Extracto
no térmico de plasma a presión atmosférica (NTAPP) es un gas ionizado a temperatura ambiente y tiene potencial como una nueva terapia para el cáncer apoptosis promueven la que actúa mediante la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Sin embargo, es imprescindible para determinar su selectividad y estandarizar los componentes y la composición de NTAPP. Aquí, hemos diseñado un aparato de generación de NTAPP combinado con un sistema de alimentación de gas He y demostrado su alta selectividad hacia las células cancerosas p53 mutado. Se determinó en primer lugar las condiciones adecuadas para la exposición NTAPP para inducir selectivamente la apoptosis en las células cancerosas. El efecto apoptótico de NTAPP fue mayor para las células cancerosas p53 mutado; la expresión de p53 en las células HT29 artificial p53 negativo disminuye el efecto pro-apoptótica de NTAPP. También se examinaron los niveles extra e intracelulares de ROS en células tratadas con NTAPP deducir el mecanismo de acción NTAPP. Mientras que los aumentos mediados por NTAPP en óxido nítrico extracelular (NO) no afectaron la viabilidad celular, intracelular de ROS aumentó bajo exposición NTAPP y la muerte celular apoptótica inducida. Este efecto se redujo de forma dependiente de la dosis después del tratamiento con captadores de ROS. NTAPP indujo apoptosis incluso en líneas celulares de cáncer de doxorrubicina-resistente, lo que demuestra la viabilidad de NTAPP como la terapia del cáncer potente. En conjunto, estos resultados apoyan fuertemente el potencial de NTAPP como un tratamiento contra el cáncer selectiva, especialmente para las células del cáncer p53 mutado
Visto: Ma. Y, Ha CS, Hwang SW, Lee HJ, Kim GC, Lee KW, et al. (2014) no térmica Presión atmosférica Plasma Preferentemente induce la apoptosis en las células p53 mutado cáncer mediante la activación de ROS Caminos de respuesta al estrés. PLoS ONE 9 (4): e91947. doi: 10.1371 /journal.pone.0091947
Editor: Subrata Roy, Universidad de Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 25 de Septiembre, 2013; Aceptado: February 18, 2014; Publicado: 23 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Ma et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por una beca de KRICT (SI-1304) y el Ministerio de Economía del conocimiento, Corea. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
apoptosis es una forma bien conocida de muerte celular programada que elimina las células dañadas y no deseados; que sirve como un mecanismo crucial para defender tejidos y órganos a partir de varios tipos de estrés y daño de la célula [1]. inducción selectiva de la apoptosis en células de cáncer se considera un enfoque ideal para la terapia del cáncer, y se han desarrollado muchos agentes contra el cáncer con este mecanismo. Sin embargo, los enfoques actuales todavía se enfrentan a desafíos importantes que superar, incluyendo resistencia a los medicamentos, la baja eficiencia terapéutica, y la selectividad de las células cancerosas.
La proteína supresora de tumores p53 es esencial para el mantenimiento de la estabilidad genómica en los mamíferos. Cuando las células se someten a diversas tensiones genotóxicas y celulares, tales como estrés oxidativo, hipoxia, radiación o fármacos quimioterapéuticos, p53 se activa, y su degradación dependiente de ubiquitina es bloqueado, lo que lleva a una acumulación de activo factor de transcripción p53 [1]. p53 activada regula la detención del ciclo celular, la activación de antioxidantes y de reparación del ADN, y la apoptosis al afectar a la expresión de sus genes diana, incluyendo la quinasa dependiente de ciclina (CDK) inhibidor
p21 /WAF1
y genes implicados en la la muerte celular, como
BAX
,
PUMA
,
NOXA
, y
Fas
[2], [3]. Cuando las células están expuestas a estrés oxidativo, p53 también activa la transcripción de sestrina, glutatión peroxidasa (GPX), y aldehído deshidrogenasa (ALDH), desempeñando así un papel fundamental en el mantenimiento del equilibrio redox y la estabilidad genómica bajo estrés oxidativo [4], [5 ]. La mutación del gen p53 o la interrupción de las vías que conducen a la activación de p53 se ha observado con frecuencia en la mayoría de tipos de cáncer humano [6].
La inducción dependiente de p53 de la apoptosis en respuesta al daño genotóxico es un aspecto importante de la supresión de tumores. Por lo tanto, la pérdida de p53 en cánceres humanos contribuye a un comportamiento agresivo del tumor y, a menudo promueve la resistencia de las células cancerosas a la radiación y los fármacos quimioterapéuticos. Por ejemplo, el tratamiento de p53 timocitos
+ /+ de ratón con los resultados de radiación en la apoptosis, mientras que p53
- /- son resistentes timocitos. Del mismo modo, p53
+ /+ de ratón fibroblastos de embriones transformados por la proteína E1A adenoviral y Ha-ras oncogen someterse a la apoptosis en respuesta a la irradiación? O agentes quimioterapéuticos, pero p53
- /- fibroblastos son resistentes a ambos tratamientos [7 ]. Además, algunas mutaciones de p53 en el cáncer de suprimir la función de p73, que induce la apoptosis a través de un mecanismo independiente de p53 [8]. Por lo tanto, la pérdida común de la función de p53 en células de cáncer presenta una limitación importante para las terapias contra el cáncer.
Plasma se describe como mezcla cuasi-neutral de partículas y radicales cargados en un gas parcialmente ionizado. Recientemente, muchos estudios han intentado aprovechar la baja temperatura de los plasmas no térmicos atmosféricas de presión (NTAPPs) para aplicaciones biomédicas por la virtud de la capacidad de control de la química y la cinética del plasma [9] - [11]. Hay varios tipos de NTAPPs, como aguja de plasma, chorros de plasma, y las descargas dieléctricas de barrera (DBDs) [11]. El componente de gas y la duración y la fuerza de impulso del campo eléctrico determinan las composiciones de plasma exactas. El estudio de NTAPPs para aplicaciones clínicas se ha convertido recientemente en un tema de investigación muy activa; NTAPPs se generan fácilmente en el aire y se pueden utilizar sin causar daño térmico a las células. Los efectos de NTAPPs sobre los tejidos vivos incluyen la esterilización, la cicatrización de heridas, y cambios de la migración celular (para revisiones [10], [12]). La variedad de diferentes efectos de plasma depende de la dosis de plasma y sus composiciones químicas complejas
.
Estudios anteriores con respecto a la aplicación clínica de NTAPP para células de mamífero se han centrado principalmente en su efecto sobre la muerte celular [13], [14] . Se informó de varios mecanismos posibles relacionadas con la muerte celular mediada por NTAPP, incluyendo la disminución de la adhesión celular [15], [16]. En particular, varios grupos de investigación demostraron que NTAPP induce la apoptosis en algunas células cancerosas y se puede utilizar como una terapia del cáncer [17], [18]. Hay un creciente cuerpo de evidencia que sugiere que las especies reactivas del oxígeno (ROS) son los principales actores de la apoptosis inducida por NTAPP
in vitro
[19] - [22].
Las ERO son químicamente reactivos radicales, iones o moléculas que contienen radicales libres de oxígeno y un subproducto del metabolismo normal. Los niveles basales de ROS activan numerosas cascadas de señalización para promover la proliferación celular en condiciones fisiológicas normales [23] - [25]. Sin embargo, los niveles excesivos de ROS inducen estrés oxidativo y atacan directamente el ADN, proteínas, lípidos y otros componentes celulares, en última instancia, contribuir a la senescencia celular y la apoptosis [26], [27].
El primer paso para desarrollar NTAPP como una terapia potencial de cáncer es evaluar su eficacia selectiva hacia las células cancerosas. Aquí, demostramos que NTAPP induce la apoptosis en células de cáncer de p53 mutado, pero no en las células primarias o tallo. También muestran que los aumentos mediados por NTAPP en intracelular de ROS inducen la muerte celular por apoptosis de una manera dependiente de la concentración. A fin de evaluar la viabilidad de NTAPP para la terapia del cáncer, hemos probado NTAPP en las células cancerosas resistentes a doxorrubicina y encontramos que era capaz de inducir la apoptosis. En conjunto, estos resultados apoyan fuertemente el potencial de NTAPP como un tratamiento contra el cáncer selectiva, especialmente para cánceres y células p53 mutado que son resistentes a medicamentos contra el cáncer existentes.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y tratamiento NTAPP
las células utilizadas en este estudio y sus fuentes se resumen en la Tabla 1. HeLa y células Hep G2 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal ( FBS) y 10 ml /L de penicilina-estreptomicina. G361, HCT116, HCT116 p53
- /-, HCT15, MES-SA, H1299, HT29, DLD-1, LoVo, doxorrubicina resistentes HCT15 /CL02 y MES-SA células /DX5 se cultivaron en RPMI-1640 suplementado con 10% (v /v) de FBS y 10 ml /L de penicilina-estreptomicina. células IMR90 y RKO se cultivaron en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 10% (v /v) de FBS y 10 ml /L de penicilina-estreptomicina. YD-9 células fueron cultivadas en DMEM:DMEM /F12 (01:01) suplementado con 10% (v /v) de FBS y 10 ml /L de penicilina-estreptomicina. Se obtuvo el tejido adiposo subcutáneo durante las cirugías electivas con el consentimiento del paciente, tal como fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Samsung (IRB no. KBC11151). células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) se aislaron a partir del tejido [28] y se cultivaron en DMEM /Ham F-12 (DMEM /F12) suplementado con 10% (v /v) de FBS y 10 ml /L de penicilina-estreptomicina. Todas las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2.
Con el fin de exponer las células a NTAPP, 1 × 10
5 células fueron sembradas en 35 -MM placas de cultivo y se incubaron durante 24 h. Las células se expusieron a la dosis indicada (5 L /min [SLM], 5 V) de NTAPP durante 30 s a 1 min cada vez cada h para un máximo de 10 veces. Cuando sea necesario, las células expuestas-NTAPP se incubaron adicionalmente durante 15 h antes de que otros experimentos.
Western blot
NTAPP-expuestos se cosecharon y se lisaron las células como se describe [29]. Las histonas se extrajeron con HCl 0,6 N. Las muestras de proteína total (50 g) o histonas se analizaron con sueros anti-caspasa-3 (Cell Signaling Technology), anti-poli ADP ribosa polimerasa (PARP, Cell Signaling Technology), anti-actina (Sigma-Aldrich), y anti -phospho-H2AX (γ-H2AX) sueros (Millipore), fosfo-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology), PUMA (Cell Signaling Technology) y Bax (Santa Cruz Biotechnology). Peroxidasa de rábano conjugada anti-ratón y anti-conejo (Jackson Immuno Research) se utilizaron anticuerpos secundarios, y se visualizaron las membranas tratadas utilizando el kit ECL (Amersham Biosciences).
detección intracelular de ROS
células HeLa (1 × 10
5) se sembraron en placa de 35 mm con cubreobjetos de vidrio y repetitiva expuestos a 5 V NTAPP durante 30 s cada h para un total de siete veces antes intracelular se evaluaron los niveles de ROS mediante un ROS kit de detección (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. No fluorescente carboxilo-H
2DCFDA puede permeabilizar fácilmente a las células vivas y es oxidado por intracelular de ROS para emitir una señal de fluorescencia verde brillante. hidroperóxido de terc-butilo (TBHP), que se sabe que induce intracelular de ROS, se utilizó como control positivo. N-acetilcisteína (NAC) y piruvato de sodio (SP) fueron utilizados como basureros ROS intracelular y extracelular, respectivamente.
nitrito de detección extracelular
La producción de óxido nítrico extracelular (NO) después de la exposición a NTAPP se determinó midiendo la acumulación de nitrito, el metabolito estable de NO, secretada al medio de cultivo. Después las células se expusieron a NTAPP, 50 l de medio de cultivo fue tomada, mezclado con un volumen igual de reactivo de Griess (1% sulfanilamida, dihidrocloruro de naftiletilendiamina 0,1%, y ácido fosfórico 2%), y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. La absorbancia se midió a 540 nm con un lector de microplacas (SoftMax Pro 4.0, Molecular Devices) utilizando una curva de calibración con una gama de 0-100 mM concentraciones de nano
2. En el experimento de depurador de NO, las células se pretrataron con 30, 50, o 100 M concentraciones de carboxi-PTIO (Sigma-Aldrich) que reacciona estequiométricamente con NO antes de que fueran expuestos a NTAPP.
Transfección de pcDNA-p53 -HA
Hemos añadido 2 g del plásmido pcDNA-p53-HA (amablemente proporcionado por el Dr. J. Song, Universidad de Yonsei, Seúl, Corea) en 6 l lineal L-PEI (polietilenimina), mezclado con NaCl 150 mM, y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. La mezcla se aplicó a las células HT29 antes de la incubación durante la noche.
Citometría de flujo
Después de 10 exposiciones repetitivas de 5 V NTAPP seguido de 15 h de incubación, las células se recogieron con tripsina-EDTA y se fijaron con 70 etanol frío%. Las células fueron tratadas con 100 mg /ml de ARNasa durante 30 minutos en 37 ° C y se resuspendieron en tampón de unión 1 x (10 mM Hepes pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM
2). Las células se tiñeron con 0,01 mg /ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich), o de doble teñidas con 5 l FITC anexina V (BD Biosciences) y 5 7AAD l (eBioscience) por millón de células para detectar las células en estado apoptótico. La citometría de flujo se llevó a cabo con citómetro (BD Biosciences) y CellQuest software.
análisis del modelo global de la química del plasma
Debido a que es difícil de medir experimentalmente todas las especies presentes en NTAPP, ingenieros desarrolló un plasma modelo global [30], [31] que calcula especies químicas espacialmente promediados, así como partículas cargadas, bajo una condición de conducción determinado de circuitos externos utilizando ecuaciones de continuidad dependientes del tiempo para cada especie. El dominio de simulación se divide en dos regiones: la región de fuente de plasma y el dominio de gas neutro sin plasmas. Las últimas región en contacto con el plato que contiene las células. Las reacciones químicas que se consideran son la misma que en la Tabla 2 por Sakiyama
et al.
[31], a excepción de la adición de helio (He) especies, que se emplea como el gas amortiguador del dispositivo utilizado NTAPP para este experimento. El número total de especies es 68, y el número total de reacciones es 826.
El modelo global utilizada en este estudio resuelve ecuaciones de continuidad para las especies de partículas pesadas y una ecuación de balance de energía para las especies de electrones. Debido a la cuasi-neutralidad del plasma, la densidad de electrones se puede calcular a partir de la suma de toda la densidad de especies positiva y la resta de todos densidad de especies negativo. Las ecuaciones se resuelven numéricamente con un código interno utilizando un método de Runge-Kutta de cuarto orden.
El análisis estadístico
Todos los datos se representan como la media ± error estándar de la media (SEM) de al menos tres experimentos independientes. Aplicamos
t
: pruebas para evaluar las diferencias estadísticamente significativas.
p Restaurant & lt; 0,05 (*) y
p
. & lt; 0,01 (**) indica significación estadística en comparación con el control
Resultados
Propiedades del dispositivo NTAPP diseñado
Hemos diseñado un aparato que genera NTAPP para exponer a las células vivas. Este dispositivo NTAPP fue diseñado para tener el campo eléctrico perpendicular a la dirección de flujo de gas con el fin de reducir la cantidad de partículas cargadas a través del chorro. Por lo tanto, los ROS generados difunda ampliamente, pero las partículas cargadas están confinados dentro de la zona de generación de plasma. La relación de aspecto pequeña del área de toberas para el volumen de plasma también se traduce en cantidad reducida de fotones UV del dispositivo. Por otra parte, la gran distancia desde el dispositivo a las células y los medios de cultivo a reducir los efectos de los fotones UV que son absorbidas por los gases y los líquidos de fondo muy bien. Por lo tanto, esperamos que este dispositivo proporciona principalmente ROS a partir de plasma, en comparación con los chorros de plasma directos que entregan partículas cargadas directamente a los objetivos. La figura 1 muestra una imagen esquemática del generador de plasma usado en este experimento. El dispositivo es una descarga de tipo anular de barrera dieléctrica (DBD) [32] especificado para la generación de NTAPP bajo aire u otros gases cuando las formas de onda sinusoidal de alta tensión o impulsos de corta duración se aplican entre dos electrodos, al menos uno de los cuales está aislado. El aislante evita que la corriente acumulación entre los electrodos, la creación de plasma eléctricamente seguro y sin calefacción de gas sustancial.
(A) Descripción esquemática del dispositivo de generación de NTAPP utilizado para tratar las células vivas. El material dieléctrico utilizado es Teflon (polytetrafluoroethyle), y el electrodo está hecho de cobre. (B) NTAPP genera a partir del dispositivo. La densidad de plasma es del orden de 10
12 /cm
3, y la potencia total consumida en el plasma es 1,11 W para un pico a pico de tensión de 7 kV con una tensión continua de entrada de 5 V. El cantidades de especies ROS calculados se muestran en la Figura S1.
Como se muestra en la Figura 1, el aparato se combina con un sistema de He-de alimentación de gas, un proveedor de alimentación de CA, y el dispositivo de DBD cubierto de plástico casos para reducir la difusión ROS. El gas fluye a la entrada del dispositivo a una velocidad de 1 a 5 litros estándar por minuto (SLM), que está controlado por un controlador de flujo másico (MKP, MPR-2000). voltaje de CA se aplica al electrodo interior del dispositivo de DBD a una frecuencia de 11,4 kHz y un pico aplicado a la tensión de pico de 7 a 20 kV, que se genera utilizando un circuito de transformador compuesto por diodos rectificadores y transistores de potencia bipolar (Ramsey Electronics, PG13 kit generador de plasma). La tensión de entrada de CC varía de 5 a 12 V, que se designa como un parámetro de control para cambiar el voltaje aplicado al dispositivo DBD. Por ejemplo, las tensiones de entrada de 5, 6, y 12 V corresponden a pico a pico tensiones de salida de 7,5, 8,9, y 18,8 kV, respectivamente. La potencia total consumida en el plasma es de 14,11 W para el pico a pico de tensión de 7 kV con una tensión continua de entrada de 5 V, que es la condición para la mayoría de la medición experimental.
La información con respecto al plasma componentes y la composición es indispensable para la reproducibilidad y mecanismo de acción NTAPP. Sin embargo, es difícil de medir cada elemento generada desde el dispositivo de plasma, especialmente a la presión atmosférica, debido a que muchos ROS no emiten luz que se puede detectar en la espectroscopia de emisión óptica, espectroscopia de masas y también es difícil de usar a esta presión. modelado Global se utiliza generalmente para el análisis de la cinética de la reacción NTAPP y la química de plasma en las condiciones de operación dadas [30], [31]. Por lo tanto, con el fin de analizar los componentes y la composición de nuestro dispositivo NTAPP, se utilizó el modelado global, que es muy similar a la de Sakiyama et al. [31], a excepción de la adición de reacciones relacionadas con él. Los resultados de la modelización global con la variación de Él fracción molar, así como la humedad, a una potencia de entrada fija de 80 W se presentan en la Figura S1
.
Para el aire seco con humedad cero, las reacciones relacionadas con el agua están excluidos, y por lo tanto el número total de especies y el número total de reacciones se redujo a 43 y 454, respectivamente. Como Sakiyama et al. [31] mostró dos regiones diferentes de simulación para la capa de descarga y dominio de gas neutro, los dominios de simulación de zona de descarga y la región de gas neutro se consideraron por separado. Figura S1A y S1B son los resultados de la región de descarga, y la Figura S1C y S1D son para la región de gas neutro en contacto con los platos. Figura S1A muestra la densidad de ROS en el interior del dispositivo de plasma para diferentes fracciones de gas He que puede ser controlada cambiando la velocidad de flujo de gas. Debido a que las energías de umbral para las interacciones con los ROS son más bajos que aquellos con Él, las densidades de ROS están determinadas principalmente por la cantidad de aire, y la especie más dominante dentro de la región de descarga es oxígeno atómico debido al proceso de disociación de impacto electrónico de O
2 y O
3 [30]. Las especies más abundantes son átomos de oxígeno, óxido nítrico, y el ozono cuando la fracción de aire de mezcla es mayor que 1%. Figura S1B muestra el efecto de la humedad sobre la densidad ROS para la mezcla de 99% de He y 1% de aire. La fracción molar estimada de vapor de agua es 1%, que corresponde a 30% de humedad relativa a temperatura ambiente. El cambio en la densidad ROS no es significativa con la inclusión del efecto de la humedad a excepción de la existencia adicional de OH, H, H
2O
2, HNO
2, HNO
3, HO
2, y H
2. El ROS generado en el dispositivo de plasma difundirse fuera al aire, y que se representan en la Figura S1C después de que el tiempo de difusión de 0,1 ms que se estimó como el tiempo de llegada de las especies de la tobera de plasma al plato. Después de que el proceso de difusión de la ROS durante todo el aire, la especie más dominante es el ozono en lugar de oxígeno atómico, y que fácilmente se adhiere a O
2 para generar O
3. Finalmente, la Figura S1D muestra el número de moles de ROS llegar al plato por unidad de superficie y unidad de tiempo. El número de moles total puede estimarse multiplicando el área de la superficie del plato y la cantidad total de tiempo de interacción. Por ejemplo, con un diámetro de plato de 3,5 cm y con tiempos de operación de 30 segundos, el total de los factores de multiplicación es 289. Por lo tanto, el número máximo mol de ozono entregado a los medios de comunicación es de aproximadamente 30 mmol. El transporte de ROS en el interior de medios líquidos no se entiende bien y es muy difícil de calcular, pero hay algunas referencias para las velocidades de reacción de los electrones hidratados y los radicales hidroxilo, así como para el transporte de protones de salto en solución acuosa [31]. Si asumimos que el 10-30% de ROS gaseosos se entregó en medios líquidos, el número total topo dentro de los rangos de líquidos a partir de 3-9 mmol.
Efectos diferenciales de NTAPP en diferentes tipos de células humanas
para determinar las condiciones óptimas de exposición NTAPP para inhibir la proliferación de células cancerosas, el experimento inicial evaluó los efectos de diferentes intensidades NTAPP sobre la viabilidad celular en células normales y cancerosas. Al principio, se aplicó NTAPP con una gama de tensión de entrada (5-10 V) una vez a la línea celular de cáncer HepG2, el pulmón embrionario línea normal celular de fibroblastos WI38, y ASC durante 1 min, a continuación, se incubaron las células durante 24 h antes de se cuantificó la viabilidad celular mediante ensayos de MTT. El ensayo MTT es para la evaluación de la viabilidad celular, que refleja el número de células viables presentes. Aumento de la viabilidad sugiere que las células tratadas proliferan más rápidamente que las células de control. disminución de la viabilidad significa que las células tratadas proliferan más lento que el control o algunas de las células tratadas se someten a la muerte celular. En este experimento, la distancia (3 cm) entre el dispositivo NTAPP y las células y el flujo de gas (5 SLM) se fijaron.
Como se muestra en la Figura S2, mientras que las diferencias en la viabilidad no se observaron entre tratado y células HepG2 no tratadas, el número de WI38 VA13-y células ASC ligeramente más aumentaron que las células control no tratadas. Estos resultados sugieren que la exposición NTAPP puede inducir diferentes respuestas fisiológicas en las células no cancerosas y cancerosas. También se verificó que los cambios en la viabilidad celular es debido a la exposición NTAPP y no por el gas He utilizado para generar NTAPP (Figura S3).
A continuación tratamos de deducir las condiciones adecuadas NTAPP de bloquear la proliferación en células de cáncer pero no en las células normales. Cuando las células HeLa fueron expuestos a 5 V NTAPP durante 30 s cada h para un máximo de 9 h (10 exposiciones NTAPP repetitivas), como se muestra en la Figura 2A, el porcentaje relativo de células viables fue ligeramente menor aumentó en las células expuestas (134%) en comparación con las células control no expuestas (145%). Además, la diferencia en las células viables relativas entre NTAPP-tratada y células HeLa no tratadas se hizo más pronunciada cuando se incubaron adicionalmente las células durante 15 h después de 10 exposiciones NTAPP: el porcentaje relativo de células viables fue sólo 106% en las células expuestas a 10 repetitivo NTAPP con 15 h de incubación adicional, en comparación con 200% en el control sin tratar (Figura 2A). Curiosamente, cuando aplicamos las mismas condiciones de NTAPP a fibroblastos primarios IMR90 células y ASC, el número relativo de células fue aumentada en las células expuestas-NTAPP comparación con el control sin tratar (Figura 2C y E). Los porcentajes relativos de células viables en ASC y células IMR90 que fueron expuestos a NTAPP 10 veces y se incubaron adicionalmente durante 15 h eran 178% y 168%, respectivamente, mientras que la de las células no tratadas fue de aproximadamente 150% (Figura 2C y E). Estas observaciones sugieren fuertemente que se emplearon las condiciones de exposición NTAPP derecha (la exposición repetitiva de 5 V de entrada NTAPP con más de incubación) para inhibir selectivamente la proliferación de células HeLa y activa la proliferación de células IMR90 y ASC.
(A-F) (a, B) HeLa, (C, D) las células madre derivadas de tejido adiposo (ASC), y (e, F) IMR90 células fueron expuestas con 5 V de entrada NTAPP durante 30 s cada h durante 10 horas, y la viabilidad celular se evaluadas en cada frecuencia de exposición indicado. El tiempo de incubación indica el tiempo después de la exposición inicial al NTAPP. La muestra de incubación de 24 h se preparó con 10 exposiciones repetitivas NTAPP seguido de una incubación adicional durante 15 h. (A, C, E) los porcentajes relativos de células viables se muestra comparando el número inicial de células antes de la exposición y la incubación como 100%. Las células viables se cuantificaron con ensayos de MTT, y los datos se muestran como media ± SEM de tres experimentos independientes.
p Hotel & lt; 0,05 (*) y
p Hotel & lt; 0,01 (**) indican diferencias significativas en comparación con la condición de control. (B, D, F) Por las mismas muestras expuestas-NTAPP de (A), (C), (E), respectivamente, γ-H2AX, caspasa-3, exfoliados caspasa-3, PARP y PARP escindida se evaluaron por análisis de Western blot. La actina se muestra como control de carga.
A continuación, examinamos si disminución de la proliferación de células HeLa después de la exposición NTAPP repetitiva era debido a la apoptosis mediante el control de la escisión de la caspasa-3 y su aguas abajo PARP efector, ambos de los cuales son activados por apoptosis. Cuando se expone a 10 repetitivo 5 V NTAPP durante 30 s cada uno, escindido se detectaron caspasa-3 y PARP en células HeLa pero no en IMR90 o ASC células (Figura 2B). En consonancia con el número de células en relación mostrados (Figura 2 A, C y E), se separó de la caspasa-3 y PARP se incrementaron significativamente por la 15 h adicionales de incubación en células HeLa, pero no se observaron en ASC o IMR90 células (Figura 2B, D, y F). Estos resultados demuestran que el tratamiento NTAPP induce la apoptosis en células HeLa pero no en ASC normal o células IMR90. También confirmó que la exposición NTAPP repetitivo induce la apoptosis en células HeLa usando citometría de flujo con anexina-V /tinción 7AAD (Figura S4).
Teniendo en cuenta que la inestabilidad genómica debido al daño del ADN es una causa importante de la apoptosis, se investigó si la exposición NTAPP induce daño en el ADN en las células HeLa apoptóticas. La fosforilación de la histona H2AX es uno de los eventos celulares tempranos que se producen en respuesta a ADN doble filamento se rompe [7]. Mientras que las células de cáncer, incluyendo HeLa, por lo general muestran una expresión baja γ-H2AX basal sin estrés, se aumentó significativamente en células HeLa expuestas-NTAPP (Figura 2B). No es sorprendente que no se detectó expresión γ-H2AX en ASC o células IMR90 primarios (Figura 2D y F). Esta observación indica que la exposición NTAPP induce selectivamente el daño del ADN que conduce a la apoptosis de las células HeLa.
efecto anti-proliferativo de NTAPP sobre el melanoma y células de carcinoma oral
Debido a que la exposición de NTAPP induce selectivamente la apoptosis en las células HeLa pero no en IMR90 primaria o ASC, se examinó su efecto sobre otros tipos de células cancerosas, incluyendo G361 melanoma y carcinoma escamoso YD-9 células orales, que se derivan de los cánceres que se encuentran en la superficie del cuerpo donde podría ser el tratamiento con plasma fácilmente aplicable. Como se muestra en la Figura 3A y C, 10 exposiciones repetitivas de 5 V NTAPP seguido de 15 h de incubación tuvieron un efecto anti-proliferativo sobre G-361 y YD-9 células en comparación con células control sin tratar. exposición NTAPP también indujo la expresión de γ-H2AX por daño en el ADN y la apoptosis en G-361 y YD-9 células (Figura 3B y D). Estos resultados demuestran que, como en las células HeLa, la exposición NTAPP conduce a la muerte celular por apoptosis sustancial en el melanoma y células de carcinoma escamosas orales, lo que sugiere el potencial de la aplicación de plasma a la piel y cánceres orales.
(A-D) (A , B) YD-9 y (C, D) las células de melanoma G361 carcinoma escamoso oral fueron expuestos con 5 V de entrada NTAPP durante 30 s cada h durante 10 horas, y se evaluó la viabilidad celular en cada frecuencia de exposición indicado. El tiempo de incubación indica el tiempo después de la exposición inicial al NTAPP. La muestra de incubación de 24 h se preparó con 10 exposiciones repetitivas NTAPP seguido de una incubación adicional durante 15 h. (A, C) Los porcentajes relativos de células viables se muestra comparando el número inicial de células antes de la exposición y la incubación como 100%. Las células viables se cuantificaron con ensayos de MTT, y los datos se muestran como media ± SEM de tres experimentos independientes.
p Hotel & lt; 0,05 (*) y
p Hotel & lt; 0,01 (**) indican diferencias significativas en comparación con la condición de control. (B, D) Por las mismas muestras expuestas-NTAPP de (A) y (C), respectivamente, γ-H2AX, caspasa-3, caspasa-3 escindida, PARP, y PARP escindida se evaluaron mediante análisis de Western blot. Actina se muestra como control de carga.
altamente preferencial efecto antiproliferativo de NTAPP en las células cancerosas deficientes en p53
En las mismas condiciones NTAPP, su efecto antiproliferativo fue mayor en células HeLa que en G-361 y YD-9 células (Figura 2A y 3), aunque todos los tipos celulares finalmente se sometieron a apoptosis. γ-H2AX fosforilación y la apoptosis se observaron en las células HeLa cuando se aplicaron 10 estimulaciones NaTPP repetitivas, pero esto sólo se observó en G-361 y las células YD-9 cuando las células se incubaron adicionalmente durante 15 h después de la exposición NTAPP. HeLa, G-361, y YD-9 son todas las células cancerosas, pero sólo las células HeLa carecen de p53 funcional [33] - [35]. Teniendo en cuenta que NTAPP induce la apoptosis a través de daño del ADN y que p53 es el supresor de tumores clave en la respuesta a las tensiones genotóxicas, que postula si la presencia o ausencia de p53 funcional en HeLa, YD-9, y las células G361 hace que la diferencia en el anti-proliferativa efecto de NTAPP.
con el fin de demostrar la relación entre la función de p53 y la sensibilidad de las células cancerosas a NTAPP, se comparó el efecto antiproliferativo de NTAPP en colorrectal líneas celulares de cáncer HCT116 (p53
+ /+) y HCT116-E6 (p53
- /-), ambos de los cuales tienen los mismos antecedentes genéticos exacta a excepción de p53 funcional. Cuando HCT116 (p53
+ /+) y HCT116-E6 (p53
- /-) recibieron 10 repetitivos 5 V estimulaciones NTAPP seguido de 15 h de incubación adicional, la misma condición usada en el tratamiento anterior NTAPP, el pariente porcentaje de células viables se redujeron tanto en HCT116 (p53
+ /+) y HCT116-E6 (p53
- /-) en comparación con células control no tratadas (Figura 4A y B). Curiosamente, HCT116-E6 (p53
- /-) células mostraron hipersensibilidad a NTAPP comparación con HCT116 (p53
+ /+); el porcentaje relativo de células viables fue sólo 80% en HCT116-E6 y 140% en HCT116, en comparación con 180% en ambos grupos de control no tratados (Figura 4A y B). Estos resultados son consistentes con el efecto de NTAPP observado para HeLa, YD-9, y las células G361 y sugieren fuertemente que las células cancerosas sin p53 funcional son significativamente más sensibles a NTAPP que las células que con p53 funcional.
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