Extracto
Antecedentes
neurregulina-1 ( NRG1) es un gen de susceptibilidad esquizofrenia putativo implicado ampliamente en el desarrollo del sistema nervioso central, así como la invasión del cáncer y la metástasis. El uso de un modelo de células B de linfoblastos, previamente demostrado deterioro de la migración mediada por NRG1α en células derivadas de pacientes con esquizofrenia, así como efectos de alelos de riesgo en NRG1 y catecol-O-metiltransferasa (COMT), un segundo gen implicado tanto en la susceptibilidad esquizofrenia y en el cáncer.
Metodología /Principales conclusiones
a continuación, examinamos la adhesión celular, un proceso componente esencial de la motilidad celular, usando un ensayo de adhesión celular mediada por la integrina basado en una interacción entre ICAM 1 y la integrina heterodímero CD11a /CD18 expresado en linfoblastos. En nuestro ensayo, NRG1α induce linfoblastos asumir diferentes niveles de adhesión que se caracteriza por fluctuaciones dependientes del tiempo en la firmeza de la unión. El alcance máximo de la variación en la adhesión de más de sesenta minutos se correlaciona fuertemente con la migración inducida por NRG1α (r
2 = 0,61). variación de adhesión inducida por NRG1α es bloqueado por erbB2, PI3K, y los inhibidores de Akt, pero no por PLC, ROCK, MLCK, o inhibidores de MEK, que implican a la /PI3K /Akt1 vía de señalización de erbB2 en, la adhesión celular mediada por la integrina NRG1 estimulada. En las líneas celulares procedentes de 20 pacientes con esquizofrenia y 20 controles normales, las células de los pacientes muestran una deficiencia significativa en el rango de adhesión inducida por NRG1α (p = 0,0002). En contraste, la respuesta de las células derivadas del paciente a forbol miristato acetato es irreprochable. El genotipo COMT Val108 /158Met demuestra una fuerte tendencia hacia la predicción de la gama de la respuesta inducida por la adhesión NRG1α con los homocigotos riesgo de haber disminuido la variación en la adhesión celular, incluso en sujetos normales (p = 0,063).
Conclusión /Importancia
Nuestros hallazgos sugieren que un mecanismo de la asociación genética con la esquizofrenia NRG1 puede implicar la biología molecular de la adhesión celular
Visto:. Kanakry CG, Li Z, Nakai Y, Sei Y, Weinberger DR ( 2007) neurregulina-1 regula la adhesión celular a través de un fosfoinositida-3 quinasa /Camino ErbB2 /Akt-dependiente: Implicaciones potenciales para la esquizofrenia y cáncer. PLoS ONE 2 (12): e1369. doi: 10.1371 /journal.pone.0001369
Editor Académico: Schahram akbarí, Universidad de Massachusetts Medical School, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Noviembre 2007; Aceptado: 5 de diciembre de 2007; Publicado: 26 Diciembre, de 2007
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financiación:. el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Salud Mental, NIH, siempre que la mayoría de los fondos, así como el laboratorio espacio en el que se llevaron a cabo estos experimentos. El Instituto NIH Programa de Becarios de Investigación Médico Howard Hughes también proporcionó financiación que apoya este proyecto de investigación. Ni el patrocinador estaba involucrado en el diseño o la realización de la propia investigación, la recopilación, el análisis o la interpretación de los datos, o en la preparación o revisión del manuscrito resultante
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no hay existen intereses en competencia.
Introducción
la visión actual predominante de la patogénesis de la esquizofrenia postula que es un trastorno del neurodesarrollo relacionado con factores genéticos que influyen en el desarrollo del cerebro y la plasticidad. [1] Entre los cada vez mayor número de genes de susceptibilidad a la esquizofrenia putativo es neurregulina-1 (NRG1), que se encontró primero en ser asociado con un mayor riesgo para la esquizofrenia en una población de Islandia [2] y posteriormente confirmado en varios estudios de otras poblaciones. [3] existe NRG1 en múltiples isoformas, todas las cuales contienen un factor de crecimiento epidérmico (EGF) -como dominio que puede señal a través de erbB2, erbB3, o receptores erbB4. [4] la mayoría de las isoformas existen NRG1 como proteínas de transmembrana que se cree que escindirse proteolíticamente, permitiendo que el dominio extracelular, similar a EGF para unirse a receptores erbB. [5] NRG1 está implicado en muchas funciones del neurodesarrollo clave, incluyendo la migración neuronal, la modulación sináptica, y el desarrollo de los oligodendrocitos. [4], [6] ya que estas funciones y otros regulados por NRG1 son al menos en teoría relacionada con el origen del desarrollo neurológico putativo de la esquizofrenia, NRG1 es un gen de susceptibilidad esquizofrenia biológicamente plausible. Sin embargo, el mecanismo biológico específico de su asociación genética con la esquizofrenia y su papel en la patogénesis de la enfermedad son desconocidos.
El uso de linfoblastos B como un modelo de células para estudiar los mecanismos moleculares básicos y asociaciones genéticas de un número de enfermedades humanas , incluidos los trastornos neuropsiquiátricos, se está convirtiendo cada vez más extendida. [7], [8], [9] La aplicación de este modelo para explorar la migración celular parece particularmente apropiado dado que las células neuronales e inmunes comparten muchas características moleculares y celulares comunes importantes para la motilidad celular . [10], [11], [12] por lo tanto, la caracterización molecular y asociaciones genéticas de la motilidad celular en las células de origen hematopoyético pueden dar una idea de los procesos celulares neuronales. En un trabajo reciente utilizando un modelo de células linfoblastos B, demostramos que linfoblastos B expresan receptores erbB2 y erbB3, y que las señales NRG1α a través de estos receptores a través de las vías PI3K /Akt y PLC con el fin de promover la migración quimiotáctica. [7] También encontramos que variación genética tanto en NRG1 y COMT previamente asociados con la esquizofrenia predijo la respuesta migratoria de estas células a NRG1, lo que sugiere un mecanismo celular potencial para la asociación genética a la enfermedad. En este estudio, examinamos la adhesión celular, un proceso componente fundamental implicada en la motilidad celular. Para ello, hemos desarrollado un ensayo de adhesión celular mediada por la integrina en placas de 96 pocillos sobre la base de una interacción entre ICAM-1 humana recombinante y su CD11a /CD18 receptor heterodímero integrina expresada en linfoblastos.
Las integrinas son una clase de receptores de la superficie celular que desempeñan papeles importantes en una amplia gama de procesos celulares y fisiológicos, que van desde el desarrollo embrionario a la inmunidad a la metástasis tumoral. [13], [14] Las integrinas formar receptores heterodiméricos, transmembrana que consisten en una subunidad α no covalentemente asociado con una subunidad β. Las integrinas median la señalización bidireccional, ayudando a integrar los procesos intracelulares con el medio extracelular. La unión de las integrinas a proteínas de la matriz extracelular o contrarreceptores presentes en otras células activa la llamada de señalización "de fuera hacia dentro" que promueve una variedad de procesos celulares, incluyendo la regulación de la supervivencia celular, la proliferación y la diferenciación. [15] Mientras tanto, quimioquinas y otra estimulación química de las células puede modular la capacidad de adhesión de las integrinas, la promoción de la llamada de aviso "dentro-fuera". [16], [17], [18], [19]
las integrinas también han sido implicados como jugar funciones clave en la mediación de la migración neuronal [20] y la formación de sinapsis y mantenimiento. Ellos juegan un papel crítico en una serie de procesos de desarrollo neurológico, incluyendo la adhesión neuronal de células precursoras, la migración en cadena, la diferenciación y la proliferación [21], [22] la regulación de las interacciones y promoción de la adecuada organización laminar cortical gliales neuronales-radial a través de interacciones con Reelina [23] correcta migración de neuroblastos tectales óptica en láminas específica; [24] adecuado desarrollo de la cresta neural; [25] cono de crecimiento neuronal de modulación filopodial; [26] la supervivencia de los oligodendrocitos; [27] y la dirección de la sinaptogénesis neuromuscular y la migración de las células de Schwann a la periferia. [28] Entre sus otros papeles en la biología sinapsis son la promoción de la maduración sináptica, [29] la mediación de la plasticidad sináptica, [30], [31] y la participación crucial en la LTP inducción [32] y la estabilización [33], [34], así como la memoria espacial. [32]
Debido a NRG1 y integrinas convergen en diversos procesos de desarrollo vinculados a la migración neuronal y de la biología y la sinapsis dados nuestros resultados anteriores relacionados con la migración celular mediada por NRG1, exploramos los efectos de la activación NRG1 de linfoblastos en la adhesión celular mediada por la integrina. Nos informan de que NRG1α induce diferentes niveles de adhesión celular que se caracteriza por fluctuaciones dependientes del tiempo en la firmeza de sujeción según lo medido con un ensayo de adherencia novela. El rango máximo de esta variación en la adhesión con el tiempo (en lo sucesivo abreviado como MRVA) se correlaciona altamente con la eficacia de la migración celular inducida por NRG1α, lo que indica que la medida MRVA tiene relevancia biológica, al menos en estas células. inducida por NRG1α MRVA depende de erbB2 PI3K de señalización //Akt. Además, la MRVA inducida por NRG1α es significativamente menor en linfoblastos B derivados de pacientes con esquizofrenia en comparación con los derivados de los controles normales. Por último, un polimorfismo de nucleótido dentro de la COMT, un gen implicado en la susceptibilidad tanto a la esquizofrenia y para el cáncer metastásico, demuestra una fuerte tendencia hacia la predicción de la MRVA de una línea celular dada, incluso en sujetos normales. En general, nuestros estudios muestran que la señalización de NRG1 activa maquinaria de adhesión en un proceso que se ve afectada en células derivadas de pacientes con esquizofrenia. Si estos hallazgos en las células inmunes se conservan en los procesos celulares neuronales, que argumentan que un mecanismo de la asociación genética NRG1 con la esquizofrenia implica la biología molecular de la adhesión celular.
Resultados
Los linfoblastos expresan integrinas homogéneamente
los linfocitos predominantemente expresar el heterodímero CD11a /CD18 integrina (α
L /β
2, que también se conoce como leucocitos función asociada de antígeno-1 o LFA-1). [35] Se utilizó citometría de flujo para ensayar la expresión de la integrina línea de base y para comparar la expresión entre las líneas celulares derivadas de pacientes con esquizofrenia en comparación con los controles normales. Todas las líneas celulares ensayadas expresan CD11a (fluorescencia corregida mediana, 14,018 ± 0,968) y CD18 (14.336 ± 1.019), a excepción de una línea celular derivada del paciente. Esta línea celular fue excluido de todo más pruebas y comparaciones estadísticas. No hubo diferencia significativa entre las líneas celulares derivadas de pacientes o controles en la expresión de cualquiera de CD11a (pacientes (n = 23), 13.479 ± 1.364; los controles (n = 35), 14.790 ± 1.303; p = 0,5046) o CD18 (pacientes (n = 23), 14.215 ± 1.633; los controles (n = 35), 14.832 ± 1.291; p = 0,7667). Correlación de CD11a con la expresión de CD18 (regresión lineal (n = 58), r = 0,806; r de Fisher para z, p & lt; 0,0001) fue consistente con la conclusión de que CD11a y CD18 principalmente estaban formando heterodímeros con los demás. Por lo tanto, estos datos demuestran que nuestras líneas celulares de linfoblastos expresan las integrinas CD11a /CD18 y que la expresión diferencial de línea de base de estas integrinas no es un factor importante en las diferencias en la migración [7] o de adhesión (véase más adelante) de linfoblastos derivados del paciente.
NRG1α induce variación temporal de adhesión celular
Los experimentos iniciales con nuestro ensayo de adhesión sugerido que la adhesión tenía una dependencia del tiempo. Por lo tanto, se realizaron experimentos de tiempo en el que linfoblastos fueron expuestos a NRG1α o acetato de forbol miristato (PMA) en placas de ICAM-revestido, ya sea para 15, 30, 45, o 60 minutos, y luego las placas se lavaron para eliminar las células que no eran firmemente adherente. PMA se utilizó como control positivo, ya que promueve la unión celular mediante la activación de PKC directamente. Para cada línea celular, las células se sometieron para el mismo tiempo de exposición a las placas de ICAM-recubierto en ausencia de NRG1α o PMA. La variación en los datos del archivo adjunto NRG1 cruda (Figura S1) y en la relación de NRG /vehículo a través del tiempo (Figura 1, Figura S1, Figura S2, y la Figura S3) indicó que las células NRG1α-estimulada como una población fluctuaban entre los estados de relativamente más firme y la unión más débil en comparación con la adhesión de control de línea de base. Con el fin de cuantificar la variación observada en la adhesión celular, definimos el alcance máximo NRG1 inducida de la variación de la adhesión (MRVA) como la relación máxima NRG /vehículo menos la relación /vehículo mínimo NRG de los cuatro puntos de tiempo (Figura 1).
En respuesta a la estimulación NRG1α con el tiempo, las células de una línea celular dada como una población fluctúan entre los estados de desprendimiento relativa y estados de la unión relativa. Con el fin de comprobar la fiabilidad de estos patrones, diez líneas de células en dos días separados fueron probados mediante nuestro ensayo de adhesión. Se muestran dos ejemplos representativos. Si bien el tiempo de picos y valles varió entre carreras, el rango máximo de adherencia variable (MRVA) fue notablemente coherente (p = 0,016). se muestra el cálculo de la MRVA para cada ejecución de cada línea celular.
El rango máximo de variación de la adhesión (MRVA) parece característico de cada línea celular
Para seguir haciendo frente a la fiabilidad de estos patrones, se realizó repitieron los ensayos de adhesión de diez líneas celulares en dos días separados. Se seleccionaron estas diez líneas para proporcionar un espectro de valores MRVA en ambas líneas celulares de pacientes y de control, incluyendo alta, media, y los bajos niveles de variación. claros patrones de variación de la adherencia con el tiempo se observaron en ambos días, y aunque el patrón real varió entre repetición carreras en términos de los tiempos específicos que definen el rango de adherencia, el rango de respuestas de adhesión observados (es decir, la medida MRVA) fue altamente reproducible (correlación de Spearman rango (n = 10), rho = 0,806, p = 0,016) (Figura 1).
El MRVA de la adhesión celular inducida por NRG1α predice la migración inducida por NRG1α
El MRVA una correlación positiva y altamente significativa con el grado de migración quimiotáctica en respuesta a NRG1α (regresión lineal (n = 37), r
2 = 0,6065; r de Fisher para z, p & lt; 0,0001) (Figura 2), utilizando datos de la migración nos han informado anteriormente en las mismas líneas celulares. [7] (Tres líneas celulares que fueron utilizados para los estudios de adhesión carecían de datos de migración y por lo tanto no se incluyeron en esta comparación.) Estos datos sugieren que la medida MRVA tiene significado biológico más amplio, al menos a estas células. Aunque la correlación no indica causalidad, un estado adhesivo variable es un mecanismo biológicamente plausible y necesaria para la migración celular.
los datos de adhesión se compararon con los datos disponibles se reunieron un año antes de la migración inducida por NRG1α de esas mismas líneas celulares.
Definición de las medidas de resultado
dada la fiabilidad de la MRVA dentro de una línea celular y su importancia biológica aparente, la MRVA se estableció en este punto que la medición depende primaria para todos los futuros experimentos de adhesión. Además, se han definido varias otras medidas dependientes y se utilizan para el estudio de los efectos de los inhibidores de la vía de señalización. otras dos medidas de rango se definen como sigue: 1) ICAM-solamente MRVA, que se calcula a partir de las células de control solo (máximo menos mínimo de los cuatro puntos de tiempo), y representa los efectos de la señalización endógena y /o la presencia de sí mismo ICAM en la modulación de la adhesión que varía con el tiempo, y 2) PMA /vehículo MRVA, que se calcula de forma análoga a NRG /vehículo MRVA y representa la variación en la adhesión celular con el tiempo en respuesta a la estimulación con PMA. Una medida de la unión neta de referencia también se define como sigue: efecto ICAM, que es el promedio de los cuatro valores de fluorescencia de ICAM y representa la "pegajosidad" general o estado adhesión relativa de las células de control al inicio del estudio significar. En situaciones en las que un inhibidor de efectos tanto en la línea de base y la adhesión inducido por productos químicos ejercida, la media NRG y los valores de fluorescencia de PMA medios fueron analizados para distinguir los efectos en el numerador contra el denominador de la media NRG /vehículo o significa relaciones de PMA /de vehículos.
NRG1α media sus efectos sobre la adhesión celular a través de erbB2 señalización
previamente hemos demostrado que la migración mediada por NRG1α de linfoblastos era dependiente de la señalización de erbB2; Por lo tanto, si la prueba de estimulación erbB2 estaba involucrado en el mecanismo de adhesión celular inducida por NRG1α mediante el tratamiento de las células con el AG825 inhibidor selectivo de erbB2. AG825 exhibió un efecto significativo dependiente de la dosis en la amortiguación MRVA de adhesión inducida por NRG1α (ANOVA, F (3,4) = 23,358, p & lt; 0,0001). (Figuras 3)
Administración de AG825 en vehículo DMSO (n = 5) causado un robusto disminución, dependiente de la dosis en el MRVA inducida por NRG1α. En comparación con el control del vehículo, ** representa p & lt; 0,01 y **** representa p & lt; 0,0001. En comparación con la dosis baja, + representa p & lt; 0,05 y +++ representa p. & Lt; 0,001
señalización de PI3K es esencial para mediación NRG1α inducida por la adhesión celular variando
Para hacer frente a la papel de PI3K señalización en el efecto de adherencia inducida por NRG1α, se estudió la wortmanina inhibidor de PI3K irreversible. Las dosis utilizadas fueron todos muy por debajo de las concentraciones en el que la wortmanina reacciona de forma cruzada con MAPK, miosina quinasa de cadena ligera (MLCK), o phosphoinositide-4 de señalización quinasa en un esfuerzo para dirigirse específicamente a la señalización de PI3K. Wortmanina exhibió una,, efecto significativo de amortiguación dependiente de la dosis en el /MRVA NRG vehículo (ANOVA, F (3,4) = 17,208, p & lt; 0,0001). (Figura 4) sin efectos sobre la línea de base o de adhesión inducida por PMA
Wortmannina vehículo en DMSO (n = 5) exhibió un efecto amortiguador fuerte, dependiente de la dosis en la medida /MRVA vehículo NRG. En comparación con el control del vehículo, * representa p & lt; 0,05, ** representa p & lt; 0,01, y **** representa p & lt; 0,0001. En comparación con la dosis baja, + representa p & lt; 0,05 y p representa ++. & Lt; 0,01
Akt inhibición de PI3K imita inhibición y amortigua la adherencia inducida por NRG1α efecto
El inhibidor de Akt X inhibe selectivamente la fosforilación de Akt con efectos mínimos sobre la PI3K, PDK1, o la señalización SGK1. Los efectos de esta droga reflejan los resultados de la inhibición de PI3K con una, la reducción dependiente de la dosis significativa de NRG MRVA /vehículo (ANOVA, F (3,4) = 4,709, p = 0,0214) (Figura 5a) y no hay efectos sobre ICAM solo o MRVA PMA /vehículo. A diferencia de con la inhibición de PI3K, la inhibición de Akt se asoció con una reducción significativa de la unión media de ICAM-solo (ANOVA, F (3,4) = 6,711, p = 0,0086) (Figura 5b). Sin embargo, esta reducción sólo se observó en la dosis más alta (p = 0,0033). Este mismo efecto se observó también en la reducción significativa de los valores brutos de fluorescencia NRG en la alta dosis única (ANOVA, F (3,4) = 11,639, p = 0,0007), sin tendencia clara en otras dosis. Teniendo en cuenta este efecto común en medio de ICAM-solo y significa unión NRG exclusivamente a la dosis alta, puede representar una reacción cruzada del inhibidor a concentraciones elevadas con otra vía de señalización importante para el mantenimiento de un estado adhesivo.
Administración inhibidor de la Akt X en el vehículo de agua (n = 5) causado una disminución dependiente de la dosis en el MRVA NRG /vehículo (a). A diferencia de la inhibición de PI3K, la inhibición de Akt se asoció con una reducción estadísticamente significativa en la media de ICAM (B) y la media de NRG (no mostrado) los valores de fluorescencia primas a la dosis alta única sin tendencia a dosis más bajas. En comparación con el control del vehículo, * representa p & lt; 0,05 y ** representa p & lt; 0,01. En comparación con la dosis baja, + representa p & lt; 0,05 y p representa ++. & Lt; 0,01
Rho quinasa no es esencial para los efectos de adhesión inducida por PMA NRG1- o
Desde Rho es también aguas abajo de PI3K y se ha implicado en los mecanismos de adhesión celular, [36], [37] que era importante investigar si Rho juega un papel en la adhesión celular inducida por la NRG1. Sin embargo, no existen, inhibidores de la Rho específicos de células permeables disponibles, por lo que se utilizó la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) inhibidor de la Rho-quinasa Inhibidor IV. Este inhibidor de la roca no tuvo ningún efecto significativo en ninguno de los parámetros de adhesión examinado, y así la señalización de rock no parecen jugar un papel crítico en la modulación de la línea de base, inducida NRG1, o PMA inducida por la variación de la adhesión.
señalización de MEK es no es esencial para la adhesión celular inducida por NRG1 efecto
el PD98059 inhibidor de MEK selectiva no tuvo efecto en ninguno de los parámetros de adhesión a cualquier dosis (no mostrado). Esto sugiere que incluso se MEK de señalización implicadas en estos procesos, no es esencial para la adhesión de línea de base o NRG1- o la adhesión mediada por PMA.
señalización de la fosfolipasa C es necesaria para el mantenimiento de un estado adhesivo en general
Como PI3K, el U73122 inhibidor de PLC también causó una reducción significativa en el MRVA inducida por NRG1α (ANOVA, F (3,4) = 4,186, p = 0,0304) (Figura 6a), pero el efecto de este inhibidor parecía ser una reducción global de la unión de células en general, y no un /efecto erbB2 dependiente NRG1. Tanto la variabilidad de referencia (ICAM-solo MRVA) (ANOVA, F (3,4) = 8,883, p = 0,0023) y la línea de base significa de fijación (media de ICAM-solo) (ANOVA, F (3,4) = 4,915, p = 0,0186 ) disminuyó después de la exposición a U73122 (Figuras 6b y c, respectivamente). Sin embargo, el cambio en la media ICAM-solo fue significativa sólo en la dosis más alta (p = 0,0155) (Figura 6c). Del mismo modo, los valores de fluorescencia NRG y PMA medias primas tuvieron disminuciones significativos sólo a la dosis más alta (NRG: ANOVA, F (3,4) = 8,672, p = 0,0025; PMA: ANOVA, F (3,4) = 4,736, p = 0,0210). Es importante señalar, sin embargo, de que ni la media NRG /vehículo (Figura 6d) ni la media PMA /vehículo (Figura 6e) proporciones fueron significativamente diferentes a través de las dosis, lo que indica que la inhibición de PLC está afectando a la señalización celular común a través de estas vías a una grado similar independiente del agente estimulador. Por lo tanto, aunque el inhibidor de PLC hizo ejercer un efecto significativo en la reducción de la NRG /vehículo MRVA, esto probablemente se debió a la reducción de la adhesión general y la constricción de la gama de la respuesta potencial, en vez de a la inhibición específica de una vía NRG1 /erbB2-dependiente.
Mientras que el U73122 inhibidor de PLC en el vehículo etanol (n = 5) causó una reducción significativa en NRG MRVA /vehículo (a) y una tendencia hacia la reducción de PMA MRVA /vehículo (no se muestra), que ejerció una efecto mucho más fuerte sobre amortiguación MRVA línea de base debido a la presencia de ICAM y la señalización endógena sola (B). Además, a alta dosis, que provocó una reducción significativa en la unión de ICAM la línea de base (C) y en la media de NRG y el apego PMA (valores de fluorescencia en bruto) (no mostrado). Sin embargo, la media de NRG /vehículo (D) y la media de PMA /vehículo (E) no se modificaron significativamente. En comparación con el control del vehículo, * representa p & lt; 0,05 y ** representa p & lt; 0,01. En comparación con la dosis baja, ++ representa p & lt; 0,01 y +++ representa p. & Lt; 0,001
cadena ligera de la miosina de señalización (MLCK) quinasa es importante para la adhesión de línea de base
Dado la importancia conocida de MLCK en la promoción de fijación, el inhibidor de MLCK ML-7 se utilizó para examinar sus efectos en nuestros diversos parámetros de adhesión. Como era de esperar, el efecto principal de la inhibición MLCK una disminución dependiente de la dosis en la media de fijación de ICAM-solo (ANOVA, F (3,4) = 17,601, p & lt; 0,0001) (Figura 7a). Sin embargo, no hubo cambios en los valores de fluorescencia en bruto de PMA (ANOVA, F (3,4) = 0,381, p = 0,7686) (Figura 7b) o NRG (ANOVA, F (3,4) = 0,322, p = 0,8095 ) (Figura 7c). No se observaron efectos significativos en cualquiera de los tres parámetros MRVA. También es importante destacar que los efectos observados por PLC frente a la inhibición MLCK no eran idénticos. la inhibición de PLC provocó un descenso en los valores de fluorescencia primas NRG y PMA, lo que sugiere su amplia importancia a múltiples vías comunes de adherencia. En contraste, la inhibición MLCK pareció ejercer un efecto restringido a la línea base de adhesión ICAM sin efectos sobre los valores de fluorescencia NRG o PMA medias primas.
administración del inhibidor de MLCK ML-7 en el vehículo DMSO (n = 5) causado una reducción significativa en la unión de línea de base en el medio y dosis altas (a). Aunque esto se asoció con aumentos en los valores medios de NRG /vehículo y PMA /vehículo (no se muestra) significa, estos efectos fueron más que una consecuencia de la reducción en el denominador ya que tanto los PMA (B) y NRG (C) los valores de fluorescencia primas se mantuvieron sin cambios. En comparación con el control del vehículo, ** representa p & lt; 0,01 y *** representa p & lt; 0,001. En comparación con la dosis baja, +++ representa p & lt; 0,001 y ++++ representa p & lt; 0,0001
adherencia variable inducida por NRG1α se amortigua en linfoblastos derivados de pacientes con esquizofrenia
Dada nuestra observación anterior de que linfoblastos obtenidas de pacientes, mostraron una respuesta migratoria a menos robusto NRG1α y la correlación actual entre nuestras medidas de migración y adhesión, predijimos que habría también una diferencia MRVA entre pacientes y controles. De hecho, la NRG /vehículo MRVA fue significativamente menor en linfoblastos derivados de pacientes en comparación con los derivados de los controles normales (los pacientes (n = 20), 0.520 ± 0.045; los controles (n = 20), 0,780 ± 0,044; p = 0,0002) ( Figura 8a y c). En contraste, la respuesta PMA fue similar entre los grupos, lo que indica que los linfoblastos derivados del paciente todavía conservaban la capacidad para mediar en la adhesión celular robusto, pero no fueron capaces de hacerlo adecuadamente en respuesta a NRG1α. Se realizó una serie de experimentos de dosis-respuesta de PMA para descartar la posibilidad de que la falta de diferencias entre los grupos era un fenómeno sensible a la dosis; estas pruebas mostraron formas de onda casi idénticos en todos los sujetos a todas las concentraciones ensayadas (Figura S2), lo que sugiere además que la respuesta PMA fue normal en las líneas celulares derivadas del paciente. Es importante señalar que PMA también indujo niveles variables de adhesión en nuestro ensayo, similar a pero más extremas que la de NRG1α. Tanto la medida MRVA de adhesión inducida por PMA (pacientes (n = 20), 1.561 ± 0.217; los controles (n = 20), 1.356 ± 0.121; p = 0.4124) (Figura 8b) y la media PMA /vehículo (pacientes (n = 20), 2.083 ± 0.120; los controles (n = 20), 1,980 ± 0,085; p = 0,4840) no fue diferente entre las células derivadas del paciente y derivado de control. No hubo diferencias en la unión ICAM media entre las células derivadas del paciente y derivado de control en la condición de no estimulado ICAM-solo.
El NRG /vehículo MRVA fue significativamente menor en linfoblastos derivados de pacientes en comparación con los derivados de la normalidad controles (A). PMA /vehículo MRVA fue similar entre las líneas celulares de control derivado de (B) y el derivado del paciente. No parecía el deterioro relativo de células derivadas de pacientes que ser aislado de instalación o la desinstalación, pero era indicativo de una respuesta más constreñido en general con menos variación de adherencia inicial en respuesta a NRG1α (C). *** Representa p. & Lt; 0,001
genotipo COMT predice el rango de variación en la adhesión inducida por NRG1α
Teniendo en cuenta la relación de polimorfismos de nucleótido único en la COMT (Val108 /158Met, rs4680 ) y en NRG1 (rs6994992) para la migración celular inducida por NRG1α establecido con anterioridad, [7] que trata de determinar si la adhesión celular inducida por NRG1α también mostró este tipo de asociaciones. La presencia del alelo COMT val riesgos asociados a la esquizofrenia mostró una fuerte tendencia hacia la predicción más pequeño MRVA inducida por NRG1α en toda la muestra con efectos similares en ambos grupos (prueba t no pareada, p = 0,0632) (Figura 9a). ANOVA realizado con el grupo de diagnóstico y el genotipo como factores independientes revelaron ninguna interacción genotipo de diagnóstico para cualquiera de estos genes. Además, no hubo ningún efecto de COMT genotipo en MRVA inducida por PMA (no apareado t-test, p = 0,8727). Debido a la frecuencia del alelo menor baja en rs6994992 NRG1, nuestro estudio tuvo poco poder estadístico para detectar una asociación con este SNP.
COMT, un gen de susceptibilidad putativo para la esquizofrenia y el cáncer metastásico, previamente fue demostrado tener efectos genotipo sobre la migración de células con el genotipo de riesgo rs4680 V /V que muestra la migración más deteriorado. En nuestros datos de adhesión (n = 40), hubo una fuerte tendencia (p = 0,0632) a la disminución de NRG1α inducida MRVA de homocigotos de riesgo en comparación con los homocigotos no de riesgo (no se mantienen las líneas celulares heterocigoto).
Discusión
Hemos presentado una serie de estudios que proporcionan evidencia de que la activación NRG1α de linfoblastos B induce una respuesta de variación temporal de adhesión de células que está mediada por la vía de erbB2 /PI3K /Akt1 y que es anormal en las células derivados de los pacientes con esquizofrenia y afectados por la COMT Val /met genotipo. A nuestro entender, estos son los primeros datos que muestran que NRG1α induce adjunto en linfoblastos B en un ensayo de adhesión celular, revelando la fluctuación dependiente del tiempo en la adhesión red. En nuestros estudios, la MRVA de esta respuesta de adhesión inducida por NRG1α tiene relevancia biológica de manifiesto en que predice tanto el grado de la respuesta de la migración de células a NRG1α así como las diferencias entre los casos de esquizofrenia y sujetos de control normales. A su vez, la propia MRVA se puede predecir por un polimorfismo de nucleótido dentro de COMT, que también está implicada en el cáncer metastásico. Mientras exógeno NRG1α aumenta la expresión de la superficie celular de la integrina CD18 (Figura S4), la naturaleza estable de este efecto con el tiempo sugiere que esta expresión de la superficie aumentado no es directamente responsable de la mediación de la respuesta de adhesión temporalmente variable. Más bien, esta respuesta de adhesión inducida por NRG1α depende de señalización a través de las vías de erbB2, PI3K y Akt. PLC y MLCK de señalización también juegan un papel en la adhesión, pero no ejercen efectos NRG1α-específicas.
Consideraciones metodológicas
A medida que la variación dependiente del tiempo en la adhesión celular en respuesta a NRG1 es el fenómeno crítico en la que el trabajo descrito en este documento se basa, es importante validar que esta variación representa un efecto biológico real y no es simplemente "ruido". de hecho, se podría argumentar que, dado que nuestra medida se basa en una población de células que probablemente es no homogéneo con respecto a los estados de fijación, las fases del ciclo celular, y otros fenómenos biológicos, la MRVA es más probable al azar que no. Hemos llevado a cabo una serie de experimentos detallados que demuestren de manera convincente y consistente que esta adhesión que varía no es aleatorio: específicamente, 1) determinados patrones temporales de la unión y separación, aunque no es intrínseca a la propia célula no estimulada, parecen estar relativamente conservadas cuando las células de la misma línea celular en las mismas condiciones al mismo tiempo son sometidos a estímulos específicos que cambian su estado de sujeción (Figura S2); 2) la MRVA es muy fiable dentro de una línea celular estudiado en repetidas ocasiones en días diferentes (Figura 1); 3) la MRVA se ve afectada de una manera dependiente de la dosis por diversos inhibidores de la vía de señalización pertinentes (Figuras 3-7);