Extracto
Efecto Warburg, una de las características de las células cancerosas, se caracteriza por interruptor metabólico de la fosforilación oxidativa mitocondrial de la glucólisis aeróbica. En los últimos años, el aumento de nivel de expresión de la piruvato quinasa M2 (PKM2) se ha encontrado para ser el culpable de la glicolisis aerobia mejorada en células de cáncer. Sin embargo, no hay agente de inhibición de la glucólisis aeróbica por la orientación PKM2. En este estudio, encontramos que el ácido oleanólico (OA) indujo un cambio de PKM2 a PKM1, y consistentemente, abrogó el efecto Warburg en las células cancerosas. La supresión de la glucólisis aeróbica por OA está mediada por el interruptor PKM2 /PKM1. Además, se encontró de señalización mTOR a ser inactivados en células de cáncer de OA-tratada, y no se requiere la inhibición de mTOR para el efecto de OA interruptor de encendido /PKM1 PKM2. Disminución de la expresión de c-Myc hnRNPA1-dependiente y hnRNPA1 era responsable de interruptor de la OA inducida entre las isoformas PKM. Colectivamente, hemos identificado que la OA es un compuesto antitumoral que suprime la glucólisis aeróbica en las células cancerosas y existe la posibilidad de que PKM2 puede ser desarrollado como un objetivo importante en la vía de la glucólisis aeróbica para el desarrollo de nuevos agentes anticancerosos
Visto:. Liu J , Wu N, Ma L, Liu M, Liu G, Zhang Y, et al. (2014) oleanólico ácido suprime la glucólisis aeróbica en las células cancerosas mediante la conmutación de piruvato-quinasa de tipo M isoformas. PLoS ONE 9 (3): e91606. doi: 10.1371 /journal.pone.0091606
Editor: Ming Tan, de la Universidad del Sur de Alabama, Estados Unidos de América
Recibido: 6 de Noviembre de 2013; Aceptado: 12 de febrero de 2014; Publicado: 13 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de los proyectos de desarrollo de medicamentos innovadores de nacionales (2014ZX-09102043-001). El estudio también fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencia Natural. China (81302906, 81273550 y 41306157; http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
glucólisis aeróbica, también conocido como efecto Warburg, se ha establecido como una característica de las células del cáncer [1]. Casi todos los tipos de células de cáncer cambian su metabolismo mediante el aumento de la glucólisis y la supresión de la fosforilación oxidativa mitocondrial, incluso en condiciones de normoxia (por lo tanto, definidos como la glucólisis aeróbica) [2]. Muchos intermedios glicolíticas son indispensables para la síntesis de moléculas que es esencial para las estructuras y funciones celulares, tales como nucleótidos, aminoácidos y lípidos. Por lo tanto, la proliferación de las células cancerosas altamente cumplen sus requisitos para los materiales de construcción celulares cambiando su metabolismo de la fosforilación oxidativa de la glucólisis, aunque la producción de ATP es menos eficiente en el proceso de glicólisis.
PKM
gen codifica dos proteínas quinasas, PKM1 y PKM2, y estas quinasas también son responsables de la conversión de fosfoenolpiruvato (PEP) a piruvato que se puede utilizar para la producción de ácido láctico o enterring la fosforilación oxidativa mitocondrial. PKM1 y PKM2 se generan mediante corte y empalme de ARNm exclusivo (exón 9 para PKM1 y el exón 10 para PKM2) [3]. http://en.wikipedia.org/wiki/PKM2 - cite_note-Corcoran-5PKM1 es catalíticamente más activos que PKM2. PKM2 se expresa en todas las células con una alta tasa de síntesis de ácidos nucleicos [4]. Las células cancerosas utilizan PKM2 para acumular los compuestos intermedios para la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas y mantener la glicolisis aerobia [5]. El aumento de la actividad PKM2 o conmutación de mRNA de empalme de PKM2 a PKM1 es capaz de suprimir el efecto Warburg, y, en consecuencia, el crecimiento compromiso tumor [6]. Por lo tanto, PKM2 se cree que es un objetivo prometedor en el campo de la terapia del cáncer. Sin embargo, no se han encontrado los compuestos que pueden aumentar la proporción de PKM1 a PKM2.
ácidos oleanólico (OA) se distribuye ampliamente en muchas plantas, y ha sido bien documentado que OA muestra la actividad anti-tumor de una gama de células cancerosas humanas. estudio previo en nuestro laboratorio ha demostrado que el tratamiento de las células pancreáticas humanas de cáncer pan-28 que conduce a la apoptosis a través mitocondrial mediada por apoptosis vía [7]. Otro estudio también revela que OA puede inhibir la metástasis en células de glioma [8]. Sin embargo, el objetivo de OA no ha sido bien identificados. En el presente estudio, encontramos que la OA puede suprimir la glucólisis aeróbica mediante la supresión de la expresión PKM2 y afectados
PKM
mRNA de empalme a través de la señalización /hnRNP mTOR /c-Myc.
Métodos y materiales
Cultivo de células y compuestos químicos
línea celular de carcinoma de próstata humano, PC-3, y la línea celular de cáncer de mama humano, MCF-7, se adquirieron de la American Type Culture Collection C (ATCC). las células PC-3 se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; GIBCO-BRL) a 37 ° C bajo una humidificado 5% de CO
2 condición. Células MCF-7 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM).
El ácido oleanólico (OA) se adquirió de Sigma Aldrich (O5504, St. Louis, MO). OA se preparó en DMSO a la concentración de 10 mg /ml como solución de reserva.
Cell Transfección
plásmidos, incluyendo pWZL Neo Myr Flag PKM2 y pMXs-hcMYC se obtuvieron de Addgene (Cambridge, MAMÁ). pcDNA Flag GFP (Flag-GFP) se conservó en nuestro laboratorio y se utilizó como control. Transfección de células se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se sembraron PC-3 o células MCF-7 en una placa de 96 pocillos. Cuando las células se cultivan a aproximadamente 85% de confluencia, los medios se sustituyeron con OPTI-MEM. Después, 3 g plásmidos y 30 de reactivo lipofectamina l se mezclaron en un tubo que contiene 1500 l de OPTI-MEM mediante agitación vigorosa. Después de incubación durante 15 min, la mezcla se añadió a los cultivos celulares y se incubaron durante ciertos momentos.
Immunoblotting Ensayos
Las células se recogieron por centrifugación a 1000 g durante 10 min y lisaron con M- POR proteínas de mamíferos reactivo de extracción (Thermo Scientific, IL). Las concentraciones de proteína se determinaron usando el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific, FL). La proteína total se separó con electroforesis en gel de poliacrilamida con 10 a 12% y se transfirieron a 0,45 micras membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron en solución (PBS, 0,1% Tween-20, y 5% leche en polvo desnatada en polvo) de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente y, a continuación, se incubaron con anticuerpos primarios (1:1000). Después de la incubación durante la noche, las membranas se lavaron con PBS que contenía 0,1% de Tween-20 durante tres veces y, a continuación, se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (IgG de cabra anti-conejo o anti-ratón; 1:2000; Bio-Rad , CA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas de proteínas se visualizaron con SuperSignal West Dura ampliada Duración Substrato (Thermo Scientific, IL). La intensidad de las manchas se cuantificaron utilizando el software ImageJ
Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio fueron los siguientes:. PKM1 (# 7067, Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA), PKM2 (# 4053, Cell Signaling Technology , Danvers, MA), β-tubulina (# 2146, Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA), fosfo-mTOR (Ser2448) (# 2971, Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA); mTOR (# 2983, Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA); c-Myc, (sc-40, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas); hnRNP A1 (# 8443, Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA); hnRNP A2 (# 9304, Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA).
Análisis de inmunofluorescencia
PC-3 y MCF-7 células (5 × 10
/pocillo 4) se sembraron en placas de 24 pocillos y, a continuación, se añadió OA (100 g /ml). Después de 6 horas de incubación, las células se fijaron con 4% polioximetileno durante 0,5 horas, seguido de incubación con anticuerpo PKM2 (1:1000) durante 2 horas. Se añadió el anticuerpo secundario correspondiente y se incubó durante 1 hora a visualizar PKM2. 4 ', se utilizó 6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para teñir los núcleos. La fluorescencia se detectó en un microscopio confocal (CLS-2SS, Thorlabs).
Los ensayos metabólicos
Los ensayos de O
2 contenido, la actividad de piruvato-quinasa (PK), la captación de glucosa, lactato la producción, y la respiración celular se utilizaron para estudiar los cambios en el interruptor metabólico en las células de cáncer tratados con OA. El piruvato quinasa (PK) Kit de ensayo (ab83432, Abcam) y OX-500 O
2 Microsensor (Unisense, Dinamarca) se utiliza para determinar la actividad PK y O
2 contenidos, respectivamente, en el PC-3 y MCF -7 de células tratadas con OA, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para medir la captación de glucosa, PC-3 y MCF-7 se sembraron a una densidad de 5 × 10
3 células /pocillo en 96 y placas. Después de la incubación durante la noche, las células se transfectaron con ciertos plásmidos o tratados con MHY1485. A continuación, las células se trataron con OA 50 o 100 mg /ml, respectivamente. Después de incubación durante 6 o 12 h, los medios de cultivo se recogieron por centrifugación a 3000 g durante 15 min. La cantidad de consumo de glucosa de las células cancerosas ensayadas se detectó usando la captación de glucosa Ensayo Colorimétrico Kit I (# K676, BioVision, Milpitas, CA) según las instrucciones del fabricante. La densidad de absorción (DO) a 412 nm se leyó usando un lector de microplacas BioRad680 (Bio-Rad, Hercules, CA).
Se determinó la producción de ácido láctico utilizando lactato colorimétrico Assay Kit II (# K627, BioVision , Milpitas, CA) como los protocolos del fabricante. En pocas palabras, PC-3 y MCF-7 células fueron tratadas con pWZL Neo Myr Bandera PKM2, pMXs-hcMYC y bandera pcDNA GFP durante 72 horas o MHY1485 durante 1 hora, respectivamente. OA se añadió a las concentraciones indicadas y se incubó durante los tiempos indicados. A continuación, los medios de cultivo se recogieron por centrifugación a 3000 g durante 15 min, se mezcla con 45 l de tampón de ensayo de lactato. La absorbancia a 450 nm se leyó usando un lector de microplacas BioRad680 (Bio-Rad, Hercules, CA).
El consumo de oxígeno se examinó mediante el consumo de oxígeno Tasa Kit de ensayo (# 600800, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI) siguiendo las instrucciones del fabricante. VICTOR X3 Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer) se utilizó para detectar el valor de DO a 650 nm. La tasa de consumo de oxígeno se muestra como la vida frente al tiempo (mu s /hr).
formación de colonias de ensayo
células PC-3 o MCF-7 se sembraron en una placa de 6 pocillos, y se transfectaron con plásmidos, incluyendo pWZL Neo Myr Bandera PKM2 y bandera pcDNA GFP. Después de incubación durante ciertas horas, se tripsinizaron las células, se suspendieron en DMEM que contiene 10% de FBS, en placas sobre una capa inferior que contiene 0,6% de agar y se cubre con una capa superior que contiene 0,6% de agar. Las células se cultivaron en una placa de 6 pocillos y los medios se cambian semanalmente. Después de la incubación durante 10 días, se añadió cristal violeta y se contó el número de colonias y se analizó con software ImageJ.
Análisis estadístico
Los experimentos excepto los ensayos de inmunotransferencia se llevaron a cabo por lo menos tres veces. Todos los valores se expresan como media ± SD, y se compararon en un punto de tiempo dado por no pareada, prueba de la t de dos colas. Los datos se consideraron estadísticamente significativas cuando p & lt; 0,05 (*) y p. & Lt; 0,01 (**)
Resultados
OA inhibe la glucólisis aeróbica en las células cancerosas
aeróbico glucólisis se caracteriza por el aumento de la captación de glucosa y la producción de lactato, y el consumo de oxígeno comprometida en las células de cáncer con una alta disponibilidad de oxígeno. Por lo tanto, se midió el efecto de la OA en estas actividades de las células del cáncer. Reducción de consumo de glucosa se encuentra en varios tipos de células cancerosas cuando se añadió a los cultivos de OA (Fig. 1A). También se encontró que la producción de ácido láctico en estas células de cáncer a ser disminuido en las células tratadas con OA (Fig. 1B). Además, OA mejora el consumo de oxígeno en las células cancerosas (Fig. 1C). Los datos anteriores muestran que la OA fue capaz de inducir la alteración metabólica de las células cancerosas mediante la supresión de la glicolisis aerobia.
El consumo de glucosa (A), la producción de ácido láctico (B) y el consumo de oxígeno (C) se evaluaron en PC- 3 y MCF-7 células tratadas con 50 o 100 mg /ml oA para 6 o 12 h, respectivamente. Los detalles de la metodología se han descrito en la sección de Materiales y Métodos. La relación de cada grupo de control se presenta aquí. Las barras muestran los valores medios de tres experimentos independientes (media ± DE). *, P & lt; 0,05; **, P & lt;.
0,01
Además, se compararon contenido de O
2 en células de cáncer con o sin tratamiento de la OA. Los datos mostraron que la OA no tiene ninguna influencia sobre la concentración de oxígeno en el cultivo de células, lo que excluye la posibilidad de que la OA conducen a la alteración metabólica al afectar las condiciones normic (Figura S1).
OA induce el cambio de PKM2 de PKM1 y aumentar la actividad PK en células de cáncer
el piruvato quinasa muscular isoenzima 2 (PKM2), cuya actividad enzimática es menos activo que PKM1, es responsable de la conversión de fosfopiruvato en piruvato en el proceso de glicólisis. PKM2, especialmente en su forma dimérica, se acumula intermedios glicolíticas y los canaliza en la biosíntesis de ácidos de nucleótidos y de aminoácidos, lo que contribuye al crecimiento de las células. PKM2 se ha encontrado para ser altamente expresado en todas las células en proliferación, tales como células tumorales [4]. Para identificar los mecanismos que OA afectado glucólisis aeróbica, que posteriormente se evaluaron los cambios en el nivel de expresión de PKM1 y PKM2 en células de cáncer tratados con OA. El análisis de inmunotransferencia reveló que OA fue capaz de disminuir la abundancia PKM2, y aumentar la expresión PKM1, en ambas líneas celulares PC-3 y MCF-7cancer, en la dosis y de manera dependiente del tiempo (Fig. 2A y 2B). La reducción en la expresión PKM2 también se encontró en experimentos de tinción de inmunofluorescencia. El tratamiento de las células cancerosas con OA el regulado la expresión PKM2 significativamente tanto en las células PC-3 y MCF-7 (Fig. 2C). Además, se demostró la actividad de PK a ser elevados en células de cáncer de OA-tratada, junto con el interruptor de PKM2 a PKM1 (Figura S2A y S2B).
PKM1 y expresión PKM2 nivel se evaluó por inmunotransferencia ensayos en PC- 3 y MCF-7 células tratadas con 10, 25, 50 100 mg /ml, respectivamente, para oA 12 hr (a) o 100 mg /ml para oA 0,5, 1, 2, 3, 6, 12 h, respectivamente (B). β-tubulina se utilizó como referencia endógenos. Los niveles PKM2 (verde) (C) estaban en PC-3 y las células MCF-7 tratadas con 100 mg OA /ml durante 12 horas, respectivamente, como se determina por tinción immunfluorescent. Los núcleos (azul) se tiñeron con DAPI. Las imágenes fusionadas se muestran en la parte inferior del panel. La intensidad de fluorescencia se cuantificó con el software ImageJ. La relación de cada grupo de control se presenta aquí. Las barras representan los valores promedio de 5 experimentos seleccionados al azar.
El aumento de la actividad PK Causada por PKM2 Switch /PKM1 media la represión de la OA aeróbico glucólisis
Sobre la base de la constatación de que la interruptor de PKM2 a PKM1 se produce en células de cáncer tratados con OA, que posteriormente investigado el papel de la actividad PK increaed en OA supresión de la glicolisis aerobia. Células PC-3 fueron transfectadas con PKM2- o vector que expresa GFP antes de la estimulación OA (Fig. 3A). aumento OA-inducida de la actividad PK fue rescatado por PKM2 sobreexpresión en células PC-3 (Figura S3). Los resultados también mostraron que el consumo de glucosa, la producción de lactato, así como el consumo de oxígeno fueron restaurados en células que sobreexpresan PKM2 (Fig. 3B, 3C y 3D). Los resultados sugieren que se requiere aumento de la actividad PK debido a interruptor /PKM1 PKM2 para el efecto inhibidor de OA en la glucólisis aeróbica en células de cáncer
.
células (A) OA tratados con PC-3 se transfectaron con pWZL Neo Myr bandera PKM2 (bandera-PKM2) o vector de control (bandera-GFP). Se llevaron a cabo ensayos de inmunotransferencia para determinar la expresión de la proteína PKM2. β-tubulina se utilizó como referencia endógenos. El consumo de glucosa (B), la producción de ácido láctico (C) y el consumo de oxígeno (D) se evaluaron en células PC-3 tratados con 100 mg /ml OA durante 12 horas. Los detalles de la metodología se describen en la sección de Materiales y Métodos. La relación de cada grupo de control se presenta aquí. Las barras muestran los valores medios de tres experimentos independientes (media ± DE). *, P & lt; 0,05; **, P & lt;. 0,01
Supresión OA de mTOR media la alteración en los perfiles de expresión de isoformas y PKM interruptor metabólico en las células cancerosas
Nos estábamos interesados en la forma en la OA inducido disminuir en el cambio de PKM2 a PKM1 en células de cáncer. la señalización de mTOR se ha demostrado para participar en el interruptor de las isoformas de PKM en células de cáncer [9]. Por lo tanto, se han detectado los cambios en el estado activo de mTOR en las células cancerosas tratadas con OA. análisis de inmunotransferencia reveló que la activación de mTOR se vio disminuida cuando se añadió la OA para el cultivo de células cancerosas (Fig. 4A). Reactivación de mTOR por MHY1485 células cancerosas protegido del deterioro OA mediada por la expresión PKM2 y el aumento de los niveles de PKM1 (Fig. 4B). Nuestro estudio adicional demostró que el consumo de glucosa, la producción de lactato y la tasa de consumo de oxígeno también se restauran en las células tratadas con MHY1485 (Fig. 4C, 4D y 4E). El resultado revela que mTOR es responsable de la OA inducido el interruptor de isoformas PKM y el metabolismo.
(A) Los niveles de mTOR fosforilada se examinó en las células PC-3 y MCF-7 tratadas con 50 o 100 mg /ml oA para 6 o 12 h, respectivamente, como se determina mediante ensayos de inmunotransferencia. β-tubulina se utilizó como referencia endógenos. (B) El análisis por inmunotransferencia de PKM1 y expresión PKM2 se realizó en células PC-3 incubadas con OA (100 mg /ml) y /o un activador de mTOR MHY1485 (2 M). El consumo de glucosa (C), la producción de ácido láctico (D) y el consumo de oxígeno (E) se detectaron en las células PC-3 tratados con OA (100 mg /ml) y /o MHY1485 (2 M) durante 12 h. La relación de cada grupo de control se presenta aquí. Las barras muestran los valores medios de tres experimentos independientes (media ± DE). *, P & lt; 0,05; **, P & lt;. 0,01
Supresión de mTOR OA inducida Induce el interruptor de PKM isoformas inhibiendo hnRNPA1 c-Myc-dependiente y Expresión hnRNPA2
mTOR se ha demostrado para elevar nivel PKM2 mediante la estimulación de la expresión hnRNPA1 y hnRNPA2 c-myc dependiente de [9], ambos de los cuales son responsables de la splicing exclusiva de PKM mRNA [3]. posteriormente se determinó la influencia de OA en la expresión de hnRNPA1 y hnRNPA2. Los resultados mostraron que OA puede reducir el nivel de expresión de c-Myc, así como su hnRNPA1 gen diana y la expresión hnRNPA2 (Fig. 5A). activación de mTOR mediada por MHY1485 era capaz de restaurar la expresión de c-Myc, hnRNPA1, y hnRNPA2 en células de cáncer de OA tratados (Fig. 5B). Además, la transfección de células de cáncer de OA tratados con plásmidos que expresan c-Myc abrogó el efecto de la OA en el cambio en PKM1 y expresiones PKM2 (Fig. 5C). Los resultados sugieren que la OA puede inducir interruptor PKM2 /PKM1 través hnRNPA1 dependiente de c-Myc y la vía de señalización mTOR hnRNPA2.
(A) La expresión de c-Myc, hnRNPA1 y hnRNPA2 se determinó mediante análisis de inmunotransferencia en PC células -3 y MCF-7 tratadas con 50 o 100 mg oA /ml para 6 o 12 h, respectivamente. (B) El expresiónde c-Myc, hnRNPA1 y expresión hnRNPA2 se determinó por análisis de inmunotransferencia en células PC-3 tratados con OA (100 mg /ml) y /o MHY1485 (2 M), respectivamente. (C) El nivel de c-Myc, hnRNPA1, hnRNPA2, PKM1 y PKM2 se determinó mediante ensayos de inmunotransferencia en células PC-3 tratadas con plásmidos pMXs-hcMYC (Bandera-cMyc) en presencia o ausencia de la OA. β-tubulina se utilizó como referencia endógenos.
Reducción de la glucólisis aeróbica explica en parte la actividad anti-tumoral de la OA
Para hacer frente al deterioro de la contribución de la glucólisis aeróbica a la actividad supresora de tumores de OA en las células cancerosas, que detecta los cambios en los fenotipos malignos de células cancerosas OA estimulada por la que todavía se sometieron a la glucólisis aeróbica debido a la sobreexpresión PKM2. OA fue encontrado para reducir el crecimiento de las células PC-3 (Fig. 6A). Además, el número de colonias formadas en las células PC-3 también se redujo en el marco del tratamiento de la OA (OA + GFP grupo) (Fig. 6B). Sin embargo, la restauración PKM2 suprimió significativamente el efecto de la OA en las células cancerosas, evidenciado por el aumento de la tasa de crecimiento y el número de colonias formadas en las células PC-3 co-tratados con OA y vectores PKM2 que expresan (OA + PKM2 grupo) ( la Fig. 6A y 6B).
() células PC-3 a se contó 12, 24, 36 y 48 horas después de el tratamiento de la oA (100 mg /ml) y /o MHY1485 (2 M) usando hemacytometry. Los valores promedio de tres experimentos independientes se muestran como media ± desviación estándar. **, P & lt; 0,01. La figura representativa se muestra para cada grupo. (B) Las células se trataron con OA (100 mg /ml) y /o MHY1485 (2 M) durante 10 días, se contó el número de colonias de células PC-3 y se analizó utilizando el software ImageJ. La figura representativa se muestra para cada grupo. (C) OA suprime la activación de mTOR en células de cáncer. Este efecto inhibidor de la señalización de mTOR, a su vez, abrogó expresión PKM2 c-Myc /hnRNPA1 /hnRNPA2-dependiente. En consecuencia, la glucólisis aerobia fue inhibida en células de cáncer tratados con OA.
En resumen, OA suprime la activación de mTOR señalización en las células cancerosas. A su vez, el efecto inhibidor de OA en vía de mTOR conduce al cambio de la PKM2 a la expresión PKM1, que está mediada por la vía c-Myc /hnRNPA1 /hnRNPA2. Eventualmente, la glucólisis aerobia fue suprimida en las células cancerosas tratadas con OA (Fig. 6C).
Discusión
OA, un compuesto natural ampliamente distribuido en plantas, se ha documentado que poseen una variedad de bioactividades incluyendo la propiedad anti-tumor [10]. Los mecanismos de la actividad anti-tumor de OA implican la inducción de apoptosis, detención del ciclo celular y la inhibición de metástasis [7], [8]. Sin embargo, el efecto de la OA en la vía metabólica en las células cancerosas todavía no está claro. En este estudio, se encontró que OA fue capaz de suprimir el efecto Warburg en las células cancerosas, evidenciado por el aumento de consumo de oxígeno, la reducción de la producción de lactato y la captación de glucosa más baja (Fig. 1A-1C). Para nuestro conocimiento, este es el primer momento de revelar que la OA afecta al interruptor metabólico de las células cancerosas. Nuestro hallazgo puede contribuir a la comprensión de la acción OA en las células cancerosas y ayudar al desarrollo de la OA y sus derivados con eficacia más potente para la aplicación clínica.
glucólisis aeróbica se cree que es una novela, objetivo importante y eficaz en la quimioterapia del cáncer. evidencias crecientes indican que la glucólisis aeróbica juega un papel crítico en la aparición y progresión de las enfermedades malignas. Varios compuestos han sido reportados para suprimir el crecimiento de las células tumorales al afectar la glucólisis aeróbica [11] - [15]. Para los casos, el extracto de Spatholobus suberectus ha demostrado inhibir la actividad de lactato deshidrogenasa A (LDHA), suprimiendo así la glucólisis aeróbica en células de cáncer de mama [13]. Un curcumina compuesto antiinflamatorio,, recientemente se ha demostrado para revertir el efecto Warburg causado por la estimulación factor de necrosis tumoral (TNF) en células de cáncer de mama [14]. Nuestro estudio confirma que la OA también posee la actividad inhibitoria de la glucólisis aeróbica. El estudio aumenta la comprensión de mecanismo contra el cáncer de la OA.
Muchos estudios han revelado que PKM2 juega un papel clave en la glucólisis aeróbica en células de cáncer [3]. En el presente estudio, se encontró que la expresión PKM2 puede ser inhibida en las células tratadas con artrosis de la dosis y tiempo-dependiente (Fig. 2A-2C). Más importante aún, el aumento de la actividad PK, debido al interruptor de encendido /PKM1 PKM2, mediada por el efecto de la OA de la glucólisis aeróbica en las células cancerosas, ya que la reducción de la actividad PK mediante la sobreexpresión nivel PKM2 en las células cancerosas abolió el interruptor metabólico OA inducida (Fig. 3A-3D ). por lo tanto, OA es identificado como el primer compuesto de la reducción de la abundancia PKM2, y ejerce su efecto sobre el metabolismo en las células cancerosas a través de un nuevo objetivo. Por lo tanto, hemos proporcionado evidencias iniciales de que la orientación PKM2 puede ser una estrategia novedosa para desarrollar cáncer de agentes, y OA puede ser un compuesto líder para el desarrollo de fármacos contra el cáncer dirigidos PKM2.
activación aberrante de la señalización de mTOR está estrechamente implicada en una variedad de tipos de cáncer [16]. activación de mTOR promueve la resistencia de las células cancerosas a la apoptosis inducida por ambas citoquinas y agentes quimioterapéuticos, acelera la proliferación de una amplia gama de células cancerosas, y facilita la metástasis [16]. La mayoría de los inhibidores de mTOR actuales suprimir el crecimiento de células de cáncer principalmente mediante la inducción de apoptosis y detención del ciclo celular, o alterar la metástasis [17] - [19]. En este estudio, se encontró que OA reduce el nivel de expresión de mTOR fosforilados en las células cancerosas (Fig. 4A) asociado con su actividad inhibidora de la glucólisis aerobia. Recientemente, la señalización de mTOR se ha demostrado para modular el interruptor metabólico en las células cancerosas y este efecto está mediado por el cambio en la expresión PKM2 [14], [20], [21]. Por otra parte, vía mTOR /PKM2 es responsable de, al menos, la tumorigénesis hepática [22]. Estos nuevos hallazgos sugieren que la orientación metabolismo puede ser una nueva estrategia de inhibidor de mTOR para suprimir el crecimiento de cánceres.
Colectivamente, hemos demostrado evidencia de que OA fue capaz de cambiar los patrones metabólicos de la glucólisis aeróbica a través de la fosforilación oxidativa mTOR que afecta /c-Myc /vía PKM2 en células de cáncer. Teniendo en cuenta su baja toxicidad para los tejidos normales, OA y sus analoges puede ser un agente candidato prometedor para el desarrollo de agentes anticancerígenos dirigidos metabolismo. Nuestros estudios contribuyen a una mejor comprensión del mecanismo de la propiedad antitumoral de OA, y también el estudio proporciona evidencia primaria que PKM2 se puede seleccionar como diana terapéutica fundamental en la vía de la glucólisis aeróbica en el desarrollo de nuevos agentes contra el cáncer.
Información de Apoyo
Figura S1.
OA no afectó el contenido de oxígeno en el cultivo celular. las células PC-3 y MCF-7 fueron tratadas con o sin OA durante 12 horas. El O
2 contenido se detectó con en los puntos de tiempo indicados. Los valores promedio de tres experimentos independientes se muestran como media ± DE
doi:. 10.1371 /journal.pone.0091606.s001 gratis (PPT)
figura S2.
OA incubación indujo la elevación de la actividad de PK en células de cáncer. las células PC-3 y MCF-7 (A) fueron tratados con OA a las dosis indicadas y se determinó la actividad PK 12 horas después de tratamiento de la OA. Los valores promedio de tres experimentos independientes se muestran como media ± desviación estándar. *, P & lt; 0,05, **, P & lt; 0,01. (B) La actividad de PK también se evaluó en células de cáncer expuestas con 100 OA g /ml en los puntos de tiempo indicados. Los valores promedio de tres experimentos independientes se muestran como media ± desviación estándar. *, P & lt; 0,05, **, P & lt; 0,01
doi:. 10.1371 /journal.pone.0091606.s002 gratis (PPT)
Figura S3.
PKM2 sobreexpresión rescatar a la elevación de la actividad PK inducida por el conmutador /PKM1 PKM2. Se evaluó la actividad de PK en células OA tratados con PC-3 transfectadas con PKM2- o vector que expresa GFP, 12 hr después del tratamiento de 100 mg OA /ml. Los valores promedio de tres experimentos independientes se muestran como media ± desviación estándar. *, P & lt; 0,05
doi:. 10.1371 /journal.pone.0091606.s003 gratis (PPT)