Extracto
inactivación epigenética de la cromatina desempeña un papel importante en la determinación del fenotipo celular tanto en células normales y cancerosas, pero nuestra conocimiento es todavía incompleta con respecto a cualquier potencial naturaleza monoallelic del fenómeno. Hemos genotipo ADN aislado de la cromatina de dos líneas de cáncer derivadas de colorrectales y un cultivo de células humanas normales intestinales epiteliales (HIEC), que se inmunoprecipitó con anticuerpos para acetilado vs. H3K9 histonas metiladas, y presentado los datos mientras que las diferencias de frecuencia B alelo más de polimorfismo múltiple de un solo nucleótido (SNP) los promedios móviles de las ventanas. [B alelo es un término arbitrario definido como uno de los dos alelos en cualquier SNP dado, denominados A y B]. Tres pruebas de validación diferentes confirmaron que las diferencias que muestran picos representados dominios monoallelic. Estas pruebas complementarias confirmaron los siguientes: 1) los genes en las regiones de alta frecuencia de los alelos B diferencias se expresaron monoallelically; 2) en las células normales todas las regiones de control de cinco impronta que llevaban heterocigotos SNPs se caracteriza por picos de diferencia de los alelos B; y 3) los haplotipos en los picos de diferencia de B alelo se mantuvieron fielmente en la cromatina inmunoprecipitada con los anticuerpos respectivos. En ambas muestras la mayoría de los dominios monoallelic fueron encontrados en los límites entre las regiones de la cromatina abierta y cerrada. Con respecto a la línea de cáncer, esto apoya el concepto establecido de conformación difusión, pero los resultados de las células normales fueron inesperados. Puesto que estas células eran policlonal, las estructuras monoallelic probablemente no fueron determinadas por elección aleatoria como ocurre en la inactivación del cromosoma X, por lo que proponen que la inactivación epigenética en algunos dominios pueden ser heredables y polimórficos en las células humanas normales
Cita.: di Paola D, J Raelson, Rampakakis e, M Basik, Zannis-Hadjopoulos M, Bradley WEC (2013) monoallelic cromatina conformación de flanqueo de largo Alcance Silenciado dominios en células derivadas del cáncer y normales. PLoS ONE 8 (5): e63190. doi: 10.1371 /journal.pone.0063190
Editor: Brian P. Chadwick, Universidad del Estado de Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Febrero, 2013; Aceptado: March 27, 2013; Publicado: 16 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Di Paola y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por becas de la Sociedad de Investigación del cáncer y los fondos internos del Centro del cáncer Goodman, de la Universidad McGill. DDP fue un beneficiario de una beca del Fonds de Recherche en Santé du Québec. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. John Raelson se hayan prestado servicios en Genizon Biosciences Inc., que no tenía ninguna influencia sobre el contenido editorial del manuscrito. Ninguno de los otros autores declaran ningún conflicto. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Control epigenético de la expresión génica es una fuente importante de variación fenotípica en el cáncer. A nivel cromosómico, este control se manifiesta por alteraciones en la conformación de la cromatina asociada con modificaciones de las histonas, como la metilación y /o acetilación de residuos de lisina en las colas N-terminales de las histonas, y con la metilación de residuos de C en las islas CpG ricas en o promotores de genes cercanos. Estas alteraciones se han utilizado ampliamente como marcadores para determinar el estado epigenético de un gen dado, y los recientes avances en la tecnología han permitido genoma evaluación de la inactivación epigenética en rangos megabase; ahora se piensa que estos cambios pueden propagarse a través de largos tramos [1]. Nuestro conocimiento en esta área es, sin embargo, incompleta por varias razones: primero, la isla CpG de metilación solamente da detalles de genes individuales que están asociadas con islas CpG, y esto sólo en los casos en que la inactivación de genes realmente se corresponde con el estado de metilación. En segundo lugar, si bien estos estudios recientes han demostrado que de hecho se pueden producir cambios epigenéticos en gran escala, se han llevado a cabo unos análisis exhaustivos de todo el genoma que comparan células normales y cancerosas derivadas.
Otro aspecto de este fenómeno que se ha mantenido relativamente sin explorar es el grado en que la inactivación epigenética puede estar restringida a un alelo. Dentro de las células normales, la inactivación de genes específica de alelo se sabe que ocurre en un número de loci, incluyendo los genes dentro de dominios de impresión (donde la elección de que se inactiva alelo es dependiente de la matriz de origen), la mayoría de los genes en un cromosoma X en células femeninas, receptores de olor, y en un número de genes implicados en la inflamación y la respuesta inmune (por [2]). Los mecanismos de control de algunos de estos eventos de inactivación parecen ser alterado en las células cancerosas, de forma que, por ejemplo, loci impresos se expresan a menudo en el cáncer de biallelically (revisado en [3]). Sin embargo, el grado en que la inactivación de novo monoallelic se produce en células de cáncer es desconocido. Los primeros trabajos por nosotros [4], [5] y por otros [6] indicó que en la línea de células de mamífero modelo CHO, inactivación monoallelic puede extenderse a un rango megabase de tal manera que la selección contra la expresión de un solo alelo en un locus produjo la supresión de un alelo en una segunda, vinculada locus. Tal propagación fue demostrado que se producen a alta frecuencia y no implicar la metilación de la isla CpG promotor asociado a por lo menos uno de los genes implicados [7]. Más recientemente, se ha demostrado que en alrededor de un medio de líneas celulares derivadas de tumores en los que RARB, un gen con efecto-tumor supresor, estaba completamente inactivada, el promotor de uno solo de los dos alelos fue metilado [8], de nuevo lo que sugiere un mecanismo de inactivación metilación independiente, que puede ser monoallelic en la naturaleza.
en este estudio, hemos utilizado antisueros frente a la histona H3 acetilada en K9 /14 (H3Ac) y la histona H3 tri-metilado en K9 (H3M) en el chip experimentos en dos líneas de cáncer colorrectal derivados (HCT116 y Colo205) y un cultivo de células epiteliales intestinales humanas (HIEC), que son no-inmortalizada y policlonal. Estas marcas de histona están asociados con la conformación de la cromatina abierta y cerrada, respectivamente, y fueron seleccionados de entre varios conocidos por estar asociados con la conformación en parte debido a las modificaciones son mutuamente excluyentes y puede haber una mayor probabilidad de que los datos serían inequívoca. Esto también simplifica la determinación de sesgo alélica en la conformación en cada SNP utiliza para determinar el genotipo de la ADN extraído de la cromatina inmunoprecipitada, ya que se podría calcular la diferencia de frecuencias de los alelos B determinados en cada SNP de los microarrays HAP550k. Como era de esperar, no se encontraron largas '' desiertos de genes que se caracteriza por tramos de la cromatina en general cerrado tanto en células normales y cancerosas. De interés, encontramos que la conformación monoallelic se localiza preferentemente en los límites de estos largos tramos de la conformación de la cromatina cerrado, lo que sugiere la difusión de la conformación inactiva (o activo).
Resultados y Discusión
Para generar imágenes a largo plazo de la conformación de la cromatina, los valores de intensidad de fluorescencia, expresados como cocientes LogR, se promediaron durante ventanas que comprenden 21 o más SNPs en movimiento, y representan frente a la posición cromosómica. Como era de esperar, en base a los datos proporcionados en el navegador UCSC epigenoma, regiones genómicas de genes de los pobres se caracterizan por tramos de baja LogR de la cromatina precipitada-anti-H3Ac y correspondientemente alta LogR para anti-H3M. Esto se ilustra en la fig. 1, que muestra un dominio de 15 Mb de CHR5 albergar menos de 10 genes, cinco de los cuales son miembros de la familia de las cadherinas. En las células normales (y menos frecuentemente, en las líneas celulares de cáncer), estas regiones fueron típicamente interrumpidos por pequeñas islas de conformación abierta marcados por los picos de la trama anti-H3Ac, reflejado por los canales de la trama anti-H3M. A veces, pero no siempre, éstos correspondían a los promotores de los genes raros en el dominio (Fig. 1,
CDH18
y
CDH9
y el fragmento de gen no caracterizado a 21,5 Mb, aguas abajo de
CDH12
). Los picos de estos dominios a menudo se aplanan en las líneas de cáncer derivados, y la trama se presentan en la Fig. 1 sugiere que el cambio de los límites de la derecha puede haber ocurrido tal que
CDH6
es cerrado en la cromatina en las células HCT116. Es posible que esta aparente desplazamiento es al menos algunas veces parte del proceso de la progresión tumoral (ver abajo).
valores trazados representan las lecturas medias de una ventana móvil 21-SNP. HCT116, una línea celular de cáncer colorrectal derivados; HIEC, las células epiteliales intestinales humanas normales. (Genes de la UCSC Genome Browser, hg18) A continuación se representan las parcelas LogR.
Los patrones de relaciones LogR para el conjunto de CHR9 se muestran en la Fig. 2, con la UCSC Genome Browser pantalla 'densa' de los genes en la parte inferior de cada segmento gráfico. Una vez más, los dominios de genes pobres (por ejemplo, los centrados alrededor de 10 Mb, 82 Mb, 105 Mb) se caracterizan por valores LogR bajos de anti-H3Ac interrumpidas por los picos localizados que son de vez en cuando aplanados en las líneas de cáncer (datos H3M no están incluidos en la parte principal de la figura por simplicidad). En el recuadro de la Fig. 2 se muestra un pico en CHR9 para los tres de las muestras de chip anti-acetilados con una depresión concomitante para los tres de los chips anti-metilados, consistente con nuestra expectativa de imágenes especulares en las parcelas LogR de las dos muestras inmunoprecipitadas. Sólo hay un gen de la región, C9orf123, cuyo extremo 5 'está muy cerca del máximo y el mínimo respectiva.
Los datos fueron tratados como se describe en la leyenda de la figura. 1. inserción, la región entre 7,7 Mb y 7,9 Mb, que muestra los picos de chip usando antisuero anti-acetilado vs. las depresiones de chip usando suero anti-metilado, coincidiendo con la región promotora de C9orf123. LogR parcelas de contra-metilado chip se han omitido de la figura principal para mayor claridad.
A continuación, determinamos los patrones de sesgo alélica en la conformación de la cromatina de las dos muestras de células diploides cercano (HCT116 y HIEC), expresado como la diferencia de frecuencia alelo B (BAF) entre las dos muestras de chip de media sobre 11-marcador de ventanas en movimiento (ver Métodos). Hemos encontrado más de 60 picos por encima de nuestra conservadora de corte de 0,35 (véase el texto en el archivo S1) que se extendió durante un máximo de 10 Mb en un tramo de la línea de cáncer derivado de HCT116. Se observaron unos 35 dichos picos en las células HIEC, la más ancha que cubre un alcance de unos 400 kb (anchura del pico a la mitad de la altura; ver la figura 3 para una visión general de varios cromosomas.) guía
Como se ha descrito. en el texto, para cada uno de los valores absolutos de SNP heterocigotos de diferencias BAF entre las dos muestras de chip se calcula y 11-marcador promedios móviles ventana a través de cada cromosoma se representaron. Azul, HCT116; coral, HIEC. Genes (UCSC Genome Browser) A continuación se representan las parcelas LogR.
Para validar estos datos hemos realizado ambas pruebas estructurales y funcionales (detalles en Métodos). En primer lugar, sobre la longitud de un pico de diferencia BAF una conformación relativamente cerrada debe extenderse ininterrumpida en un homólogo y una conformación abierta en el otro. Esto ha demostrado ser el caso en tramos de alta SNPs en desequilibrio de ligamiento (LD), ya que nos pareció perfecta concordancia entre haplotipo fase y la secuencia de los alelos enriquecidas en las respectivas muestras de chip (binomial p = 1,4 × 10
-45 para HCT116, 5,8 × 10
-11 para HIEC; los datos de las figuras S1 y S2 en S1 archivo).. En segundo lugar, se encontró que siete de los siete genes que residen en picos de diferencia BAF se expresaron monoallelically (Fig. S3 en File S1). En tercer lugar, hemos demostrado que cinco picos de diferencia BAF en HIEC, incluyendo el pico principal a 22,9 Mb del cromosoma 15 (Fig. 3), la correspondencia perfecta con regiones de control de impresión (ICR), los cortos monoallelically metilado secuencias de ADN que impronta directa (otra datos no mostrados). (Otros ICR nos preguntado eran homocigotos en HIEC). En general, las tres pruebas que hemos realizado gran medida la necesidad de que las diferencias BAF reflejan las auténticas diferencias alélicas en la estructura de conformación de la cromatina
.
Cuando las relaciones y diferencias LogR BAF de células HCT116 se representaron en conjunto se observaron dos patrones generales (véase la Fig. 4 que muestra ocho de los picos en el cromosoma 18, numerados I-VIII). Como era de esperar, algunos picos de diferencia BAF correspondían estrechamente con picos y /o valles de las respectivas muestras de chip aislados. Aquellos a los 35 Mb y 57 Mb (picos III y VIII) entran en esta categoría, junto con alrededor de una cuarta parte del resto de estos picos a lo largo del genoma. Tanto como dos tercios de los picos, sin embargo, se produjeron en los límites entre bajos y altos valores LogR, es decir, entre los dominios de conformación de la cromatina abierta y cerrada. Picos I, II, V - VII y quizás IV pertenecen a esta categoría (figura 4; el último es menos seguro debido a la homocigosis no informativa a caballo entre el pico.). En la mayoría de los casos las parcelas de diferencia LogR y BAF eran prácticamente superponibles sobre la región inmediata de interés, lo que indica que la divergencia entre los alelos comenzaron en el mismo punto como el comienzo de la transición de una conformación a la otra. Curiosamente, los límites coinciden con los picos de diferencia BAF eran por lo general aquellos para los que se observó un desplazamiento relativo de los ratios de LogR, como se ve por los picos I, VI y VII (el último es más pequeño, pero real, con una cilindrada de 100 kb). El límite en el pico II también se puede considerar como desplazados, por una distancia más larga de aproximadamente 2 Mb
.
Panel superior, las diferencias BAF en el conjunto del cromosoma 18 para HCT116. paneles inferiores, parcela de HCT diferencia BAF (rojo; la escala de la derecha) se superponen en parcelas de HCT y HIEC, relaciones LogR (escala izquierda) sobre el cromosoma 18 dominios indicados en el panel superior
. interpretamos como una indicación de que los dominios ya sea abiertas o cerradas se han extendido en estos límites y que la difusión era o bien monoallelic o producido en diferentes grados en los dos homólogos, generando de este modo un dominio de la conformación de la cromatina monoallelic. Las explicaciones alternativas son posibles, pero que favorecen el escenario de difusión, en parte porque parece fácil de imaginar un mecanismo de este tipo, para el que existe un precedente en células de mamífero en forma de X-inactivación difusión en la cromatina autosómica en los puntos de fusión de X-autosoma translocación [9].
también realizó el mismo análisis con los datos de las células HIEC. El cromosoma X no produjo diferencias BAF por encima del ruido de fondo (datos no mostrados), a pesar de H3K9 acetilación /metilación está implicada en X-inactivación [10]. Esta es la esperada para la inactivación aleatoria, teniendo en cuenta que las células son HIEC policlonal, y el resultado confirma que los eventos de inactivación al azar no se deben confundir nuestros resultados. Entre los autosomas, se juzgó 13/32 picos de diferencia BAF como correspondiente a la relación de LogR aislados picos /valles de muestras H3Ac /H3M chip. Sin embargo, el resto, que comprende una mayoría de los picos de diferencia BAF coincidió con límites entre abierto y cerrado conformación de la cromatina (ejemplos mostrados para el cromosoma 22 en la Fig. 5 con el pico II estar en la primera categoría y los otros que muestran efectos de cambio de límite monoallelic). Este fue un resultado inesperado, que, sin embargo consideramos que ser real, dado el rigor de nuestro proceso de validación. Nuestra interpretación de este efecto es como se describe anteriormente, a saber, que en los límites de conformación abierta /cerrada de la cromatina, un cierto grado de monoallelic difusión de conformación puede ocurrir.
Panel superior, las diferencias BAF en el conjunto del cromosoma 22 para HIEC . paneles inferiores, HIEC BAF parcela diferencia (rojas; escala de la derecha) superpuestos sobre HCT y HIEC, LogR proporciones parcelas (escala de la izquierda) sobre el cromosoma 22 dominios indicados en el panel superior
Para qué. podemos atribuir esta difusión aparente? La naturaleza policlonal de HIEC nos permite descartar algunas posibilidades. En primer lugar, es poco probable que sea debido a el mismo mecanismo que la expresión monoallelic generalizado descrito por Gimelbrant et al. [11], ya que este último ha demostrado ser aleatorio. Nos podemos descartar de manera similar la posibilidad de que los picos reflejan un estado precanceroso, como se ve con la metilación de genes supresores de tumores en el tejido normal de pacientes con cáncer, ya que esto también sería aleatoria con respecto a la elección del alelo. En cualquier caso, las células son HIEC fetal en origen y no inmortalizado [12], y por lo tanto, no se puede esperar, de tener alguna característica precancerosas. Otra interpretación, que, sin embargo, no está fuertemente apoyado por los datos, es que estos picos de diferencia BAF son previamente desconocidas dominios de impresión. La evidencia reciente de las búsquedas en todo el genoma sugiere que la mayoría de los auténticos dominios de impresión son ahora conocidos, por lo que dado su número (aproximadamente 20) y su presencia en los límites de la cromatina abierta-cerrada (a diferencia de los picos de impronta asociada que detectamos) esto parece poco probable, aunque esta cuestión no puede abordarse de forma inequívoca el uso de nuestro diseño experimental. Una interpretación que consideramos ser consistente con los datos es que las diferencias alélicas detectadas reflejan cambios epigenéticos constitucionales, es decir, que los picos monoallelic estarían presentes en todos los tejidos del individuo en cuestión. Estos fenómenos se han descrito para un número limitado de genes supresores de tumores, incluyendo
MGMT
[13], en el que se han encontrado estos genes para ser silenciado en las células somáticas normales, y se cree que resulta en un cáncer- predisponente fenotipo. Hay sugerencias en la literatura que estas 'epimutaciones constitucionales' puede ser de origen genético [14], [15]. Otros grupos han realizado estudios de asociación del genoma de expresión alélica [16] y se han encontrado muchos SNPs que se asocia con los niveles de expresión. En todos estos casos, el efecto monoallelic está restringido a un componente genético, tal como un SNP o el promotor de un solo gen. No hubo asociación particular, en estos estudios de expresión monoallelic con la conformación de la cromatina o con la proximidad a los desiertos de genes, por lo que aún se desconoce si los patrones de expresión monoallelic estos autores describen pueden coincidir con las que describimos.
Nuestro estudio abre nuevos caminos en dos aspectos. En primer lugar, se localiza una fuente significativa de estructura de la cromatina monoallelic a regiones inmediatamente adyacentes a los dominios de conformación de la cromatina cerrado. Como tal, se sugiere un mecanismo para este polimorfismo epigenética, que puede parecerse a una versión controlada de la difusión que nosotros y otros proponemos ser una fuente significativa de variación fenotípica en el cáncer. En segundo lugar, si nuestra interpretación es correcta, se plantea la posibilidad de un componente genético en esta fuente de variación epigenética. Se sabe que la impresión en el
IGF2R
sitio en chr6q es polimórfico, y tal vez pueden existir algunos elementos de control epigenético hereditario de la conformación de la cromatina, que se manifiestan como los dominios de conformación monoallelic que hemos documentado. Un fenómeno inexplicable, que puede estar relacionado es la herencia transgeneracional [17], en la que los factores genéticos influyen fenotipo en las generaciones sucesivas sin los genes que determinan directamente el fenotipo que se hereda. En cualquier caso, los aspectos novedosos de nuestros resultados pueden conducir a una comprensión más profunda de la herencia, y en este momento estamos investigando estos efectos aún más.
Métodos
Las células
HIEC- 6 son no inmortalizado las células epiteliales intestinales policlonales cultivadas a partir de una hembra de 20 semanas de embriones. Ellos fueron amablemente decoradas al paso 17 por Jean-François Beaulieu, y se cultivaron de acuerdo con procedimientos publicados [12]. Los experimentos se llevaron a cabo dentro de los 6 pasos de la recepción en nuestro laboratorio. HCT116 y Colo205 son líneas celulares de cáncer colorrectal derivados obtenidos originalmente a partir de ATCC, y se cultivaron en medio RPMI como se describió anteriormente.
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
El procedimiento seguido fue el descrito por [18] . Las células cultivadas en medio completo se lavaron con PBS precalentado y se tratan con formaldehído al 1% durante 10 minutos a las proteínas de entrecruzamiento y el ADN
in vivo
; a continuación, se lavaron y se rasparon en PBS helado y se resuspendieron en tampón de lisis (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, NaCl 140 mM, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM) suplementado con un comprimido completa inhibidor de la proteasa (Roche Molecular Biochemicals). Tras el paso a través de una aguja 21-G tres veces, se recogieron los núcleos, se resuspendieron en un volumen nuclear lleno de tampón de lisis, y se sonicaron hasta que fragmentos de ADN de & lt; 1 se obtuvieron kb. tamaño de la cromatina se controló mediante electroforesis. Inmunoprecipitación (IP) se llevó a cabo como se describe anteriormente, con las siguientes modificaciones: En pocas palabras, cizalladas lisados de cromatina (500 g) se pre-aclarado por incubación con 50 l de proteína A /agarosa G (Roche Molecular Biochemicals) para reducir el fondo causado por la adsorción no específica a las perlas, se incubaron durante 6 h con o bien 20 mg de anti-acetilado H3K9 /14 (Upstate), anti-trimetilada H3K9 (Upstate) o suero de conejo normal (NRS) a 4 ° C con rotación constante. Se añadió proteína A /G agarosa (50 l) y se incubó durante la noche a 4 ° C. Las perlas sedimentadas se lavaron sucesivamente dos veces con 1 ml de tampón de lisis durante 15 min cada uno a 4 ° C, seguido de 1 ml de WB1 (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, 0,1% de NP40, 0,05% de desoxicolato de sodio, tableta completa inhibidor de la proteasa), 1 ml de WB2 (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 0,1% de NP40, 0,05% de desoxicolato de sodio, completa comprimido inhibidor de la proteasa) y 1 ml de TE estéril. Las perlas se resuspendieron en 200 l TE /SDS al 1%, se incubaron a temperatura ambiente (RT) durante 15 min y se centrifugó a 3.000 r.p.m. durante 1 min a ta. La mitad del sobrenadante a continuación se incubó durante la noche a 65 ° C para revertir las reticulaciones, seguido de 100 g de proteinasa K a 55 ° C durante 2 h. El ADN fue purificado utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) y se eluyó en 100 l de TE.
Genotipado
ADN de HIEC y HCT116 se genotipo en los microarrays Illumina HAP550 por el servicio de genotipado de Genizon Biosciences Inc., de acuerdo con las instrucciones del fabricante y como se ha descrito [19]. ADN de Colo205 se genotipo en la matriz duo 1 M, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para dar cuenta de la diferencia en la fabricación de microarrays, multiplicamos las proporciones LogR de la matriz M 1 por 2,0 para la presentación con las parcelas generadas a partir de la matriz HAP550. Esto permitió que la presentación de las parcelas con una amplitud equivalente. microarrays de datos se depositan en Dryad. (doi: 10.5061 /dryad.43h8c)
El cálculo de las diferencias de frecuencia de alelos B
Hemos trazado de frecuencia B-alelo (BAF) diferencias contra posición cromosómica, la presentación de los datos en dos maneras. En primer lugar se calculó la desviación de la BAF de la preparación de control de la cromatina precipitado con suero de conejo normal para cada una de las dos muestras inmunoprecipitadas. La diferencia entre estos valores se calcula en cada SNP, el valor absoluto se derivó y 11-marcador de las medias móviles de ventana se representa frente a la posición cromosómica. En segundo lugar, para cada SNP simplemente restamos BAF para la muestra H3Ac de que para la muestra H3M (normalizado) y los valores absolutos de estas diferencias se promediaron durante 11 marcador de ventanas como anteriormente en movimiento y se representaron frente a posición. No había esencialmente ninguna diferencia entre los dos métodos de cálculo, y se presentan únicamente los datos obtenidos por el segundo de los dos métodos. Se realizaron tres pruebas para validar los resultados, tal como se describe en la siguiente sección.
Validación de los Picos de diferencia BAF como la representación alélica sesgo
Para validar estos datos hemos realizado dos pruebas estructurales y funcionales. En primer lugar, si los picos de diferencia BAF reflejan sesgo real alélica conformacional, a continuación, una conformación abierta debe extenderse sobre la longitud de la diferencia BAF en un homólogo y conformación cerrada en el otro. Por lo tanto, los patrones de diferencias BAF en las respectivas muestras de chip debe aparecer como haplotipos de uno o de otro homólogo. Nos pareció que los patrones sean perfectamente compatibles (binomial p = 1,4 × 10
-45 para HCT116, 5,8 × 10
-11 para HIEC; datos para varios bloques de LD dentro de dos picos se dan en el archivo S1, la figura 2 , Fig. 3). La segunda prueba de validación se basa en la expectativa de que dentro de un pico de diferencia BAF, sólo uno de los alelos lleva a un gen en conformación abierta, por lo que el patrón de expresión de este gen debe tienden a ser monoallelic. Las muestras de cDNA de siete genes en estas regiones que llevan cSNPs heterocigotos se ensayaron y se encontró que el enriquecimiento significativo o completa para un alelo (File S1, Fig. S3). La tercera prueba se basa en la expectativa de que al menos algunos de los picos de diferencia de BAF en células HIEC debe corresponder a dominios conocidos de expresión monoallelic en las células normales. Desde HIEC son policlonal, no hay que detectar cualquier sesgo de alelos en el cromosoma X o en otros loci sujeta a la inactivación aleatoria de alelos (Archivo S1); Sin embargo, en dominios de impresión, la inactivación alélica no es aleatoria, sino-matriz específica, por lo que todas las células en una población policlonal deben llevar la marca de impresión en el mismo alelo. Por consiguiente, encontramos cinco de los picos de diferencia HIEC BAF, incluyendo el pico principal a 22,9 Mb del cromosoma 15 (Fig. 3), corresponde precisamente con ICR (File S1). Todos los demás ICR nos consultan, incluido el control de la agrupación H19, son homocigotos en HIEC y por lo tanto no detectable.
Apoyo a la Información
Archivo S1.
texto de apoyo y figuras S1, S2 y S3. Figura S1. Validación que BAF picos de diferencia reflejan dominios contiguos en HCT116. Pensamos que si las diferencias BAF representados diferencias auténticas entre los dos homólogos, el material immunoprecitated por anti-Me debe principalmente derivarse de un homólogo, y que por anti-Ac principalmente de la otra a lo largo de la longitud de alta LD. Se encontraron dos regiones bajo el largo máximo de la diferencia en el BAF chr1 (panel superior) para los cuales los datos de HapMap mostraron muy alto LD (r
2 a lo largo de más de 0,9). La mayor frecuencia de los alelos se trazó para anti-Ac (azul) y anti-Me (corales) para cada SNP dentro del plazo identificadas de alto LD. Para cada SNP, el Ac anti-chip produjo un BAF superiores a los anti-Me chip, lo que indica perfecta concordancia entre haplotipos y material inmunoprecipitado. Figura S2. Validación que BAF picos de diferencia reflejan dominios contiguos en HIEC. Ver leyenda de la Figura S1. Se muestran tres regiones de alta LD en CHR7. Una vez más se observó concordancia perfecta entre el haplotipo y el material inmunoprecipitado. Figura S3. Validación de que BAF picos de diferencia representan dominios de expresión monoallelic en SPRY2 (al 80,1 Mb, chr13). ADN genómico y cDNA alrededor rs504122 (C /T heterocigótica en tanto HCT116 y HIEC) fueron amplificados de ambas líneas y secuenciados. Paneles superiores, ambos alelos se expresan en HIEC, sólo la C en HCT116. panel inferior, las diferencias BAF trazan para ambas líneas celulares, mostrando HCT116, pero no HIEC, con diferencias BAF
doi:. 10.1371 /journal.pone.0063190.s001 gratis (DOC)
Agradecimientos
los autores agradecen al Dr. Jean-François Beaulieu para proporcionar las culturas HIEC y el Dr. Patrick Dion para asistencia editorial.