Extracto
La aparición de la proteína quinasa D (PKD) como una posible diana terapéutica para varias enfermedades incluyendo el cáncer ha provocado la búsqueda de inhibidores potentes, selectivos y permeables a las células de moléculas pequeñas. En este estudio, se describe la identificación,
in vitro
caracterización, análisis de estructura-actividad, y evaluación biológica de un andamio inhibidor novedoso PKD ejemplificado por 1-naftilo PP1 (1-NA-PP1). 1-NA-PP1 y IKK-16 se identificaron como inhibidores pan-PKD en un ensayo de biblioteca inhibidor de la quinasa dirigida a pequeña escala. Tanto los éxitos de detección inhibieron PKD isoformas a aproximadamente 100 nm y se inhibidores competitivos con ATP. Análisis de varias quinasas relacionadas indicó que 1-NA-PP1 era altamente selectivo para PKD en comparación con IKK-16. análisis SAR mostró que 1-NA-PP1 fue considerablemente más potente y mostró efectos sustituyentes distintos en el núcleo de pirazolopirimidina. 1-NA-PP1 era de células activas, y potentemente bloqueado la proliferación de células de cáncer de próstata mediante la inducción de la detención G2 /M. También bloqueó potentemente la migración y la invasión de células de cáncer de próstata, lo que demuestra actividades contra el cáncer prometedoras en múltiples frentes. La sobreexpresión de PKD1 o PKD3 revirtió casi completamente la detención del crecimiento y la inhibición de la invasión de células tumorales causada por 1-NA-PP1, lo que indica que sus actividades anti-proliferativos y anti-invasivos fueron mediadas a través de la inhibición de la PKD. Curiosamente, un aumento de 12 veces en la sensibilidad a 1-NA-PP1 se podría conseguir mediante el diseño de una mutación gatekeeper en el sitio activo de PKD1, lo que sugiere que 1-NA-PP1 puede ser emparejado con el análogo sensible PKD1
M659G para diseccionar las funciones de PKD-específicos y las vías de señalización diferentes sistemas biológicos
Visto:. Tandon H, J Johnson, Li Z, Xu S, P Wipf, Wang QJ (2013) nuevos inhibidores de la proteína quinasa pirazolopirimidina D agentes anticancerosos potentes para las células de cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (9): e75601. doi: 10.1371 /journal.pone.0075601
Editor: Makoto Kanzaki, la Universidad de Tohoku, Japón
Recibido: 30 Enero, 2013; Aceptado: August 18, 2013; Publicado: 23 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Tandon et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por los Institutos nacionales de la Salud (R01CA129127-01, R01CA142580-01 y P50-GM067082). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. El coautor Qiming Jane Wang es un miembro del Consejo Editorial PLOS. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Tras el descubrimiento de Gleevec, que fue ampliamente demostrado que muy potente y específico de molécula pequeña inhibidores de quinasas exhiben notable eficacia clínica y toxicidad reducida [1]. Las proteínas quinasas son reguladores clave de las vías de transducción de señales y por lo tanto dianas terapéuticas atractivas para muchas enfermedades. La familia de serina /treonina proteína quinasa D (PKD) forma un grupo distinto de calcio /calmodulina proteína quinasas dependientes (CAMK) [2], [3]. Las tres isoformas conocidas de PKD (PKD1, PKD2 y PKD3) juegan un papel importante en varios procesos celulares fundamentales, incluyendo la proliferación celular, la supervivencia, la migración, la regulación de genes, el tráfico de proteínas, y la respuesta inmune [4], [5]. En particular, PKD1 se ha implicado en muchos aspectos del desarrollo de tumores, tales como el crecimiento tumoral, metástasis y la angiogénesis [4]. actividad y la expresión aberrante de PKD se ha informado en varias líneas de células tumorales y tejidos tumorales de páncreas [5], la piel [6], [7] y de próstata [8], [9]. PKD media en las principales vías de señalización que son vitales para el desarrollo del cáncer, incluyendo el VEGF y señalización /ERK vías MEK [4], el apoyo a un papel activo de la ERP en los procesos biológicos asociados a tumores en diversos tipos de cáncer [5], [7], [ ,,,0],9] - [12].
PKD es un componente clave de señalización de la diacilglicerol (DAG) de la red de señalización. Es un objetivo principal de DAG y un efector aguas abajo de la proteína quinasa C (PKC). Hay varios motivos estructurales conservados de PKD, tales como un dominio que se une C1 DAG y modula PKD localización, y un dominio PH que ejerce una función de autoinhibitory en el dominio quinasa. En células intactas, PKD se fosforila directamente por PKC DAG que responden en los dos residuos de serina conservados en el bucle de activación del dominio catalítico, que conduce a su activación. PKD menudo exhibe una actividad sostenida tras la activación, que se mantiene principalmente a través de la autofosforilación [5].
En los últimos años, se han logrado avances significativos en el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas de PKD potentes y específicos. CID755673 y análogos de [13], [14], 2,6-naftiridina y bipiridilo inhibidores y sus análogos [15] - [17], 3,5-diarylazoles [18], CRT0066101 [19], y CRT5 [20] demostraron la inhibición selectiva de PKD
in vitro Opiniones y en células intactas. En particular, se encontró CRT0066101 para bloquear de forma potente el crecimiento de xenoinjertos de tumores pancreáticos
in vivo
en ratones [19]. A pesar de estos avances significativos, sin inhibidor específico de PKD-subtipo está disponible, y los inhibidores de PKD todavía tienen que progresar a la clínica. En parte, la ausencia de candidatos clínicos se puede atribuir a la selectividad limitada,
in vivo
estabilidad y problemas de toxicidad general con el conjunto actual de inhibidores conocidos. Por lo tanto, es imperativo para continuar con la búsqueda de nuevos inhibidores quimiotipo PKD que demuestran la selectividad atractiva diana, mejores perfiles farmacocinéticos, y una mayor
in vivo
eficacia.
Hemos identificado previamente, tanto el ATP-competitiva y los inhibidores de -noncompetitive PKD que son distintos en estructura a otros inhibidores informado [13], [14], [21] - [23]. Estos éxitos fueron identificados en una campaña HTS usando bibliotecas grandes, imparciales de molécula pequeña. Posteriormente, se utilizaron estrategias de química médica para optimizar la actividad, selectividad, y las propiedades fisicoquímicas de una estructura de plomo, CID755673, resultando en una serie de análogos que mostraron inhibición objetivo mejorada
in vitro
y en las células, y la mejora metabólica perfiles [13], [14], [21] - [24]. En este documento, se describe la identificación y evaluación de un nuevo quimiotipo inhibidor PKD basado en 1-naftilo PP1 (1-NA-PP1), un pirazolopirimidina que fue diseñado originalmente para la quinasa mutante analógica sensible de src [25]. Este inhibidor se identificó en una biblioteca pequeña, dirigida de diversos inhibidores de la quinasa. 1-NA-PP1 exhibió excelente selectividad hacia PKD con poca o ninguna actividad inhibidora para dos quinasas relacionadas, CAMK o PKC. Se inhibió la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer de próstata. Un análisis posterior reveló SAR determinantes estructurales importantes para esta compuesto de plomo y posiciona 1-NA-PP1 como una nueva y distinta quimiotipo inhibidor de PKD con el potencial de rendimiento de los candidatos para el desarrollo
in vitro
y
in vivo
aplicaciones.
resultados
identificación de nuevos inhibidores de PKD andamios de una librería de inhibidores de quinasa específica
Ochenta inhibidores de la quinasa químicamente diversas fueron seleccionados de una colección de moléculas pequeñas Tocris Biosciences. La
actividad inhibidora in vitro
PKD1 de estos compuestos se evaluó sobre la base de su capacidad para inhibir la proteína PKD1 recombinante a una concentración de 1 mM en un ensayo radiométrico quinasa PKD. El porcentaje de inhibición PKD1 se calculó como la inhibición de la actividad total de PKD1 quinasa por ciento en ausencia de inhibidores (DMSO). Dieciséis compuestos fueron identificados como éxitos primarios (de inhibición ≥50% de la actividad total PKD1 quinasa) en el ensayo radiométrico PKD1 (Tabla 1). Entre estos éxitos, 1-NA-PP1, un inhibidor de la src quinasa mutante, y IKK-16, un inhibidor de la quinasa I? B, suprimido 77% y el 67% de la actividad PKD1 a 1 M, respectivamente, y se seleccionaron para caracterización adicional basándose en su potencia y características estructurales distintas.
1-NA-PP1 y IKK-16 son nuevos inhibidores pan-PKD
El
in vitro
IC
50 de 1-NA-PP1 y IKK-16 se determinó en una curva de concentración de 10 puntos usando un ensayo de quinasa PKD radiométrica [13]. Recombinante PKD1 humano, 2, o 3 proteínas se incubaron en una mezcla que contiene un sustrato de péptido derivado de un sustrato de PKD, HDAC-5, y 10 concentraciones diferentes de los dos compuestos. Como se muestra en la Fig. 1A, 1-NA-PP1 y IKK 16 inhibieron las tres isoformas de PKD con casi la misma potencia. 1-NA-PP1 inhibió PKD1, 2, y 3 con un IC
50 de 154,6 ± 21,8 nM (n = 3), 133,4 +/- 3,6 nM (n = 3), 109,4 +/- 6,8 nM (n = 3), respectivamente, mientras que IKK-16 de manera similar inhibió la PKD isoformas con un IC
50 de 153,9 +/- 7,7 nM (n = 2) para PKD1, 115,0 +/- 7,1 nM (n = 2) para PKD2 y 99,7 +/- 3,0 nM (n = 2) para PKD3. Estos resultados indican que tanto 1-NA-PP1 y IKK 16 son inhibidores pan-PKD potentes.
La inhibición de PKD1 humano recombinante, 2 y 3 se ensayó en presencia de 10 concentraciones diferentes de 1-NA-PP1 (a) y IKK-16 (B) por un
vitro
radiométrica ensayo de quinasa en PKD. El IC
50 valores se calcularon como la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes con determinaciones por triplicado a cada concentración de fármaco en cada experimento. Los datos se representaron gráficamente como una función de la concentración del fármaco y un gráfico representativo se muestra.
1-NA-PP1 es un inhibidor de la ATP-competitivo con alta selectividad para PKD más de quinasas estrechamente relacionadas
para obtener una mejor comprensión del modo de acción de 1-NA-PP1 y IKK-16, se examinaron los efectos de concentraciones crecientes de ATP en la inhibición de PKD1. Lineweaver-Burk parcelas fueron generados por el trazado de la recíproca de las velocidades de reacción (1 /v) contra el recíproco de las concentraciones de ATP (1 /[ATP]) a diferentes concentraciones de compuesto. Los puntos se ajustaron mediante regresión lineal. Como se muestra Fig. 2A-B, todas las líneas convergentes en el eje Y, lo que indica que tanto 1-NA-PP1 y IKK-16 eran inhibidores competitivos con ATP.
actividad quinasa PKD1 se midió como una función de concentraciones crecientes de ATP en presencia de concentraciones variables de 1-NA-PP1 (a) y IKK-16 (B). se muestran diagramas de Lineweaver-Burke de los datos. Los datos presentados son representativos de tres experimentos independientes.
A continuación, se determinó la especificidad de 1-NA-PP1 y IKK-16 para la PKD mediante el examen de su actividad durante varias quinasas relacionadas funcionalmente o estructuralmente, incluyendo PKCa , PKC y CAMKIIα. No se detectaron actividades inhibidoras significativas para isoformas de PKC en 0,1, 1 y 10 mM concentraciones de 1-NA-PP1, en contraste con IKK-16 que mostró una inhibición dependiente de la concentración tanto para PKCa y PKC y & gt; 50% de inhibición a 10 concentración mu M (Fig. 3A-B). El inhibidor de PKC potente GF109203X se ensayó como un control positivo y potentemente y dependiente de la concentración inhibe PKCa y PKC. PKD pertenece a un subgrupo de la familia CAMK y quinasas en ambas familias comparten alta homología de secuencia. Esto nos llevó a evaluar la inhibición de la CAMKIIα por estos compuestos. Como se ilustra en la Fig. 3C, 1-NA-PP1 mostró poca actividad en CAMKIIα hasta 10 mM, mientras que IKK-16 causó la inhibición dependiente de la concentración de la enzima y abrogó casi completamente su actividad a 10 mM. Tomados en conjunto, estos datos indican que 1-NA-PP1 es un inhibidor altamente específico para PKD en relación con otras quinasas estrechamente relacionadas incluyendo PKC y CaMK, mientras que IKK-16 es probable que un inhibidor de la quinasa promiscuo.
La inhibición de la PKCa (a) o PKC (B) se determinó a 10 nM, 100 nM, 1 mM, y 10 mM. Como controles, el inhibidor de PKC GF109203X potentemente inhibió la actividad de PKCa y PKC. Los datos son la media ± SEM de dos experimentos independientes. C. Inhibición de la CAMKIIα se midió por el ensayo de quinasa CAMK radiométrica. El experimento se repitió dos veces y se muestra una gráfica representativa. La significación estadística se determinó usando el ensayo t no apareado. ns, no es estadísticamente significativo; *,
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Otras ideas sobre la especificidad de 1-NA-PP1 podrían obtenerse mediante la evaluación de la kinome datos de la exploración, el 1-naftilmetilo PP1 (. 1-NM-PP1), donde 1-NM-PP1, junto con 178 inhibidores de quinasa conocidos, fue perfilada contra un panel de 300 proteínas quinasas humanas recombinantes a una sola concentración [26]. Como 1-NA-PP1, 1-NM-PP1 es también un análogo de PP1 C3-derivatizado que difiere de 1-NA-PP1 por un solo grupo metilo que une los anillos de pirazol y naftilo. Nuestros datos muestran que 1-NM-PP1 inhibió PKD1 con una CI
50 de 138,7 ± 33,2 nM (n = 3) (Fig. 3D), que era equivalente a la de 1-NA-PP1 (154,6 nM). Sus actividades inhibidoras para la mayoría de los de tipo salvaje y mutadas quinasas de la familia Src también son comparables [27], lo que indica que los dos inhibidores no sólo son similares en su estructura sino también en la actividad biológica. Los datos especificidad para 1-NM-PP1 se extrajeron a una línea de corte de & lt; 50% la actividad de quinasa residual usando el inhibidor de Recursos quinasa (KIR) herramienta en línea (http://kir.fccc.edu/) como se describe (tabla S1) [26]. Los datos confirmaron la inhibición de la isoforma PKD por este compuesto. Aunque se identificaron objetivos adicionales de 1-NM-PP1, este inhibidor exhibió una puntuación relativamente alta de Gini de 0,67 (una puntuación de selectividad para las quinasas e inhibidores de quinasa), lo que indica una mayor selectividad. Mientras tanto, no hay isoformas de PKC se inhibieron significativamente por este inhibidor (& gt; 90% la actividad de quinasa residual para todas las isoformas de PKC). Basado en esto y los resultados anteriores, hemos optado por centrarse únicamente en 1-NA-PP1 en nuestros estudios posteriores.
Síntesis y análisis de SAR análogos 1-NA-PP1
El objetivo de nuestros estudios sintéticos fue modificar los sustituyentes en el 1-NA-PP1 pirazolo [3,4-
d
] estructura de núcleo de pirimidina y determinar la respuesta biológica a estas modificaciones, así como para identificar potencialmente más subtipo PKD análogos selectivos. Se consideraron 4 tipos de variaciones, como se muestra en la Fig. 4, y preparó un total de 18 derivados, incluyendo los padres resintetizada, 1-NA-PP1.
A. modelo de 4 zonas para la síntesis analógica 1-NA-PP1. B. Síntesis de 1
H
pirazolo [3,4-
d
] pirimidinas 1.
Sólo dos variaciones fueron explorados en la zona 1,
t
butilo y metilo (Tabla 2). En 1 concentración mu M, 1-NA-PP1 inhibió la actividad de PKD1 en un 80%, mientras que su análogo R
1 = metilo 1f solamente dio lugar a una reducción del 32% de la actividad. Todos los otros análogos con un sustituyente metilo en la zona 1 y varias sustituciones en las zonas 2-4 les fue aún peor y demostradas y lt; 10% de las actividades inhibidoras la 1 micra concentraciones. El requisito de grupos voluminosos en R
1 de la pirazolopirimidina ha sido reconocido previamente y que parece ser una característica general para la inhibición de la quinasa con este andamio [11]. Sin embargo, incluso cuando se mantiene la
t-butilo
grupo en la zona 1, variaciones tales como la introducción de un grupo metilo en la zona 3 (1a) y reemplazos del sustituyente naftilo con otros anillos arilo (1b-e ) ablación de la actividad PKD1. Por consiguiente, nuestra limitada SAR destacó 1-NA-PP1 como el más potente de los congéneres con tolerancia muy limitada para modificaciones estructurales de sustituyentes en el núcleo de pirazolopirimidina. Incluso los derivados electrófilos con un grupo cloro en la zona 4 y el potencial de alquilación irreversible de la enzima (1j, 1k, 1m, 1p, 1r) no mostraron un aumento en la potencia. Una disminución de manera similar empinada en v-Src tirosina quinasa actividad inhibidora de los derivados de pirazolopirimidina se ha observado previamente y está probablemente relacionado con un patrón de enlace de hidrógeno específico en las zonas 2 y 3 en el bolsillo de unión a ATP que no debe ser perturbado [25]. De acuerdo con ello, continuamos nuestra investigación sobre el perfil inhibidor de pirazolopirimidinas de PKD con el agente más potente, 1-NA-PP1.
1-NA-PP1 es-celda activa y provoca la inhibición de destino en la próstata las células cancerosas
en este estudio, hemos examinado si 1-NA-PP1 era permeable a las células y capaz de inhibición diana en células intactas. El efecto de 1-NA-PP1 el 12-miristato 13-acetato (PMA) inducida por la activación de PKD1 endógena en células de cáncer de próstata LNCaP se examinó como se describe anteriormente [9], [23], [28]. PMA activa PKD través de PKC-dependiente trans-fosforilación de Ser744 /748 (S
744/748) en el bucle de activación seguido de la autofosforilación de PKD1 en Ser916 (S
916) en el C-terminal [29], [30]. PKD1 actividad se correlaciona bien con el nivel de fosfo-S
916 (S p
916) [30]. Por ello, utilizó p-S
916 para supervisar la actividad de PKD y p-S
744/748 de PKD1 para determinar si el compuesto interfiere con la PKC inducida trans-fosforilación por PKC posiblemente inhibiendo. Como se muestra en la Fig. 5, el tratamiento de células LNCaP con 10 nM de PMA durante 20 min inducida por ambos
744 señales /748-S-PKD1 p
916-PKD1 y p-S. El pretratamiento con aumento de la concentración de 1-NA-PP1 dependiente de la concentración autofosforilación inhibido en p-Ser
916-PKD1 con una CI
50 de 22,5 ± 1,5 M (n = 2). Por el contrario, dependiente de PKC trans-fosforilación en Ser
744/748 no se vio afectada por 1-NA-PP1. Por lo tanto, 1-NA-PP1 abrogada específicamente la actividad de PKD1 sin el bloqueo de la PKC mediada trans-fosforilación.
A. células LNCaP se trataron previamente con diferentes dosis de inhibidores de 45 min, seguido de la estimulación con PMA a 10 nM para 20 min. Los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia para p-S
916-PKD1 y p-S
744/748-PKD1. Tubulina se borró como control de carga. El experimento se repitió tres veces y se muestran las transferencias representativas. B. Determinación de la IC
50. Western blots se cuantificaron usando el análisis de densitometría. Los datos se representaron e IC
50 valores se derivan las curvas de concentración-respuesta utilizando GraphPad. se mostró una de las tres curvas de concentración-respuesta.
1-NA-PP1 potentemente la proliferación de bloques de células de cáncer de próstata mediante la inducción de G2 /M detención
PKD ha surgido como una terapéutica prometedora objetivo para el cáncer. Aquí, se examinaron los efectos de la inhibición selectiva de PKD por 1-NA-PP1 sobre la proliferación de células de cáncer de próstata, supervivencia y la progresión del ciclo celular. La proliferación celular se determinó mediante el tratamiento de las células a 30 M de concentración de agente, y luego el número de células se contó durante seis días consecutivos en la presencia y ausencia de inhibidor. El crecimiento y los efectos citotóxicos de 1-NA-PP1 se evaluaron por el recuento de número de células y ensayo de MTT. Como se muestra en la Fig. 6A, 1-NA-PP1 a 30 mM causó la detención del crecimiento drástico de las células de cáncer de próstata PC3 a partir de día 2 y persistió hasta el final del experimento (día 6). 1-NA-PP1 la muerte celular inducida también dependiente de la concentración con una CI
50 de 23,3 ± 5,7 M (n = 3) (Fig. 6B). Para dar una idea del efecto de 1-NA-PP1 sobre la proliferación celular, se analizó la consecuencia del tratamiento 1-NA-PP1 en la distribución del ciclo celular mediante citometría de flujo. Análisis del ciclo celular se llevó a cabo después de tratar células PC3 con 30 mM de 1-NA-PP1 durante 72 h. Como se muestra en la Fig. 6C, 1-NA-PP1 aumentó significativamente la proporción de células en la fase G2 /M del ciclo celular, lo que corresponde a un cambio de las células de 5,8% en G2 /M en el control al 28,6% en 1-NA-PP1 tratados células, y por lo tanto lo que implica que la inhibición del crecimiento causada por 1-NA-PP1 se debe a su capacidad para inducir G2 /M detención.
A.1-NA-PP1 bloquea la proliferación de células PC3. PC3 células se sembraron por triplicado en placas de 24 pocillos. Las células se dejó que se unieran durante la noche. Un recuento de células en el día 1 se hizo, y luego o bien se añadió un vehículo (DMSO) o 1-NA-PP1 a 10 mM. Las células se contaron al día durante un total de 5 días. medio fresco y se añadieron inhibidor de cada 2 días. Los medios de determinaciones por triplicado se representaron gráficamente en el tiempo. El experimento se repitió dos veces y los resultados de un experimento representativo se muestran. B. 1-NA-PP1 indujo la muerte celular en células PC3. células PC3 se sembraron en placas de 96 pocillos (3000 células /pocillo) y luego se incubaron en medios que contienen 0,3-100 inhibidores de m para 72 h. solución de MTT se añadió a cada pocillo y se incubó durante 4 h. La densidad óptica se leyó a 570 nm para determinar la viabilidad celular. El IC
50 se determinó como la media de dos experimentos independientes para cada compuesto. C. 1-NA-PP1 causó G2 detención del ciclo celular /M fase. células PC3 se trataron con vehículo (DMSO), o 10 mM 1-NA-PP1 durante 48 h. la distribución del ciclo celular se determinó por citometría de flujo después del marcaje con yoduro de propidio de células fijadas. La significación estadística se determinó mediante la prueba t no pareada y se indica. **,
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1-NA-PP1-indued detención del crecimiento está mediado por la inhibición selectiva de PKD
Para asegurar el éxito de una terapia dirigida, es importante demostrar la especificidad objetivo en el nivel biológico. Nuestros datos anteriores demostraron que los efectos biológicos inducidos por los inhibidores de PKD phenocopied los causados por las isoformas de PKD desmontables, lo que indica que los efectos de los inhibidores fue mediada a través de la inhibición selectiva de PKD [9], [23]. En este estudio, tomamos un enfoque más directo para determinar si una inhibición selectiva de PKD da cuenta de las acciones biológicas de 1-NA-PP1. En concreto, se centra en el efecto antiproliferativo de 1-NA-PP1, hemos tratado de determinar si la sobreexpresión de PKD1 y pKD3 utilizando adenovirus podría rescatar a los efectos antiproliferativos de 1-NA-PP1. Como se muestra en la Fig. 7A-B, las células PC3 se infectaron con adenovirus nulo (Adv-nulo) y adenovirus con PKD1 y los genes pKD3 (Adv-PKD1 y Adv-PKD3) en 50 y 100 MOI. Las células infectadas se sometieron a tratamiento 1-NA-PP1 a las 10 y 30 mM. La infección con Adv-PKD1 y Adv-PKD3 revirtió los efectos antiproliferativos de 1-NA-PP1. Los niveles más altos de expresión de PKD1 o PKD3, mayores serán los efectos de rescate, y en 100 MOI una reversión casi completa de se observó una inhibición inducida por NA-PP1-1 de la proliferación celular para Adv-PKD1. Estos datos indican que los efectos antiproliferativos de 1-NA-PP1 se mediada a través de la inhibición de la enfermedad renal poliquística. También sugiere que las funciones de las isoformas de PKD probabilidades son redundantes, ya que ambos PKD1 y PKD3 pueden rescatar a los efectos de la 1-NA-PP1.
La sobreexpresión de PKD1 y PKD3 en células de cáncer de próstata rescatados los efectos antiproliferativos de 1-NA-PP1. PC3 (0,5 millones), las células se sembraron en una placa de 60 mm y se infectaron el día siguiente con 50 y 100 MOI adenovirus que portan PKD1 (Adv-PKD1) (A) y (Adv-PKD3) PKD3 (B). adenovirus vacío (Adv-null) se utilizó como control. Después de 24 h, 3000 células /pocillo se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron con y sin 10 y 30 mM 1-NA-PP1 durante 72 h. solución de MTT se añadió a cada pocillo y se incubó durante 4 h. La densidad óptica se leyó a 570 nm para determinar la viabilidad celular. La sobreexpresión de PKD1 y PKD3 se confirmó por análisis de transferencia Western (imágenes por debajo de los gráficos). La significación estadística entre DMSO y tratamiento inhibidor para cada adenovirus, así como entre los adenovirus de control y de PKD en cada concentración de inhibidor se determinó mediante la prueba t no pareada en GraphPad Prism V. ns, no es estadísticamente significativo; *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001
1-NA-PP1 inhibe potentemente la migración de células tumorales de próstata y la invasión
PKD se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la regulación de la motilidad celular , la adherencia y la invasión [4]. En este estudio, los efectos de la 1-NA-PP1 sobre la migración de células tumorales y la invasión fueron evaluados por dos ensayos independientes, un ensayo de cicatrización de la herida (migración celular) y un ensayo de invasión de Matrigel (la invasión de células). Como se ilustra en la Fig. 8A, 1-NA-PP1 a los 30 M potentemente bloqueado la migración celular PC3. Veintidós horas después de la herida, 88,6% del área herida en la monocapa tratados con 1 NA-PP1-permanecido abierta mientras que la del control tenían completamente cerrada. Del mismo modo, 1-NA-PP1 también bloqueó significativamente la invasión de células tumorales. El tratamiento de células con 30 mM 1-NA-PP1 durante 20 h dio como resultado & gt; 60% de inhibición de la invasión de células en comparación con el control (Fig 8B.). En conjunto, 1-NA-PP1 es un potente inhibidor de la migración de células de cáncer de próstata y la invasión.
A.1-NA- PP1 bloquea la migración de células de cáncer de próstata. Se cultivaron células PC3 hasta la confluencia en placas de 6 pocillos. Monocapa fue herido y fotografiada inmediatamente (0 h). Las células se trataron a continuación en medio de crecimiento que contiene un vehículo (DMSO) o 30 mM de 1-NA-PP1 durante 22 h y se midió cierre de la herida. Porcentaje cicatrización de la herida se calculó como el porcentaje de área de la herida curada en comparación con la herida original. B. 1-NA-PP1 inhibió la invasión de células de cáncer de próstata. DU145 células fueron incubadas con 30 mM 1-NA-PP1 en insertos de Matrigel. Después de 20 h, se eliminaron las células no invasivas y las células invasivas se fijaron en metanol al 100%, se tiñeron en una solución de hematoxilina 0,4%, y se fotografiaron. El número de células que invadió la matriz de Matrigel se determinó mediante recuentos de células en 6 campos relativos al número de células que migraron a través del inserto control. invasión porcentaje se calcula como el porcentaje de las células invadidas a través de Matrigel inserta vs. total de células migradas a través de los insertos de control. C. sobreexpresa PKD1 y PKD3 invierten los efectos inhibitorios de 1-NA-PP1 en invasión de células tumorales. DU145 células fueron infectadas con nula, PKD1 y adenovirus pKD3 (Adv nulo, Adv-PKD1 y Adv-PKD3) a 100 MOI. Después de 24 h, las células se volvieron a sembrar en el control y Matrigel insertos, y un ensayo de invasión de Matrigel se llevó a cabo como se describe anteriormente. La sobreexpresión de PKD1 y PKD3 se confirmó por análisis de transferencia Western (imágenes por debajo de los gráficos). Todos los experimentos anteriores se repitieron al menos tres veces y los datos de un experimento representativo se muestran.
Para determinar si PKD media los efectos de 1-NA-PP1 sobre la migración y la invasión, se llevaron a cabo experimentos de rescate para examinar si PKD1 sobreexpresa y PKD3 podrían amortiguar los efectos inhibitorios de 1-NA-PP1. PC3 células fueron infectadas con adenovirus nulo (Adv-nulo) y adenovirus con PKD1 y los genes pKD3 (Adv-PKD1 y Adv-PKD3). La capacidad invasiva de las células infectadas se midió mediante un ensayo de invasión de Matrigel. Como se muestra en la Fig. 8C, la sobreexpresión de PKD1 o PKD3 revirtió completamente la inhibición de la 1-NA-PP1 en la invasión de células, a pesar de su falta de efectos inhibitorios sobre las células invasión cuando se expresa solo. Estos datos implican que la inhibición selectiva de PKD media los efectos anti-invasivos de 1-NA-PP1. Por el contrario, ya que la sobreexpresión de PKD1 y PKD3 bloqueó la migración de las células PC3, que no fueron capaces de medir los cambios significativos en la migración de las células en presencia o ausencia de 1-NA-PP1 usando el ensayo de cicatrización de la herida (datos no mostrados). Como alternativa, se analizó la migración de las células DU145 utilizando las cámaras de migración. Nuestros datos muestran que la sobreexpresión de PKD1 o PKD3 inhibe la migración de células y no afectó el efecto inhibidor de 1-NA-PP1 sobre la migración celular (Fig. S1).
A mutante gatekeeper de PKD1 es 12 veces más sensibles a la inhibición de la 1-NA-PP1 en las células intactas
1-NA-PP1 es uno de los análogos modificados-C3 del inhibidor de quinasa PP1 de la familia Src. Fue desarrollado y utilizado como un inhibidor de quinasa altamente selectiva con solo nanomolares dígitos IC
50 para la grabación analógica sensible (as) quinasas que se han diseñado para llevar una sola sustitución de aminoácido en el residuo gatekeeper en el sitio activo de quinasa [25] , [27]. Sin embargo, micromolar 1-NA-PP1 no inhibe o bloquea sólo débilmente quinasas de tipo salvaje, lo que permite que el par AS-quinasa /inhibidor a utilizar en la disección de las funciones específicas y los mecanismos de quinasas de señalización. Este enfoque genético químico se ha aplicado con éxito a una variedad de proteínas quinasas [27], [31] - [36]. Por lo tanto, se especuló que la potencia y selectividad de 1-NA-PP1 para la PKD se podrían mejorar aún más mediante la introducción de mutaciones de aminoácidos de gatekeeper. Alineación de la secuencia del sitio activo de las isoformas de PKD condujo a la identificación del aminoácido gatekeeper, metionina 659 (M659), en PKD1 (Fig. 9A). Posteriormente, se generaron dos analógicas sensibles mutantes PKD1 crear el espacio de un PKD1 marcada con Flag (Bandera-PKD1), a saber, la bandera-PKD1
M659G y Bandera-PKD1
M659A. Después de la sobreexpresión en células intactas (Fig. 9B), la actividad inhibidora de 1-NA-PP1 se evaluó mediante el pre-tratamiento con el inhibidor, seguido por estimulación con PMA, y la posterior inmunotransferencia para pS
916-PKD1 como antes (Fig. 5). PKD1 y tubulina fueron borrados como controles. Como se muestra en la Fig. 9C, Flag-PKD1
M659G demostró un aumento significativamente la sensibilidad a 1-NA-PP1 en comparación con el control de tipo salvaje. Con base en el análisis de densitometría, el IC
50 para la de tipo salvaje Bandera-PKD1 fue 26.50 ± 2.23 M, mientras que la IC
50 para el análogo sensible Bandera-PKD1
M659G fue 2,13 ± 0,61 M, reflejando un aumento de 12 veces en la sensibilidad a 1-NA-PP1. En contraste, no hubo diferencias significativas en la inhibición de
M659A-PKD1 Flag por 1-NA-PP1 en comparación con el de tipo salvaje Flag-PKD1 (datos no presentados), lo que indica que la mutación M659A no fue capaz de sensibilizar PKD1 a la inhibición de 1-NA-PP1. En conjunto, nuestros datos indican que la actividad inhibidora de 1-NA-PP1 para PKD1 se podría mejorar mediante la introducción de la mutación gatekeeper, lo que implica que 1-NA-PP1 puede ser emparejado con el análogo sensible PKD1
M659G para determinar funciones y vías de señalización en las células intactas PKD-específica
.
A.Alignment de las secuencias primarias de aminoácidos que contienen el controlador de acceso PKD. La flecha indica el consenso gatekeeper aminoácido "metionina" (M) en un rectángulo sombreado. B. Expresión de tipo salvaje y mutantes PKDs. Se transfectaron células HEK293 con el tipo salvaje y dos mutantes de gatekeeper de Bandera-PKD1 (Bandera-PKD1
M659G y Bandera-PKD1
M659A). Dos días después de la transfección, las células se lisaron y se sometieron a transferencia de Western para PKD1 y tubulina (control de carga). C. 1-NA-PP1 dependiente de la concentración inhibe la activación inducida por PMA de la bandera-PKD1 y Bandera-PKD1
M659G. células HEK293 transfectadas con la bandera-PKD1 y Bandera-PKD1
M659G fueron suero de hambre durante 24 horas y pre-tratadas con 1-NA-PP1 a concentraciones crecientes en medio libre de suero durante 45 min, seguido de estimulación con PMA en 10 nM durante 20 min. Las células se recogieron y se sometieron a inmunotransferencia para p-S
916-PKD1, PKD1, y la tubulina. El experimento se repitió tres veces y las imágenes representativas de un experimento se muestran.
Discusión
PKDs juegan un papel importante en muchos procesos biológicos fundamentales y representan una diana terapéutica emergente para muchas condiciones patológicas y enfermedades. Sin embargo, la función biológica exacta de PKD no ha sido bien definido. Inhibidores altamente selectivos de moléculas pequeñas y de células permeables PKD no son sólo los candidatos potenciales de drogas, sino también herramientas poderosas para una evaluación sistémica de las funciones específicas de PKD y vías de señalización en los sistemas biológicos complejos.