK4. En este mismo estudio también se observó ratones desnudos implantados con células 22Rv1 para mostrar un volumen del tumor 65% más pequeño tras el tratamiento diario con α-mangostin. En nuestra experiencia, así como otros investigadores, α-mangostin se tolera bien con algunos informes de dosis tan altas como 200 mg /kg de peso corporal no está asociado a ninguna toxicidad específica. Múltiples informes junto con nuestros estudios han observado α-mangostin para inducir la apoptosis, sin embargo, los hechos ocurridos con anterioridad a la apoptosis son menos comprendidos. Además, se ha informado recientemente sobre el perfil farmacocinético de administrarse por vía oral α-mangostin en ratones y hemos demostrado que el conteo sanguíneo completo (CSC), incluyendo glóbulos blancos con diferencial no fue alterada [24]. Por esta razón empezamos a explorar el retículo endoplasmático como un objetivo potencial de un extracto de mangostán altamente caracterizado (& gt; 35% α-mangostin).
El retículo endoplasmático es extremadamente sensible a las alteraciones en su entorno que tienen un efecto directo sobre su estructura, la integridad y la función [1], [2]. Como se promueve y progresa cáncer hay un aumento de la demanda de los requerimientos del retículo endoplásmico como se evidencia por un aumento en la síntesis de proteínas. Este aumento de la demanda corre el riesgo de proteínas que se despliegan o mal plegadas de fabricación. Un aspecto importante de este aumento de la demanda en la síntesis de proteínas es la "respuesta de la proteína desplegada" que incluye PERK, CHOP y varias otras proteínas de estrés ER [25]. A medida que se "restablezca" homeostasis en la sala de emergencias, las proteínas pueden plegarse correctamente o sufren degradación que a su vez permitirá a las células sobrevivir. Si homeostasis no es establecida por la respuesta de la proteína desplegada o es perturbada por un agente exterior, estas células serán sometidos a apoptosis. Por lo tanto, los enfoques para aumentar la respuesta de estrés ER proteína relacionada puede ser un enfoque atractivo para alterar la homeostasis de la ER en las células cancerosas con el fin de promover la apoptosis. La evidencia por otros investigadores y de nosotros mismos sugiere que el uso de pequeñas moléculas que modulan las proteínas de estrés ER también puede retardar el desarrollo de tumores, el crecimiento, la invasión, proporcionando de esta manera una nueva estrategia terapéutica [26], [27].
ER estrés no sólo favorece la supervivencia de las células cancerosas, pero en situaciones específicas puede promover la apoptosis. agentes naturales, tales como la curcumina de la cúrcuma (
Curcuma longa
) han informado de inducir estrés ER pro-apoptótica en células de leucemia humana HL-60 por la regulación positiva de la expresión de PERK fosforilada, CHOP, Bip y exfoliados caspasa -4 [28]. En consonancia con esto, en nuestro estudio después del tratamiento con MFE tanto las células LNCaP y 22Rv1 se someten a estrés ER como se evidencia por un aumento de las proteínas de estrés ER incluyendo PERK, CHOP, IRE1α, Bip y la caspasa-4 escindido. CHOP es una proteína de estrés bien establecida ER aguas abajo /UPR y juega un papel importante en la ER estrés inducido por la apoptosis [29]. Los mecanismos que CHOP contribuye a la apoptosis incluyen la inhibición de anti-apoptótica de Bcl-2 y hasta la regulación de GADD34 y Ero1α. Sobre regulación de GADD34 y Ero1α agravará el estrés ER por la recuperación de la traducción y el aumento de los niveles de proteínas mal plegadas. En 22Rv1 células, el incremento más dramático de CHOP se produjo a la dosis de 15 mg /ml MFE. Coincidentemente, calnexina, una proteína de membrana del RE asegurar el control adecuado de plegado y la calidad, se redujo notablemente a los 15 mg /ml tratamiento MFE. Esto sugiere que 15 mg /ml MFE causó una posible ruptura del sistema de control de calidad de ER. Además, Perk, IRE1 y Bip todos se sometieron a un sorprendente aumento de 15 mg /ml tratamiento MFE. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que 15 mg /ml de MFE podría ser una dosis ideal para empujar el estrés ER del favor de la supervivencia a favor de la apoptosis en células de cáncer de próstata.
El siguiente paso era comprender si se MFE resultado de estrés ER en las células no cancerosas o si parece que hay un efecto selectivo hacia las células cancerosas. Para entender esto más, se aislaron las células epiteliales de la próstata a partir de dos sujetos humanos sometidos a prostatectomía radical. El efecto de la MFE se examinó en células benignas de la próstata primario epiteliales (PrECs) y 22Rv1 células. En contraste con líneas celulares de cáncer de próstata inmortalizadas tratados con MFE, que resultan en un aumento de la actividad PERK, PrECs mostró una disminución de PERK. Esta respuesta bifásica dependiente del tipo de célula ilustra aún más la complejidad de estrés ER en la carcinogénesis del cáncer de próstata. Tomados en conjunto, la evidencia sugiere que MFE dirigen selectivamente las células de cáncer de próstata sin dañar las células normales. Se requerirá una comprensión más amplia y detallada de este efecto diferencial.
Como hemos descrito anteriormente α-mangostin cuando se administra oralmente dado lugar a un tumor un 65% menor en 22Rv1 células [9]. En ratones implantados 22Rv1 tratados con MFE se observó un volumen del tumor 88% más pequeño en comparación con los ratones control. La dosis utilizada en este experimento fue 35 mg /kg de extracto de fruta de mangostán que se aproxima a 12 mg /kg de α-mangostin. Para entender si α-mangostin es el componente principal del extracto de la fruta de mangostán 22Rv1 células se trataron con 35 mg /kg y 70 mg /kg de α-mangostin. El régimen de tratamiento con sólo el α-mangostin representa un aumento de 300 a 600% en la exposición α-mangostin. Incluso a 70 mg /kg de α-mangostin, lo que resultó en un tumor 69% más pequeño, el fitoquímico puro no fue tan eficaz como MFE que contiene 12 mg /kg de α-mangostin (datos no publicados). En retrospectiva, esto no es sorprendente que como una mezcla de fitoquímicos son a menudo informado que tienen un efecto sinérgico que es superior a fitoquímicos individuales. Como se desprende de nuestra cromatograma hay una variedad de xantonas presentes en nuestro extracto, posiblemente mayor de 20 xantonas adicionales, lo que podría ser responsable de las propiedades anti-cáncer superiores de un extracto de mangostán en comparación con un xantonas individual.
la acumulación de la línea germinal y /o mutaciones somáticas en células resultados "normales" en una incapacidad para superar los puntos de control del ciclo celular y la apoptosis resultando así en la iniciación del cáncer. A medida que la proliferación de las células aumenta una mayor demanda en la maquinaria de proteínas de una célula debe adaptarse a través de diversos mecanismos que incluyen estrés del retículo endoplásmico. En nuestros estudios, hemos observado extracto de mangostán fruta estandarizada a alfa-mangostin para inducir selectivamente estrés ER en las células de cáncer de próstata que se correlaciona con un aumento en los índices de apoptosis. Curiosamente, en las células epiteliales normales de la próstata obtenidos de pacientes con alto riesgo de desarrollar cáncer de próstata MFE se observa para disminuir el estrés ER.