Extracto
La integración del ADN del VPH en el genoma huésped es una característica pero no un paso exclusivo durante la carcinogénesis cervical. Todavía es una cuestión de debate si la integración viral contribuye al proceso de transformación más allá de asegurar la expresión constitutiva de los oncogenes virales. Hay una creciente evidencia de una distribución no aleatoria de los loci de integración y la participación directa de los genes celulares relacionados con el cáncer. En este estudio hemos abordado este tema mediante la ampliación de los datos existentes establecidos por un 47 HPV16 adicional y el carcinoma de cuello uterino HPV18 positivo. Proporcionamos evidencia de apoyo para las zonas activas de integración definidos previamente y hemos revelado otro grupo de sitios de integración dentro de la banda 3q28 citogenética. Por otra parte, en las proximidades de estos puntos de acceso numerosos microRNAs (miRNAs) se ubican y puede estar influida por el ADN integrado VPH. Al recopilar los datos e informes publicados el 9 de genes podrían ser identificados que fueron afectados por la integración del VPH al menos dos veces en los tumores independientes. En algunos tumores los transcritos de fusión viral celulares fueron aún idénticos con respecto al donante viral y sitios aceptores celulares utilizado. Sin embargo, los sitios de integración exactos pueden diferir ya que ninguno de los sitios de integración analizados hasta el momento han demostrado más de unos pocos nucleótidos de homología entre las secuencias virales y del huésped. Por lo tanto, la recombinación de ADN que grandes extensiones de homología en el sitio de integración se puede descartar. Sin embargo, es intrigante que por la alineación de secuencias se encontraron varias regiones del genoma HPV16 tener tramos altamente homólogas de hasta 50 nucleótidos a los genes anteriormente mencionados y los puntos calientes de integración. Una región común de homologías con secuencias celulares es entre el gen viral E5 y L2 (nucleótidos posiciones 4.100-4240). Especulamos que esta y otras regiones de homología están involucrados en el proceso de integración. Nuestras observaciones sugieren que la alteración dirigida, posiblemente también de los genes celulares críticos, mediante la integración del VPH sigue siendo un problema que debe resolverse totalmente
Visto:. Schmitz M, Driesch C, L Jansen, Runnebaum IB, Dürst M (2012) no aleatoria Integración del VPH en el genoma del cáncer de cuello. PLoS ONE 7 (6): e39632. doi: 10.1371 /journal.pone.0039632
Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Católica de Chile, Facultad de Medicina, Chile
Recibido: 3 Abril de 2012; Aceptado: 24 de mayo de 2012; Publicado: 27 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Schmitz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DR780 /3-1) concedidos a CD y MD. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Una infección persistente por el virus del papiloma humano de alto riesgo (HR-HPV), en particular, HPV16 y 18 se reconoce como el mayor factor de riesgo para el desarrollo de cáncer de cuello uterino [1]. La mayoría de las infecciones por VPH-AR son latente o permisiva. Las infecciones latentes están mal definidos pero se supone que el genoma viral se mantiene como un episoma en las células basales y parabasales del epitelio sin inducir alteraciones fenotípicas obvias en la célula huésped. La replicación del virus en términos de la producción de virus se limita a las células terminalmente diferenciadas de las capas y los resultados intermedios y epiteliales superficiales de un interruptor de un latente a una fase permisiva o directamente de una infección aguda. Normalmente las infecciones de VPH-AR son autolimitados y se resuelven dentro de varios meses. Sin embargo, en un estimado de 10% de los casos de un tipo de transformación de la infección por HPV evoluciona. Este proceso de transformación se caracteriza por la desregulación de los oncogenes virales E6 y E7 en células en ciclo que finalmente resulta en la inestabilidad cromosómica y la acumulación de mutaciones. Los mecanismos subyacentes de la desregulación son múltiples. La integración del genoma HPV es un paso característico en la carcinogénesis cervical y su aparición se correlaciona con la progresión de las lesiones precancerosas (CIN2 /3) a carcinoma invasivo [2], [3], [4], [5], [6]. Sin embargo, la integración no es obligatoria en este proceso y se demostró que era de tipo HPV dependiente. Vinokurova y colegas observaron que HPV16, 18 y 45 estaban presentes en un estado integrado sustancialmente con más frecuencia en comparación con los tipos de HPV 31 y 33 [7]. Curiosamente el más alto potencial carcinogénico se atribuye a HPV16 y HPV18 [8].
La pérdida del gen E2 viral es una consecuencia común de integración de VPH. Este evento puede dar lugar a una elevada expresión de los oncogenes E6 y E7 debido al hecho de que E2 ya no es capaz de reprimir la expresión de los oncogenes virales
en trans
[9], [10]. Sin embargo, hay que resaltar que, en un análisis reciente de material de biopsia no se encontró correlación entre los niveles de expresión de las transcripciones de oncogenes virales y el estado físico del genoma viral [11]. Dado que los sitios transcripcionalmente activos la integración viral hasta ahora analizados en CIN2 /3 o carcinomas cervicales representan el punto final de un proceso de selección clonal la interpretación más pragmático de los datos es que la integración garantiza una expresión constitutiva de los oncogenes virales en un nivel requerido para mantener el estado transformado de la célula. Más recientemente, varios investigadores también se han centrado en la integración de impacto puede tener en el genoma del huésped. Un análisis sistemático de la estructura del genoma en el locus de integración ha revelado alteraciones estructurales genómicas frecuentes en los sitios de inserción de VPH en el carcinoma de cuello uterino [12]. Dos publicaciones adicionales proporcionan evidencia de una pérdida total de las funciones de los genes supresores de tumores,
ZBTB7C
y
CASZ1
, respectivamente. En ambos casos se evita la expresión de genes debido a la mutagénesis de inserción en combinación con la pérdida de heterozigosidad [13], [14]. Aunque tales constelaciones es probable que sean eventos raros se hace cada vez más evidente que la integración de VPH no se produce completamente al azar. En un estudio anterior que podríamos demostrar que la mayoría de los transcritos de fusión viral-celular en carcinomas cervicales co-transcribir secuencias celulares de genes conocidos o previstos. De hecho, 17 de 74 (23%) de los sitios de integración se encuentra dentro de las bandas citogenéticas 4q13.3, 8q24.21, 13q22.1 y 17q21.2, en grupos que van desde 86 a 900 kb. Los puntos de acceso de integración 8q24.21 y 13q22.1 se encuentran cerca de sitios frágiles adyacentes. De interés es que la integración en el locus MYC en 8q24.21 está fuertemente correlacionada con altos niveles de
MYC
expresión [15], [16], [17] lo que implica
cis
efectos reguladores siendo ejercida por el genoma viral.
el fenómeno de la integración no aleatoria de ADN del VPH es intrigante y puede no ser sólo una cuestión de la accesibilidad de la cromatina en regiones transcripcionalmente activas o de los sitios frágiles que son propensos a las roturas de doble cadena [18 ], [19], [20]. Para una mejor comprensión de la función y los mecanismos de integración de virus en la carcinogénesis cervical es necesario recoger más datos para fines comparativos. De acuerdo con ello, se han analizado las transcripciones de fusión viral celulares de 34 HPV16 HPV18 positivo y 13 carcinomas cervicales positivas. Sobre la base de estos nuevos datos de los puntos de acceso definidos previamente para la integración podrían ser confirmados y extendidos sobre. También hay evidencia creciente de que numerosos genes se ven afectados más de una vez por integración.
Resultados
En 47 de 87 tumores de HPV16 o HPV18 positivas analizadas las transcripciones de fusión viral celulares podría ser amplificado. transcripciones de fusión se detectaron con mayor frecuencia en tumores positivos para VPH 18 (72%) que en los tumores HPV16 positivas (49%). Los tumores restantes contenían o bien sólo genomas virales episomales o ADN HPV integrado que es transcripcionalmente silencioso. Las secuencias celulares de las transcripciones de fusión se caracterizaron utilizando la herramienta MEGABLAST humana NCBI. Para identificar etiquetas de secuencias expresadas y los genes predichos secuencias celulares toda adicionales se analizaron utilizando la base de datos Blat UCSC.
Asignación cromosómica de las transcripciones de fusión
En total, 23 transcripciones de fusión contenían secuencias de genes conocidos y 23 contenían secuencias de los genes y las tecnologías ecológicamente racionales previstos. En un caso, la secuencia celular no se ha encontrado ninguna entrada de base de datos. Las transcripciones de fusión celulares virales podrían ser asignados a todos los cromosomas, excepto para el cromosoma 11, 14, 16, 18 y 20 y se resumen en la tabla 1. En un estudio anterior que teníamos ya se ha descrito que algunas regiones son más frecuentemente afectados por la integración de otra partes del genoma [21]. Para tres de estos puntos calientes ahora hemos encontrado eventos de integración adicionales: Las regiones 8q24.21 y 13q22.1 se vieron afectados dos veces y la región 4q13.3 se vio afectada una vez. Por otra parte, tres transcripciones de fusión fueron asignadas a una región de 600 kb en el cromosoma 3q28 banda citogenética y por lo tanto representan un nuevo punto de acceso para la integración del VPH. Figura 1 incluye los datos de Kraus y sus colegas y representa los cinco puntos de acceso, su tamaño y la proximidad a los sitios frágiles y afines miRNAs.
Se representan los sitios de integración situadas dentro de las bandas citogenéticas 3q28 (A), 4q13.3 (B), 8q24.21 (C), 13q22.1 (D) y 17q21.2 (e). Luz flechas azules: genes afectados por la integración del VPH; flechas rojas: transcripciones de fusión del VPH que se describen en este trabajo; flechas de color gris: la transcripción de fusión VPH descritos por Kraus et al. 2008; flechas verdes: sitio frágil; flechas de color azul oscuro: microRNAs
Asociación con sitios frágiles y miRNAs
47 de los loci de integración identificados, 10 (21%) se produjeron dentro de un sitio frágil común (CFS. ) y 6 (13%) en sitios frágiles raras. Por otra parte, en 15 (32%) de los casos los sitios de integración flanqueaban sitios frágiles a una distancia de 200 kb hasta 5 Mb. Otros 16 sitios de integración no se asociaron con sitios frágiles. Por otra parte, 32 sitios de integración se encuentran dentro de una distancia de 3 Mb de miRNAs (tabla 1).
Orientación de ORFs dentro de Fusión Tanscripts
Veintitrés de 47 transcripciones de fusión secuencias de genes conocidos que figuran . En 12 casos, el gen huésped se orientó en la dirección del promotor viral es decir, ambas secuencias virales y humanos estaban en la orientación sentido. En casi todos estos tumores, la secuencia viral se empalma a una secuencia de exón celular (11 de 12 eventos). 23 Transcripción de fusión contenían secuencias de genes predichos y 8 se integraron en orientación sentido. En 3 casos la orientación no se pudo determinar debido a la inconsistencia entre las bases de datos utilizadas (tabla 1).
genes idénticos se ven afectados por la integración en diferentes tumores
Al recopilar los datos de este estudio y datos publicados cinco genes y cuatro genes predichos se pudo identificar que se vieron afectados al menos dos veces en los tumores independientes (Tabla 2). Cuatro de estos genes se localizan en los puntos de acceso 3q28 (
LEPREL1
y
TP63
), 8q24.1 (
LOC727677
) y 13q22.1 (
BG182794
). Los otros genes se encuentran en otras partes del genoma. Mientras que los genes
Chr2.3.305.a
,
LEPREL1
,
NT_008046.7
, y
CFIG
se vieron afectados por el doble de la integración,
TP63
se vio afectada tres veces,
LRP1B
,
LOC727677 Opiniones y
BG182794
cuatro veces y
TMEM49
incluso seis veces.
por otra parte, los genes
NT_008046.7
,
LOC727677
,
BG182794
y
¿Cuáles son TMEM49 de particular interés porque al menos dos tumores albergan transcripciones virales idénticas fusión celular con respecto a los sitios donantes y aceptor de empalme virales utilizados.
Discusión
la integración del VPH en el genoma huésped es probable que sea un evento muy frecuente, pero no puede ser fácilmente detectado si la integración se produce en una sola célula sin posterior presión de selección clonal. En la mayoría de los cánceres cervicales sólo hay un sitio de integración HPV transcripcionalmente activo. Hay evidencia de que estos sitios de integración representan eventos clonales primeros que han proporcionado una ventaja selectiva para la expansión de la neoplasia. Debido a su contribución a la elucidación proceso carcinogénico de estos eventos de integración particulares son pertinentes para la comprensión de la carcinogénesis inducida por el VPH.
transcripciones de fusión viral y celular son marcadores moleculares para la integración sitios transcripcionalmente activos y pueden ser detectados por un 3` protocolo RACE (el ensayo APOT) que permite la amplificación por PCR para el posterior análisis de la secuencia. En este estudio hemos identificado transcripciones de fusión viral y celular en 47 carcinomas de cuello uterino. Con una excepción las transcripciones de fusión comprenden secuencias celulares de cualquiera de los genes conocidos o previstos. Esto está en consonancia con los resultados de nuestro análisis anterior, y sugiere que la integración se produce sobre todo en regiones transcripcionalmente activas [21]. Por otra parte, de acuerdo con la literatura 66% de los eventos de integración fueron ya sea dentro de (34%) o adyacente a un sitio frágil (32%) [18], [19], [20], [21]. También la integración del ADN del VPH, cerca de miRNAs es evidente. miRNAs están asociados con la regulación de los procesos importantes, como el desarrollo, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis [22] y que a menudo están desreguladas en las células del cáncer [22], [23]. De los 75 miRNAs en la vecindad de los sitios de integración 19 ya se han asociado con el cáncer (figura 1). De estos miR-34a, miR-191, miR-28, miR-944, miR-31, miR-7-2, miR-9-3, el miR-497, miR-195, miR-301, miR-21, miR-181c, miR-27a, miR-99a y miR-let7c se expresan en células de cáncer de cuello del útero [24], [25], [26], [27], [28], [29]; mientras que el miR-34a, miR-21, miR-181d, miR-23a, miR-24-2, se informó de miR-99a y miR-125b2 miR-191, miR-9-3 estar involucrado en otras entidades tumorales [ ,,,0],28], [30], [31], [32].
es de destacar que para un gran número de transcripciones de fusión (11/47) las secuencias virales se empalman en la orientación de sentido a los exones celulares de la conocida genes. La alteración de un gen mediante la integración del VPH, incluso si esto ocurre dentro de las secuencias de intrones, es probable que tenga se demostró que han contribuido a una pérdida completa de la función de genes [13] un impacto sobre la expresión génica y en casos raros, [14].
un hallazgo importante de este estudio es que proporciona un mayor apoyo para una agrupación de sitios de integración del VPH en las regiones cromosómicas de punto de acceso. De los 121 tumores analizados (incluyendo los datos por Kraus et al., 2008) el 22% de las transcripciones de fusión viral y celular fueron asignados a uno de los cinco puntos de acceso (figura 1). Los puntos de acceso varían en tamaño de 150 kb a 995 kb y contienen hasta 8 sitios de integración. Por otra parte, mediante la inclusión de datos adicionales publicados se encontraron 9 genes a ser afectados al menos dos veces por la integración del VPH, cuatro de estos genes se encuentran dentro de los puntos de acceso de las bandas citogenéticas 3q28, 8q24.21 y 13q22.1 (tabla 2). Esta observación es de particular interés, ya que sugiere que la integración no sólo se asocia con regiones transcripcionalmente activas y sitios frágiles cercanos. Sobre todo porque en algunos tumores se encontraron incluso idénticos transcritos de fusión viral-celulares con respecto a splicing viral y celular (tabla 2). Sin embargo, la secuencia de los sitios de integración en caso de
TMEM49
habían mostrado que los puntos de corte de las dos tumores respectivos son de 17 kb aparte. Además, ambos sitios de integración no mostraron homología entre las secuencias virales y celulares [14]. recombinación de ADN que contiene grandes extensiones de homología en el sitio de integración puede al menos ser anulado por fuera de
TMEM49
. Curiosamente alineación de secuencias de los genes enumerados en la Tabla 2 ha revelado varias regiones con alta homología con el genoma del HPV16. La región más común de alta homología entre el gen viral E5 y L2 (nucleótidos posiciones 4.100 hasta 4.240). Seis de los 9 genes afectados al menos dos veces por la integración de VPH muestran un mínimo de 80% de homología en tramos de hasta 34 nucleótidos (secuencias S1). Por otra parte, cada uno de los 9 genes muestran otras homologías con otras partes del genoma viral. A modo de ejemplo las posiciones de las regiones homólogas de los genes adyacentes
LEPREL1
y
TP63
con el genoma del HPV 16 se representan en la figura 2. Los autores especulan que estas regiones pueden estar involucrados en el proceso de integración. Se prevé que el genoma viral está atado a la cromatina por Brd4 que desempeña un papel clave en los acontecimientos funcionales cromosómicas tales como la transcripción, la replicación del ADN, la reparación y recombinación [33], [34]. Los tramos de ADN homólogas pueden entonces permitir la hibridación de hilos parcialmente disociadas y contribuir así al evento de recombinación. La homología de secuencia en el sitio de integración en sí no tiene por qué ser un requisito previo. Más allá de este escenario altamente especulativos también es interesante observar que todos los genes implicados son el cáncer de genes asociados a diferentes grados. Si deteriorado funcionalmente, pueden haber jugado un papel en el proceso de selección clonal. Para los genes predichos
chr2.3.305.a gratis (N-SCAN),
NT_008046.7
,
LOC727677 gratis (sweeker alias) y
BG182794
no se dispone de datos funcionales. Sin embargo,
LRP1B
pertenece a la familia de genes del receptor de lipoproteína de baja densidad y juega un papel en el proceso de endocitosis mediada por receptor. Una pérdida homocigótica de
LRP1B
en varios tumores de cuello uterino fue encontrado usando análisis de hibridación genómica comparativa basada en matrices [35]. También en otras entidades tumorales como el cáncer de tiroides [36], cáncer gástrico [37], el cáncer de pulmón [38], [39], [40], [41] y el cáncer oral [42], [43] el silenciamiento o pérdida de
se observó LRP1B
. En términos funcionales
LRP1B
es capaz de inhibir la migración de células [44] y su pérdida puede así ser relevante para la invasión y la metástasis. El segundo gen,
LEPREL1
, codifica una proteína implicada en la biosíntesis de colágeno, plegado y montaje. Hasta ahora, este gen no se asoció con el cáncer cervical, pero se observó que ser silenciado líneas celulares de cáncer de mama y en el 26% de los cánceres de mama analizados [45]. Dos genes son más
TP63
y
CFIG
.
TP63
, un miembro de la familia de la proteína p53, es otro gen afectado por la integración. Actúa como una proteína supresora de tumores y la expresión aberrante se destacó por varias entidades de cáncer, incluyendo cáncer de cuello uterino [46], [47].
CFIG
es una proteína citoplasmática expresado principalmente en el hígado. Está implicado en el metabolismo lipidprotein y cataliza la hidrólisis de los fosfolípidos, mono-, di- y triglicéridos y tioésteres de acil-CoA reductasa [48]. Un enlace directo a la carcinogénesis no es evidente, pero en un estudio reciente se observó una completa falta de expresión en el 18% de los carcinomas cervicales. Por el contrario todos normales epitelio cervical, metaplasia y CIN examinados expresaron CFIG [14]. El gen más frecuentemente afectado, siendo interrumpido 6 veces, es
TMEM49 gratis (proteína transmembrana 49), también conocido como
VMP1 gratis (proteína de membrana vacuola 1), ubicado en el cromosoma 17q23.1. Codifica una proteína de membrana de plasma, que es un componente esencial de los contactos célula-célula inicial y las formaciones de unión estrecha [49]. La reducción de expresión de
TMEM49
se encontró para líneas celulares de cáncer de mama invasivo y en la metástasis del cáncer de riñón [49].
TMEM49
También parece ser particularmente importante en términos de desregulación de miRNAs cercanas. miR21 se encuentra a sólo 676 pb aguas abajo de este gen y puede, como consecuencia de la integración del VPH sea hacia arriba o hacia abajo-regulado. Asociación de este miARN se ha informado de la cascada de caspasas [50] y se puede orientar BTG2, un gen con propiedades antiproliferativas [51]. Hasta el momento miR21 ha demostrado ser aumentada en varios tipos de cáncer como el de mama, pulmón, colon, páncreas, próstata, estómago, ovario y el útero [28], [31], [32].
Tres tramos homólogos de se muestran hasta 50 nucleótidos. El número de coincidencias exactas de nucleótidos que se indica entre paréntesis (véase también secuencias S1). El bucle de ADN entre los dos homologías ubicados en
LEPREL1
comprende 102.689 nucleótidos; el segundo bucle de 269.968 nucleótidos. puntos grises se refieren a la ubicación aproximada de las correspondientes transcripciones de fusión viral celulares detectados en los tumores D3829, T2107 y T4335 (de izquierda a derecha).
Al caracterizar a un número creciente de sitios de integración del VPH transcripcionalmente activos se ha hecho evidente que la integración no es un evento completamente al azar, pero también implica sitios cromosómicos preferentes. En casos individuales esto puede deteriorar la función de genes y promover la progresión maligna. Actualmente sólo podemos especular sobre los mecanismos que contribuyen a este fenómeno.
Materiales y Métodos
muestras clínicas
En este estudio, 69 HPV16 y HPV18 18 biopsias positivas de cuello de útero pacientes con carcinoma fueron seleccionados para la integración del VPH mediante el ensayo APOT. Para determinar el genotipo de HPV un múltiplex en tiempo real basado Taqman se utilizó el ensayo de PCR [52]. Todas las biopsias fueron tomadas de pacientes tratados en el Departamento de Ginecología de la Friedrich-Schiller-Universität, Jena, Alemania entre 1995 y 2008. Todos los tumores fueron clasificados como histopatológicamente carcinomas de células escamosas.
aislamiento de ácidos nucleicos
ARN total se aisló usando el kit NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Alemania) de acuerdo con el protocolo para el aislamiento de ARN a partir de tejidos. Las muestras se homogeneizaron por el uso de agujas de inyección con un diámetro de 0,55 mm. Se eliminó el ADN en todas las muestras por tratamiento con DNasa para 15 min (RT). DNasa se suministra con el kit NucleoSpin® RNA II. El ARN total se eluyó en 60 l de agua libre de RNasa y se almacenó a -80 ° C para su posterior análisis.
transcripción inversa
El ARN total (300-500 ng) fue inverso-transcrito utilizando 200 unidades de transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) y un cebador oligo (dT) acoplado a una secuencia de engarce (5'-AAG TGG CAG TAT CAA CGC AGA GTA CT
(30) VN-3 ' ), conocido como el CDS-Primer (Clontech, Heidelberg, Alemania). La reacción se incubó durante 70 min a 42 ° C en un volumen final de 20 l de acuerdo con el protocolo del kit Superscript II. Se añadieron 40 unidades de RNaseOUT (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) para inhibir la actividad RNasa.
La amplificación del virus del papiloma Oncogene Transcripción (APOT) Ensayo
transcripciones de fusión del VPH derivados fueron amplificados utilizando la APOT ensayo [6]. Se basa en un extremo 3 'de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) se realiza en un formato de PCR anidada. cebadores HPV E7 se utilizan como cebadores directos (HPV16: primer cebador: CGG ACA GAG CCC ATT ACA AT, segundo cebador: CCT TTT GTT GCA AGT GTG ACT CTA CG; HPV18: primer cebador: TAG AAA GCT CAG CAG ACG ACC, segundo cebador :. ACG ACC TTC GAG CAT TCC AGC AG) y un cebador adaptador complementario a la secuencia enlazadora en el cebador CDS como primera cebador inverso y el cebador de CDS como segundo cebador anidado
el ensayo APOT se realizó como se ha descrito previamente [6], con ligeras modificaciones con respecto a la imprimación utilizada. El cebador inverso para la primera PCR comprende la secuencia 5'-AAG TGG CAG TAA CAA CGC A-3 ', la PCR anidada cebador la secuencia 5'-AAG TGG CAG TAA CAA CGC AGA GTA CT-3'. La mezcla de reacción, que contiene 20 mM Tris-HCl, KCl 50 mM, MgCl 1,5 mM
2, 200 mM dNTPs, 250 de cebadores nM unidades cada uno y 0,75 recombinante Taq polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.), se sometió a un paso de desnaturalización inicial de 5 min a 94 ° C, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 30 segundos, hibridación del cebador durante 30 segundos y elongación a 72 ° C durante 2 min. Para HPV16, las temperaturas de hibridación de 61 ° C y 66 ° C para la primera y segunda PCR, respectivamente, se utilizaron; para el VPH 18, 61 ° C y 68 ° C. La reacción se terminó por una etapa de elongación final a 72 ° C durante 6 min. Dos microlitros de la primera PCR se utilizaron como molde para la etapa de PCR anidada. Ambas reacciones se realizaron en un volumen de 25 microlitros. Los productos de amplificación se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los productos que se diferencian en su tamaño de la transcripción viral mayor (E6 * 1-E7-E1
VE4-E5) son indicativos de la transcripción de fusión viral celulares. El ensayo APOT tiene varias limitaciones. Un tumor en el que el genoma integrado por VPH es transcripcionalmente silencioso no revelará la transcripción de la fusión viral y celular característica y por lo tanto será calificado como negativo para la integración. Por otra parte, el ensayo puede no detectar transcritos de fusión viral celulares en presencia de un exceso de transcritos derivados de genomas episomales de VPH. Finalmente, un tumor en el que el genoma integrado HPV persiste en forma de un concatemer las transcripciones virales no pueden comprender secuencias celulares y por lo tanto no se pueden diferenciar de las transcripciones episome derivados. En general, el ensayo subestima el número de tumores con ADN integrado VPH.
Los análisis de secuencia
transcripciones de fusión viral celulares fueron extirpados del gel y se extrajo utilizando el Kit de Gel Zymoclean ADN de recuperación (AnalytikJena, Jena , Alemania). Los productos aislados fueron secuenciados (Seqlab, Göttingen, Alemania) y el locus de integración se determinó mediante alineaciones de base de datos utilizando el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) MEGABLAST herramienta humana y la Universidad de California en Santa Cruz (USCS) genoma navegador.
PCR
Para las muestras seleccionadas (n = 13) la existencia de la transcripción de fusión viral celulares se verificó mediante PCR utilizando cebadores específicos de integración viral y celular. La amplificación por PCR se realizó en un volumen final de 25 microlitros que contenían 20 mM Tris-HCl, MgCl 3 mM
2, KCl 50 mM, 200 mM dNTPs, cebador 400 nM cada uno y 1,5 U Platinum Taq ADN polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con una etapa de desnaturalización inicial a 94 ° C durante 10 min, seguido de 45 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 15 s, hibridación a 58 a 60 ° C (dependiendo del par de cebadores utilizado) durante 20 s y elongación a 72 ° C durante 30 segundos.
en silico análisis
para el mapeo cromosómico de las transcripciones de fusión viral celulares y relacionar la integración del VPH a los sitios frágiles y miRNAs, la Universidad de California, se utilizaron Santa Cruz (UCSC) genoma navegador (hg19) y el visor de mapas (Build 37.3) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Todas las secuencias de genes miARN conocidos se enumeran en el registro miARN "miRBase" (http://www.mirbase.org/) con 1527 registros (liberar 18) para el homo sapiens.
Investigación de Integración Loci Frecuencia
Para determinar la frecuencia de la integración del VPH en los genes y los puntos de acceso específicos, los datos publicados por Dall 2008, Ferber 2003, Kraus 2008, Matovina 2009, Peter 2006, Thorland 2003, Wentzensen 2002 y 2004 y Ziegert 2003, [15 [3] ], [17], [19], [20], [21], [53], [54], [55] se incluyeron.
Apoyo a la Información
secuencias S1. Los alineamientos de secuencias Red de regiones homólogas.
doi: 10.1371 /journal.pone.0039632.s001 gratis (DOC)