Extracto
Antecedentes
nimotuzumab es un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado dirigido específicamente a EGFR. En este estudio, que tuvo como objetivo investigar los mecanismos moleculares de nimotuzumab en sus efectos de mejorar la radiosensibilidad de las células cancerosas.
Principal Encontrar
pulmón A549 células cancerosas y las células de cáncer de mama MCF-7 fueron pretratados con o sin nimotuzumab durante 24 h antes de la radiación para llevar a cabo el ensayo de supervivencia clonogénico y para analizar la apoptosis de las células por ctyometry flujo. focos γ-H2AX fueron detectados por microscopía confocal para evaluar el efecto de nimotuzumab en la radiación inducida por la reparación del ADN. la activación del EGFR se examinó y los niveles de proteínas relacionadas con el daño de reparación del ADN en las células A549 en diferentes puntos de tiempo y en las diferentes dosis de exposición después del tratamiento nimotuzumab y la radiación se examinaron mediante transferencia Western. El pretratamiento con nimotuzumab redujo la supervivencia clonogénica después de la radiación, la activación de EGFR inducida por la radiación inhibida y aumenta la apoptosis inducida por radiación en ambas células A549 y células MCF-7. Los focos de γ-H2AX 24 h después de la radiación aumentó significativamente en las células nimotuzumab pretratado con diferentes dosis. La fosforilación de AKT y la DNA-PKcs se inhibió notablemente en el grupo de combinación en cada punto de dosis, así como punto de tiempo.
Conclusiones
Nuestros resultados revelaron que el posible mecanismo de mejora de la nimotuzumab cáncer radiosensibilidad es que nimotuzumab inhibe la activación inducida por la radiación de la DNA-PKcs través del bloqueo de la vía PI3K /AKT, que en última instancia afecta a la reparación del ADN DSB
Visto:. Qu Yy, Hu Sl, Xu Xy, Wang Rz, Yu Hy, Xu Jy, et al. (2013) nimotuzumab Mejora la radiosensibilidad de las células cancerosas in vitro por la inhibición de reparación de daño del ADN inducido por la radiación. PLoS ONE 8 (8): e70727. doi: 10.1371 /journal.pone.0070727
Editor: Xianglin Shi, Universidad de Kentucky, Estados Unidos de América
Recibido: 4 Enero, 2013; Aceptado: 18 Junio 2013; Publicado: 16 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Qu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la radioterapia juega un papel importante en el tratamiento de varios tipos de cáncer con. intención curativa o paliativa. Aproximadamente el 50% de los pacientes que sufren de cánceres necesita radioterapia largo de su proceso de tratamiento. Sin embargo, la tasa de control de la enfermedad y la supervivencia de los pacientes que reciben radioterapia sola o en combinación con quimioterapia siguen siendo desalentadoramente baja. agentes citotóxicos tradicionales con función radiosensibilizador a menudo aumentan simultáneamente la toxicidad tejido normal, lo que limita su aplicación clínica cuando se combina con radioterapia. Recientemente, las terapias dirigidas a receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) han mostrado excelentes efectos contra el cáncer con efectos adversos y ligeramente radiosensibilidad cáncer significativamente mayor en los estudios preclínicos y clínicos [1], [2]. Las terapias dirigidas EGFR en combinación con la radioterapia ha sido considerada como una estrategia muy potencial para el tratamiento de algunos cánceres de origen epitelial
EGFR terapias específicas consisten principalmente de dos enfoques:. 1) anticuerpos monoclonales (mAb) que se dirigen al dominio extracelular del receptor en la región de unión al ligando, es decir, cetuximab, nimotuzumab y panituzumab; o 2) moléculas pequeñas que inhiben la actividad de tirosina quinasa intracelular de EGFR, tales como gefitinib y erlotinib [3]. La mayoría de estos agentes han sido ampliamente estudiados
in vitro
y
in vivo
en su capacidad de aumentar la radiosensibilidad del tumor. Mediante el bloqueo de la activación del EGFR y su señalización aguas abajo, tales como las vías PI3K-AKT y RAS-MAPK, estos agentes anti-EGFR mejorar el efecto citotóxico de la radiación ionizante mediante la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis y la inhibición de la proliferación celular, la metástasis y la angiogénesis tumoral [ ,,,0],4], [5].
Nimotuzumab es un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado que bloquea EGF, TGF-α y otros ligandos de unión a EGFR, así como obstaculizar el receptor de la exposición de su motivo de dimerización [6]. Nimotuzumab se une a EGFR con una afinidad de unión moderada (Kd: 4,5 × 10
-8 m) en comparación con cetuximab, que tiene una afinidad de unión de más de 10 veces mayor [6]. Estudios
in vitro han demostrado que
nimotuzumab une bivalente (es decir, con los dos brazos de anticuerpos frente a dos objetivos simultáneamente) a EGFR con moderada o alta densidad, que es el patrón estable de unión [7], [8]. En los tejidos normales con baja densidad de EGFR, nimotuzumab tiene menos afinidad y se une con menos avidez EGFR, que perdona a los tejidos normales, incluyendo la piel y las mucosas, de la citotoxicidad severa. Esto explica por qué nimotuzumab se caracteriza por leves toxicidades relacionadas con el tratamiento en la aplicación clínica al tiempo que muestra efectos anticancerígenos similares o superiores en comparación con otros anticuerpos monoclonales anti-EGFR. Como un anticuerpo monoclonal terapéutico prometedor, nimotuzumab combinada con radiación está siendo estudiado ampliamente en su eficacia de tratamiento de los cánceres de origen epitelial.
Nimotuzumab se ha demostrado para mejorar selectivamente los efectos antitumorales de la radiación de las líneas celulares de NSCLC ionizante con alta EGFR expresión [9]. Además, un estudio in vivo en xenoinjertos de ratones transplantados con una línea celular de glioma mostró que tanto nimotuzumab y cetuximab aumentaron radiosensibilidad de los tumores subcutáneos trasplantados [10]. En la fase II /III de ensayos clínicos, nimotuzumab combinada con radioterapia ha logrado excelentes resultados en el tratamiento de cánceres localmente avanzados de cabeza y cuello [11], [12]. Se ha informado de que el cetuximab inhibe EGFR translocación nuclear inducida por la radiación, y este proceso está asociado con la supresión de la actividad de DNA-PKcs [13], [14]. Otros estudios han demostrado que los inhibidores de tirosina quinasa mejorar la radiosensibilidad por la supresión de la capacidad celular de ADN de reparar el daño inducido por la radiación [15], [16]. Estos resultados indican que el tratamiento con anticuerpos monoclonal terapéutico combinado con terapia de radiación puede afectar la respuesta al daño de ADN inducido por radiación. Sin embargo, los mecanismos subyacentes por los cuales las funciones nimotuzumab en radiosensibilización siguen siendo difícil de alcanzar. En este estudio, el uso de dos líneas de células cancerosas cultivadas, que tuvo como objetivo investigar el potencial mecanismo molecular de nimotuzumab en el aumento de la radiosensibilidad celular de cáncer.
Materiales y Métodos
Las células, cultivos celulares y reactivos
El humano NSCLC A549 línea celular y línea celular de cáncer de mama MCF-7 (proporcionado por el instituto de la provincia de Heilongjiang de la investigación del cáncer, Harbin, china) se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS ) (NQBB, Australia) en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C. Nimotuzumab fue proporcionada por Biotech Pharmaceutical Co. Ltd (Beijing, China).
Clonigénicas ensayo de supervivencia
células en crecimiento exponencial en 25 cm
2 matraces se trataron con tripsina, se recogieron y se contaron. Se diluyeron en serie a densidades apropiadas, y se sembraron por triplicado con ciertos números (números diferentes de células de acuerdo con la dosis irradiada. Por ejemplo, a 200 células por matraz para 2Gy, 500 células para 4Gy, 1000 células por 6Gy, 4000 células para 8 Gy, 10000 células de 10 Gy y 100 células para el control.) en 25 cm
2 matraces que contenían 5 ml de medio de cultivo en ausencia o presencia de 700 nM nimotuzumab. Veinticuatro horas después de la incubación, las células se expusieron a 2, 4, 6, 8 y 10 Gy de 4MV X-ray generado por un acelerador lineal de alta energía (sinergia Elekta, Estocolmo, Suecia) a una tasa de dosis de 3 Gy min
-1. Después, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se cultivaron en medio libre de fármaco durante 10-14 días para formar colonias. Después de eso, las colonias se fijaron con ácido methanol:acetic (, v /v 10:01), y después se tiñeron con violeta cristal. Se contaron las colonias que contienen ≥ 50 células. La fracción superviviente se calculó como: (número de colonias media) /(número de células inoculadas × eficiencia en placas). eficiencia de plaqueo se definió como: (número de colonias media) /(el número de células inoculadas para el control, que no fueron expuestos a la radiación con o sin nimotuzumab). Los datos se ajustaron al modelo de objetivos múltiples de un único blanco clásico: SF = 1- (1-e
-D /D0)
N para dibujar la curva de supervivencia de la dosis, de la que los parámetros (D0, dq, N y SF2) que representa la radiosensibilidad celular intrínseco fueron derivadas. La relación de mejora de la sensibilidad (SER) se calculó como: (D
0 de las células tratadas con radiación /D
0 de nimotuzumab combinado con las células tratadas con radiación)
análisis apoptosis de la célula
Las células tratadas con o sin 700 nM nimotuzumab durante 24 h fueron expuestas a diferentes dosis de radiación (0, 2, o 8 Gy), y se cosecharon a las 48 h después de la radiación para el análisis de apoptosis celular. Aproximadamente 1 × 10
6 células en cada grupo fueron teñidas con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) para el análisis de apoptosis de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Beyotime, China). Las células fueron analizadas por fluorescencia de células activadas (FACS, Calibur, BD, Estados Unidos).
γ-H2AX focos detectados por microscopía confocal
Las células cultivadas en cubreobjetos en seis pocillos eran tratados con o sin 700 nM nimotuzumab durante 24 h. Posteriormente, las células fueron irradiadas a dosis variables (1, 2, 4 u 8 Gy) seguido por incubación durante 24 h. Después, las células se fijaron con hielo frío de etanol al 70% durante 30 min, se lavaron 3 veces con PBS y se bloquearon con 3% de BSA y 0,1% de Triton-X100 en PBS durante 30 min. Después de retirar el tampón de bloqueo, las células se incubaron con anticuerpo 2-4 ug /ml γ-H2AX conjugado con FITC (Millipore, Billerica, MA) en tampón de bloqueo durante 2 h en la oscuridad. Los anticuerpos fueron excesivos lavados por PBS. Por último, el 24 h residual γ-H2AX se examinó por microscopía confocal (Zeiss, LSM700, Alemania). Para cada punto de datos se evaluaron al menos 300 núcleos.
proteínas detección de la fosforilación de EGFR y el daño a reparar el ADN relacionadas, por Western-blot
células A549 y células MCF-7 fueron tratados con o sin 700 nM nimotuzumab durante 24 h y se irradió con 4 Gy de rayos X para detectar la fosforilación de EGFR. Las células tratadas se recogieron a las 2 h después de la radiación. A549 células tratadas como se describió anteriormente fueron cosechadas en el 0,5, 1, 2, o 6 horas después de la radiación para el análisis dinámico de las proteínas relacionadas reparación de daños en el ADN. Mismas cantidades de células A549 con el mismo programa de tratamiento se irradiaron con dosis diferentes (0, 1, 2, 4, 6Gy), se incubaron durante 2 horas, luego se cosecharon. Posteriormente, sedimentos de células se trataron con tampón de lisis (Beyotime, China), 1 mM PMSF (Beyotime, China) y 1 proteasa tableta de cóctel inhibidor (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) por 10 ml de solución se añadió, y las proteínas totales fueron aislados . Igual cantidad de proteínas (30 g) fueron separados el 8% en geles de SDS-PAGE, y luego se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche en polvo no grasa 5% en TBS-T20 durante 1 h a temperatura ambiente y posteriormente se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Después de lavar tres veces con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios de rábano picante y conjugado con peroxidasa (Zhongshan, China) para 1 h. Las transferencias se desarrollaron mediante el kit de detección de quimioluminiscencia para HRP (BI, Isreal) y se visualizaron con un sistema de imágenes de quimioluminiscencia (FLuorchemFC2, Alpha Innotech, EE.UU.)
Los anticuerpos primarios se diluyeron como sigue:. Anti-EGFR y anti -pEGFR (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-DNA-PK (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-pDNA-PK (Abcam, Cambridge, Reino Unido), 1:500; anti-Ku70 (Epitomic, Burlingame, CA), 1:4000; anti-ATM (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-patm (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-AKT (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-pAKT (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-γ-H2AX (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; y anti-β-actina (Zhongshan, Pekín, China), 1:2000.
El análisis estadístico
Los datos se analizaron mediante la prueba t pareada y se describe como media ± desviación estándar. Una diferencia se consideró como significativo si P. & Lt; 0,05
Resultados
nimotuzumab tratamiento mejorado radiosensibilidad celular en la supervivencia clonigénicas ensayo
Para examinar si nimotuzumab aumentó el efecto anticancerígeno de ionización radiación, se realizó el ensayo de supervivencia clonogénico con A549 y células MCF-7 (Figura 1; parámetros radiobiológicas se resumen en la Tabla 1). No se encontró que la eficiencia en placas de ambos A549 y células MCF-7 se redujo significativamente después del tratamiento previo con nimotuzumab (P: 0,256 y 0,063, respectivamente, que se muestra como la Figura 1B). Las curvas de dosis-supervivencia indican que el pretratamiento con nimotuzumab suprimió la supervivencia clonogénico de ambas células A549 y MCF-7 después de diferentes dosis de radiación (Figura 1A). La relación de mejora de dosis fue de 1,36 y 1,47, respectivamente, lo que sugiere que nimotuzumab fue más eficaz en radiosensibilizador células MCF-7 de células A549 in vitro.
(A) células A549 y células MCF-7 se preincubaron con y sin 700 nimotuzumab nM durante 24 h, y luego irradiados con dosis de radiación ionizante entre 2 y 10 Gy. After10-14 días, las colonias se tiñeron y se contaron. fracciones supervivientes se calcularon basándose en el recuento de colonias y eficiencia en placas. Los datos se muestran como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Curvas se ajustaron con SF = 1- (1-e
-D /D0)
N. (B) Plating eficiencia de las células A549 y células MCF-7. Plating eficiencia = (número de colonias media) /(el número de células inoculadas, que fueron tratadas previamente con o sin nimotuzumab). No hubo significación estadística entre /células MCF-7 y el control nimotuzumab pretratados A549, con P:. 0,256 y 0,063, respectivamente
nimotuzumab inhiben la activación del EGFR después de la radiación
Para probar la capacidad de nimotuzumab en la inhibición de la activación del EGFR, la fosforilación de EGFR en Tyr1173 se detectó por Western-blot (Figura 2). Como se mostró, la radiación con 4Gy inducida activa la fosforilación de EGFR en tanto A549 y las células MCF-7. Con el tratamiento previo de nimotuzumab, los niveles de EGFR fosforilado disminuyeron significativamente después de la radiación.
células A549 y células MCF-7 se trataron previamente con o sin nimotuzumab durante 24 h antes de la radiación con la 4 Gy. Las células se recogieron y se lisaron en 2 h después de la radiación. Los lisados se sometieron a electroforesis y se incubaron con anticuerpos contra EGFR, pEGFR y β-actina. Los gráficos de columnas de abajo son la cuantificación de las bandas basadas en el análisis densitométrico. Cada barra representa la media ± SD de relación de densidad con respecto al control. * Indica una diferencia significativa (P & lt; 0,05).
nimotuzumab aumento de la apoptosis celular inducida por radiación
tasas de apoptosis de las células se analizaron de forma rutinaria para evaluar los efectos anticancerígenos de la radiación. En este estudio, las tasas de apoptosis de A549 y MCF-7 tratadas con nimotuzumab fueron más altos que los de las células de control después de recibir diferentes dosis de radiación (Figura 3). El resultado indicó que nimotuzumab aumentó el efecto citotóxico de la radiación ionizante mediante la inducción de apoptosis de las células.
Las células se trataron previamente con y sin 700 nimotuzumab nM durante 24 h, y luego irradiados con 0, 2 o 8 Gy. Cuarenta y ocho horas después de la radiación, las células fueron cosechadas y la apoptosis celular se examinó por citometría de flujo. Un representante de tres experimentos independientes de las dos células se muestra (A, C). Las comparaciones de las tasas de apoptosis de las células A549 y MCF-7 entre los grupos niomtuzumab pretratado y de control se muestran (B, D). Cada barra representa la media ± desviación estándar de la tasa de apoptosis. * Indica una diferencia significativa (P & lt; 0,05).
El pretratamiento de nimotuzumab aumentó γ-H2AX formación en respuesta a la radiación
La cuantificación de la formación de γ-H2AX es un indicador clave para la radiación ADN inducida por doble filamento se rompe (DSBs). Para evaluar los efectos del tratamiento combinado con nimotuzumab y la radiación en la reparación del ADN, cuantificamos el residual focos γ-H2AX 24 h después de la radiación con dosis variables por microscopía confocal. Se observó que el pretratamiento con nimotuzumab solo no aumentó la generación γ-H2AX tanto en A549 y las células MCF-7 en comparación con el control, mientras que el tratamiento de radiación con diferentes dosis en ambas líneas de células pretratadas con nimotuzumab dejó a más formación de γ-H2AX después de 24 h que células con radiación sola (Figura 4).
células A549 y MCF-7 fueron tratados previamente con o sin 700 nimotuzumab nM durante 24 h, y luego se irradiaron con 1, 2, 4 y 8 Gy. Veinticuatro horas después las células de radiación se fijaron y se incubaron con anticuerpo γ-H2AX conjugado con FITC. Cada barra representa la media ± desviación estándar de focos residuales γ-H2AX por célula. Para cada punto de datos se evaluaron al menos 300 núcleos. * Indica una diferencia significativa (P & lt; 0,05). Las siguientes imágenes son representativas núcleos con focos γ-H2AX en el microscopio de inmunofluorescencia, se trató con 1Gy o 1Gy combinarse con nimotuzumab.
El pretratamiento de nimotuzumab regula la reparación de daños en el ADN en respuesta a la radiación en las células A549
reparación de daños de ADN inducida por radiación se caracteriza por la expresión de múltiples proteínas relacionadas de reparación de daño de ADN. tanto, nuestro estudio algunas de las expresiones de proteínas relacionadas y sus formas activadas en tratamiento combinado con nimotuzumab y la radiación en las células A549.
En primer lugar, se comparó la cinética del cambio de estas proteínas de reparación de daños en el ADN relacionados en la nimotuzumab tratada y la no las células tratadas después de la exposición a la radiación (ver Figura 5). En este experimento, γ-H2AX en ambos grupos de células mostró una tendencia de incremento dependiente del tiempo. En el grupo tratado previamente nimotuzumab, los niveles de γ-H2AX fueron significativamente mayores que los del grupo de control en 1 h, 2 h y 6 h (Figura 5B). DNA-PKcs, Ku70, ATM y AKT después de la radiación no alteraron en cada momento, tanto en los grupos control y tratado previamente nimotuzumab. Sin embargo, la forma fosforilada de DNA-PKcs en Thr2609 y la forma fosforilada de AKT en Thr308, que se activan las formas de las dos proteínas inducidas por la radiación, se expresaron a niveles más bajos en el grupo tratado previamente nimotuzumab que los de control en diferentes puntos de tiempo . Desafortunadamente, tanto los niveles de fosfo-DNA-PKcs y fosfo-AKT carecían de la tendencia cada vez más habitual en correspondencia con el tiempo (Figura 5 C, D). La forma fosforilada de ATM en Ser1981 mostró poca alteración en ambos grupos, así como en diferentes puntos de tiempo (Figura 5E) guía.
células A549 (A) pretratadas con o sin nimotuzumab durante 24 h fueron irradiados con 4 Gy . Las células se recogieron y se lisaron en los tiempos indicados. Los lisados en los tiempos indicados se sometieron a electroforesis y se incubaron con anticuerpos contra γ-H2AX, AKT, pAKT, DNA-PKcs, pDNA-PKcs, Ku70, ATM, patm y β-actina. (B-E) La cuantificación de las bandas basadas en el análisis densitométrico. Los resultados son la relación de densidad relativa con el control no irradiado. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * Indica una diferencia significativa (P & lt; 0,05).
En segundo lugar, para investigar si el aumento de la dosis de radiación más activa la expresión de proteínas relacionadas con daño en el DNA, y si nimotuzumab podría inhibir la activación del ADN-PKcs y AKT, que irradiaba nimotuzumab pretratados células A549 y células de control con dosis variables. γ-H2AX mostró un aumento dependiente de la dosis tanto en el control y el grupo nimotuzumab pretratado, y el pretratamiento nimotuzumab resultó en un incremento significativo de γ-H2AX (Figura 6B). Los niveles de ADN-PKcs, Ku70, ATM, patm y AKT no ha cambiado a pesar de la intensa dosis de radiación y el tratamiento previo con nimotuzumab (Figura 6 A, E). pDNA-PKcs y pAKT eran obviamente menor en el grupo tratado previamente nimotuzumab que los del grupo control, pero no mostraron ninguna variación significativa en cada dosis en ninguno de los grupos (Figura 6 C, D).
células A549 (A) pretratado con o sin nimotuzumab fueron radiada con dosis indicadas. Dos horas después de las células de radiación se cosecharon y se lisaron. Los lisados se sometieron a electroforesis y se incubaron con los anticuerpos descritos en la Figura 5. (B-E) Cuantificación de bandas basados en el análisis densitométrico. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * Indica una diferencia significativa (P & lt; 0,05).
Discusión
A pesar de la monoterapia anti-EGFR mAb exhibe una eficacia limitada en los ensayos clínicos, su combinación con radioterapia y /o quimioterapia tiene mostrado resultados prometedores en el tratamiento de cáncer de células escamosas avanzado de cabeza y cuello, cáncer de pulmón no microcítico y cáncer de colon [17] - [22]. El éxito de esta terapia combinatoria se atribuye en gran medida a los efectos sensibilizadores de mAbs anti-EGFR a la radiación ionizante y /o agentes citotóxicos. Nimotuzumab, un mAb humanizados anti-EGFR, ha demostrado su capacidad única para generar efectos radiosensibilizadores mientras que causan toxicidades leves de los tejidos normales en los ensayos clínicos [8], [12]. A pesar de los efectos anticancerígenos de nimotuzumab se han confirmado in vitro e in vivo [23] las células del cáncer, los mecanismos moleculares potenciales de nimotuzumab a radiosensibilizar todavía necesitan ser explorados.
En el presente estudio, se confirmó que la radiosensibilidad del cáncer de líneas celulares podrían mejorarse por el pretratamiento con nimotuzumab. Desde nimotuzumab solo no afectó a la formación de colonias, que desempeñó un papel aditivo sensibilizante pero no cuando se combina con radiación. Como el objetivo de nimotuzumab, la activación de EGFR inducida por la radiación era obviamente inhibido, ya que se esperaba. Por otra parte, hemos demostrado que nimotuzumab aumento de la apoptosis inducida por la radiación de las dos líneas celulares. Crombet Ramos-
et al
[23] informó de que las células A431 incubadas con imotuzumab durante 48 h no mostraron signos evidentes de apoptosis y llegó a la conclusión de que el agente actuó principalmente como citostático en lugar de citotóxico. En nuestro estudio, sin embargo, se encontró que nimotuzumab aumentó la tasa de apoptosis de ambas células A549 y células MCF-7 fundamentalmente, lo que sugiere que nimotuzumab como agente terapéutico podría inducir apoptosis de las células, al menos in vitro. Como la radiación combinada con nimotuzumab resultó en un efecto sinérgico sobre la apoptosis celular mayor que la suma de la apoptosis inducida por nimotuzumab y por la radiación sola (es decir, un 1 + 1 & gt; 2 efecto), se evidencia que nimotuzumab tiene la capacidad de radiosensibilizador estas células de cáncer . Por otra parte, en nuestro estudio, aunque nimotuzumab aumentaron la apoptosis de las células cancerosas, que no menoscaba la formación de colonias. Especulamos que las células de cáncer clonogénico eran más resistentes y difíciles de ser afectados por nimotuzumab, y fue a las células proliferativas que fueron inducidos a la apoptosis por nimotuzumab.
A partir de los resultados anteriores, que se centró en el mecanismos moleculares potenciales de efectos radiosensibilizantes de nimotuzumab. Es bien sabido que la radiosensibilidad cáncer está determinada principalmente por la capacidad de las células cancerosas para reparar eficazmente daños de ADN inducida por radiación. Por lo tanto, la hipótesis de que podría nimotuzumab radiosensibilizar células cancerosas al afectar el mecanismo de reparación DSB. γ-H2AX formación es un marcador sensible para las lesiones del OSD y se usa rutinariamente para evaluar la radiosensibilidad celular. Más γ-H2AX focos significa más DSB quede sin reparar. La detección cuantificada de γ-H2AX mediante inmunofluorescencia y de inmunotransferencia demostró que más DSB de ADN se quede sin reparar después de la radiación en las células nimotuzumab tratado previamente, lo que finalmente condujeron a la apoptosis de las células, y mostró una correlación lineal con la dosis de radiación o el tiempo después de la radiación.
A continuación, se investigó cómo nimotuzumab inhibe la reparación de DSB inducidas por la radiación. ADN-PKcs es una proteína crítica implicada en no homóloga fin unirse a la reparación de DSB de ADN. La activación de DNA-PKcs modula directamente la reparación de DSBs inducidas por la radiación. En el presente estudio, el nivel de expresión de DNA-PKcs después de la radiación no alteró si previamente con nimotuzumab o no. Pero la forma fosforilada de DNA-PKcs en Thr2609, que está relacionada con la reparación de DSB y radiosensibilidad celular, fuertemente elevado después de la radiación, lo que indica un atributo a la radioterapia de células A549 y disminuyó significativamente en el grupo de tratamiento previo nimotuzumab. Además, se analizó una de las subunidades reguladoras de Ku70 complejo de ADN-PK. Sin embargo, Ku70 no alteró en ninguno de los grupos. En conjunto, nuestros resultados demostraron que nimotuzumab inhibe la función de la DNA-PKcs en la reparación de DSB por la supresión de su activación.
Toulany
et al
[24] informó de que la vía del EGFR-PI3K-Akt se involucrado en la regulación de la DNA-PKcs. Sugirieron que sea EGFR inhibidor de tirosina quinasa o un inhibidor de AKT abrogadas fosforilación ADN-PKcs inducida por la radiación en Thr2609 en las células tumorales K-ras mutado. Desde señalización corriente abajo bloques nimotuzumab EGFR, es posible que nimotuzumab modula la fosforilación de la DNA-PKcs a través de la supresión de la activación de AKT. Se encontró que la forma fosforilada de AKT en Thr308, que es la forma activada asociado con la supervivencia celular, altamente aumentado en células A549 radiadas, pero similar a la fosfo-DNA-PKcs (Thr2609), era totalmente inhibido después del pretratamiento con nimotuzumab. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que nimotuzumab mediada sus efectos en vías de reparación del ADN a través de la supresión de la vía PI3K-AKT. Volver al análisis de la apoptosis celular, se confirmó que la inhibición de la activación de AKT por nimotuzumab está relacionada con la promoción de la apoptosis de las células. El mecanismo potencial es a través de la inhibición de la activación del ADN-PKcs, la reparación de DSB de ADN inducido por radiación fue impedido, lo que finalmente indujo la apoptosis celular.
ATM, una proteína importante que participan en la reparación del daño en el ADN inducido por radiación, se estudiados para identificar si su expresión o actividad podrían verse afectados por el tratamiento previo con nimotuzumab. ATM y su forma activada, la forma fosforilada de cajero automático en Ser1981, no cambiaron si previamente con nimotuzumab o no. Ambos DNA-PKcs y cajeros automáticos fosforilan γ-H2AX después de la radiación [24] ionizante, [25]. En nuestro estudio, ya que la activación de la DNA-PKcs después de la radiación fue inhibida por nimotuzumab través del bloqueo de vía PI3K-AKT, la fosforilación de H2AX puede ser debido a la actividad de la ATM.
En resumen, hemos demostrado que la anti-EGFR mAb nimotuzumab radiosensitizes células cancerosas mediante la inducción de la apoptosis y más DSB sin reparar. El mecanismo subyacente de este efecto radiosensibilizador está relacionada con la inhibición de la DNA-PK de ADN implicada DSBs de reparación a través de la obstrucción de la vía PI3K-AKT. Desde nimotuzumab es un aprobado mAb anti-EGFR para su uso terapéutico en el tratamiento del cáncer, la exploración de los mecanismos precisos contra el cáncer de nimotuzumab ayudará a aumentar la eficacia de este fármaco en la práctica clínica.