Extracto
KRAS
está mutado en ~ 40% del cáncer colorrectal (CCR), y no se limitan tratamientos eficaces para avanzados
KRAS
mutante CRC. Por lo tanto, es crucial que los mediadores aguas abajo de KRAS oncogénicos se siguen estudiando. Se identificaron como p190RhoGAP ser fosforilado en la línea celular DLD1 CRC, que expresa un heterocigoto
KRAS
alelo G13D, y no en DKO4 en la que el alelo mutante ha sido eliminado por recombinación somática. Hemos encontrado que una pareja de unión ubicua de p190RhoGAP, p120RasGAP (RasGAP), se expresa en niveles mucho más bajos en comparación con las células DKO4 DLD1, y esta expresión está regulada por KRAS. Rescate de expresión RasGAP en DKO4 rescató Rho activación de la vía y la tumorigenicidad parcialmente rescatado en células DKO4, lo que indica que la combinación de KRAS mutantes y expresión RasGAP es crucial para estos fenotipos. Llegamos a la conclusión de que RasGAP es un efector importante de KRAS mutado en el CCR
Visto:. Organ SL, Hai J, N Radulovich, Marshall CB, Leung L, Sasazuki T, et al. (2014) p120RasGAP es un mediador de la vía de activación de Rho y tumorigenicidad en la línea celular de cáncer colorrectal DLD1. PLoS ONE 9 (1): e86103. doi: 10.1371 /journal.pone.0086103
Editor: Julieta Spencer, Universidad de San Francisco, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Octubre, 2013; Aceptado: 5 de diciembre de 2013; Publicado: 21 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 de órgano y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo se apoya en partes por subvenciones de los Institutos canadienses de Investigación en Salud RP-64345 (MST), Sociedad de Investigación del cáncer de Canadá (MI), y el Ministerio de Salud de Ontario y cuidado a largo plazo. SLO es apoyado por el CIHR Banting y Best Premio de Investigación de Doctorado. MI titular de la Cátedra de Investigación de Canadá en Biología del Cáncer estructural. MST es la Cátedra M. Qasim Choksi en cáncer de pulmón de Investigación traslacional. La instalación UHN RMN es apoyado por la Fundación Canadiense para la Innovación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en América del Norte, el cáncer colorrectal (CCR) es la tercera forma más frecuente de cáncer tanto en hombres como en mujeres. En 2013, se estima que más de 100.000 nuevos casos serán diagnosticados en los Estados Unidos, lo que resulta en más de 50.000 muertes [1]. Aunque la tasa de muerte por cáncer colorrectal ha disminuido en un 3% en los últimos diez años [1], la enfermedad metastásica, lo más prominente en el hígado, se desarrollará en el 30% y el 40% de los pacientes con CCR, y el 50% morirá de CRC recurrencia [2]. La resección quirúrgica es el estándar para el tratamiento del CCR etapa temprana, pero las terapias eficaces limitados están disponibles para los pacientes avanzados [3]. El desarrollo de CRC implica un proceso de múltiples etapas con la acumulación de ambos cambios genéticos y epigenéticos, incluidas las modificaciones de la vía de KRAS [4].
KRAS
mutaciones ocurren en aproximadamente el 40-50% de CRC, con las mutaciones más comunes que se encuentran en el codón 12 (~ 80%) y el codón 13 (~ 20%) activar.
En la actualidad , los más nuevos tratamientos aprobados para la CRC están con el factor de crecimiento epidérmico específico del receptor (EGFR) inhibidores, como cetuximab y panitumumab, en combinación con la quimioterapia. Sin embargo, sólo los pacientes con tipo salvaje
KRAS
derivan beneficio clínico significativo de este tratamiento, como aquellos con
KRAS
mutaciones no muestran un beneficio significativo de supervivencia [5]. Por lo tanto, los estudios actuales están dirigidos a la búsqueda de nuevos efectores aguas abajo de mutante
KRAS
que se puede utilizar en combinación para inhibir la señalización de esta vía.
La actividad de RAS de tipo salvaje está estrechamente controlada por familias de proteínas GTP-asa de activación (BPA), que inactivan RAS, facilitando la hidrólisis del GTP unido, y factores de intercambio de GTP (GEFs), que facilitan la liberación del PIB para que RAS puede volver a unir GTP [6]. De la gran familia de RasGAPs que ahora se sabe, uno de los primeros identificados y más ampliamente estudiado es p120RasGAP, o simplemente RasGAP, el producto de la
RASA1
genes [7], [8]. La interrupción de la
RASA1
anticuerpo en ratones en embriones de letalidad en E10.5, debido al desarrollo aberrante sistema cardiovascular [9]. embriones de ratones transgénicos creados a partir de RNAi mediada
RASA1
caída en células ES demostraron que la severidad de los defectos vasculares en correlación con el nivel de expresión RasGAP residual, y embriones de mosaico conviértase defectos [10] localizada. De acuerdo con estos estudios con ratones, las mutaciones en el
RASA1
genes se han relacionado con capilares venosos familiar síndromes de malformaciones que pueden presentar una amplia gama de fenotipos, más comúnmente que se conoce como "mancha de vino de Oporto" [11] , [12], [13], [14], [15]. análisis proteómico reciente de estas lesiones cutáneas mostró constante disminución de la expresión de RasGAP en comparación con el tejido normal circundante [16]. Esto sugiere que en conjunto
RASA1
juega un papel crucial en la angiogénesis y el desarrollo vascular. Sin embargo, aunque la modulación de proteínas de RasGAP se ha encontrado en varias neoplasias incluyendo la leucemia mielógena crónica [17], astrocitoma [18], tumores trofoblásticos de [19], cáncer de próstata [20], cáncer de hígado [21], y el carcinoma de células basales [22 ], necesariamente no se han encontrado niveles de proteína que se correlaciona con la actividad de RAS o gravedad del cáncer [22], [23]. Por lo tanto, el papel de RasGAP en el cáncer aún no se ha aclarado.
La configuración del dominio SH2-SH3-SH2 en la región N-terminal de RasGAP ha sugerido durante mucho tiempo a los investigadores que RasGAP podría desempeñar un papel como un adaptador de señalización proteínas, contribuyendo a, además de ser independiente de, su actividad GAP [7], [24]. Es importante destacar que se encontró que estos dominios para unirse a la tirosina fosforilada p190RhoGAP (aquí referido como RhoGAP) en respuesta a la actividad de quinasa aguas arriba y la adhesión celular [25], [26], [27]. Este hallazgo proporciona la primera evidencia mecanicista de una relación entre la activación del SRA y la vía de señalización Rho. Recientemente nuestro grupo ha encontrado que RhoGAP se convierte en tirosina fosforilada aguas abajo de c-MET señalización en el mutante DLD1
KRAS
línea celular CRC [28]. Por lo tanto, hemos tratado de determinar el papel de KRAS activos en la interacción RhoGAP-RasGAP, y el efecto de esta interacción en las células tumorales de CRC.
Procedimientos Experimentales
Cultivo de células
DLD1 (ATCC, Manassas, VA) es una línea celular de cáncer colorrectal que es heterocigoto para el G13D
KRAS
mutación. células DKO4 se derivaron de DLD1 por la ruptura de la mutante
KRAS
alelo por recombinación somática [29]. Ambas líneas celulares se cultivaron de forma rutinaria en Modificado de Dulbecco medio de Eagle (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS).
Modulación de la expresión génica
El RASA1 sobreexpresan vector lentiviral se construyó usando el Sistema de recombinación gateway (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA). vector de entrada que contiene ya sea promotor de CMV o RASA1 ORF (OpenBiosystems, ThermoScientific, Ottawa, ON) se recombina con PLENTI-CMV-GFP-DEST vector (plásmido Addgene 19732) crear pLentiCMV y pLentiRASA1. células HEK293T fueron transfectadas con estos vectores plenti y vectores de empaquetamiento lentiviral tal como se describe anteriormente [30]. se recogieron los sobrenadantes virales, se filtraron y se utilizaron para infectar células diana en presencia de 4 mg /ml de polibreno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 72 horas después de la transducción, las células fueron ordenados para la expresión de GFP. Para la sobreexpresión del gen KRAS mutantes, los retrovirus se generaron mediante transfección de células de empaquetamiento ecotrópico en Phoenix con la pBabePuro vector retroviral que contiene ya sea de tipo salvaje KRAS-4B, el mutante
KRAS
construcciones, o vector vacío utilizando Fugene 6 transfección reactivo (Promega, Madison, WI). sobrenadantes retrovirales se recogieron como anteriormente, y se seleccionaron las células con 0,5 mg /ml de puromicina (ICN Biomedicals, Irvine, CA) hasta que no hay control de las células no transfectadas se dejaron con vida.
inmunoprecipitación y Western Blot
Las células se lisaron en un Triton-X 100 tampón 1% (1% de Triton X-100, 10% de glicerol, HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, pirofosfato de sodio 10 mM, NaF 100 mM, Na 10
4P
2O
4, 1 mM EDTA, 1 ortovanadato de sodio mM además de un mini tableta de inhibidor de proteasa libre de EDTA completos (Roche, Laval, QC), se les permite descansar en hielo durante 10 minutos y luego se aclaró por centrifugación a 14.000 g a 4 ° C durante 30 minutos. la concentración de proteína de normalización se realizó mediante Bradford reactivo de ensayo de proteínas (Bio-Rad, Hercules, CA). para las inmunoprecipitaciones, concentración de proteínas se logró la igualdad entre las muestras, y los lisados se combinaron con 2-5 l de anticuerpo y se dejó a la roca durante la noche a 4 ° C. 30 l de proteína G-PLUS perlas de agarosa (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) se combinaron con los lisados y se balanceó durante 1 hora a 4 ° C. Las proteínas inmunoprecipitadas se lavaron a continuación 3 veces con tampón de lisis, se eluyó con 20 l de tampón de muestra 2xSDS y se hirvió durante 5 minutos. lyates de células enteras se normalizaron para la concentración de proteínas, combinado con tampón de muestra 6xSDS y se hierve durante 5 minutos también. Los lisados se cargaron entonces sobre un gradiente de 4-20% de SDS en gel de poliacrilamida (Bio-Rad) y funcionar a 120 V. Los geles se transfirieron a membranas de PVDF, antes de ser bloqueado, ya sea con 5% de leche desnatada seca en TBST o 5% de BSA en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se sondeó durante la noche con anticuerpo apropiado. Westerns se sondearon con el anticuerpo secundario apropiado, reaccionaron con ECL primer (GE Healthcare, Piscataway, NJ) y se expusieron a la película de radiografía para la cantidad adecuada de tiempo. Los anticuerpos se utilizan según las indicaciones:. B4F8 clon RasGAP y el clon anti-fosfotirosina 4G10 (Merck Millipore, Billerica, MA), p190A-RhoGAP (Señalización Celular, Danvers, MA), GAPDH y KRAS 4B clon F234 (Santa Cruz Biotechnology)
cuantitativa en tiempo real PCR
el ARN total (1-2 mg) se aisló a partir de líneas celulares y tejidos utilizando un kit Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) y fue transcrito de forma inversa utilizando con superíndice III transcriptasa inversa (Invitrogen, Life Technologies, Burlington, ON). Un equivalente 10 ng de cDNA se utilizó para cada ensayo de PCR cuantitativa (qPCR) realizado con el sistema de detección de secuencias Mx3000P Stratagene utilizando SYBR Green 2 × mezcla maestra. Los cebadores utilizados son:
GAPDH F - CCCCCACCACACTG, España
GAPDH R - GCCCCTCCCCTCTTCAAG
RPS13 F - GTTCTGTTCGAAAGCATTG
RPS13 R - AATATCGAGCCAAACGGTGAA
RASA1 F - GGACGAAGGTGACTCTCTGGAT
RASA1 R - GGAGGAGCGGTCAACGGTAT
KRASF - CAGGCTCAGGACTTAGCAAGAAG
KRASR-TGTTTTCGAATTTCTCGAACTAATGTA
Pronósticos secuencias de los productos de PCR fueron verificadas mediante el uso de BLAST para el reconocimiento de secuencias objetivo y no objetivo. Los resultados fueron analizados utilizando el método de Ct delta-delta, la normalización frente a la media de los dos genes de limpieza.
ensayos basados en células
Recuento de células.
5 × 10
3 células se sembraron en medio de suero completo, por triplicado, durante 5 días de recuento en un placa de 24 pocillos. Comenzando a las 72 horas después de la siembra, 3 pocillos de cada línea de células se tratan con tripsina y después se contaron usando un contador de células Coulter Z2 Beckman (Beckman-Coulter, Brea, CA).
ensayo de adhesión celular.
1 × 10
5 células fueron sembradas en una placa de 24 pocillos recubierta con colágeno 0,01% PureCol (Sigma-Aldrich) durante 15 minutos. Los pocillos se tiñeron con 0,2% de cristal violeta y se lisaron con 0,1% Triton X-100. El lisado se leyó a 590 nm en un lector de placas Tecan XFlour4 (Mannedorf, Suiza).
ensayo de la motilidad celular.
7 × 10
4 células se sembraron en 70 l de plena medio de suero en cada lado de un inserto de cultivo celular μ-plato (ibidi, Planegg, Alemania) en una placa de cultivo celular de 24 pocillos y se dejaron crecer durante 72 horas o hasta que se alcanzó una monocapa confluente. El inserto se retira y se cambió el medio por DMEM libre de suero. imágenes de contraste de fase se adquirieron en el Zeiss Axio Observador se utilizó para tomar una fotografía a 32 × magnificación en este momento (tiempo 0) y cada 24 horas a partir de entonces. Análisis de imágenes se realizó como se describió anteriormente [31]. Image-Pro Plus software (MediaCybernetics, Rockville, MD) se utilizó para analizar los ensayos de curación de heridas. El uso de filtros de aristas y la segmentación, las áreas con grandes variaciones de intensidad de píxel (células) aparecen la luz, mientras que las zonas lisas de la imagen (herida) se ven oscuras. A continuación, la imagen filtrada se convierte en una imagen binaria mediante la aplicación de un umbral de pixel y la zona de la herida se determinó contando la suma de píxeles asignados. La suma de píxeles se expresó como el cierre de la herida por ciento, donde cero píxeles en la herida representa cierre 100%.
inmunofluorescencia
Vidrio cámara de diapositivas (BD Biosciences, San Jose, CA) se recubrieron durante la noche a 4 ° C con colágeno 0,01% en PBS. células Trypsanised se resuspendieron en DMEM + 5% de BSA, chapado en portaobjetos y se dejaron adherir durante la noche. Diapositivas luego se lavaron una vez con PBS y se fijaron con paraformaldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se permeabilizaron con 0,01% de Tween-20 en PBS durante 20 minutos, se bloquearon con 3% de BSA en PBS y se tiñeron con faloidina 1:300 rodamina durante 1 h a temperatura ambiente. cubreobjetos de vidrio se aplicaron con Vectashield que contiene DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) para la tinción nuclear. Las imágenes presentadas aquí fueron tomadas a 43 aumentos, con un objetivo de inmersión en aceite en un microscopio confocal Zeiss LSM 700.
CRC recogida de muestras
muestras de tejido de pacientes se obtuvieron de la UHN congeladas instantáneamente banco de tejidos tras la aprobación por la Junta de Ética de Investigación de UHN. Todos los tejidos se recogieron a los 30 minutos de la resección y se congelaron en nitrógeno líquido, además de ser fijados con formol y embebidos en parafina (FFPE), y su calidad ha sido verificado por la histología. Los tejidos incluyen 63 cánceres colorrectales primarios y 30 tipos de cáncer colorrectal metastásico. Los tumores metastásicos eran de hígado (22 casos) y pulmón (8 casos) especímenes Metastasectomía.
análisis de la mutación RASA1
cDNA fue aislado de las líneas celulares de tejidos del paciente como se describió anteriormente a partir de ARN total.
RASA1
cDNA se amplificó primero con 6 grupos de cebadores para cubrir la longitud del gen, y la secuencia se realizó en el ADN amplificado con estos mismos cebadores correspondientes, los cuales son los siguientes:
F1 - CTCAGCCTGGGGAGCTGAAGG
R1 - TGGAGGAGCGGTCAACGGTATG (pb 2-649)
F2 - GGCCTCGGGACAGTGGACGA
R2 - GGGCCTCACAAGAAAACTGCAGAC (pb 563-1252)
F3-AGGTGGGCCGGGAAGAAGATCC
R3-TCCAATCCTCTGCTTGTTCTGGAGT (pb 1131-1823)
F4-TGGCAGGCCAAACTGTTTTCAGA
R4-TGCTGGCCAGTAGTGTTCGGT (pb 1723-2381)
F5-CCGAACACTACTGGCCAGCATCC
R5 - TGACACCTTCCATGTAGGGCTCC (pb 2362-2987)
F6-CGACTCATCTGTCCTGCCATCCT
R6 - CTGGGGCGAAGGCTGCTACC (pb 2.825-3.277)
Para la amplificación por PCR, 0,3 ul cada uno del avance y retroceso se añadieron cebadores (50 uM) de 6 ul de ADNc (20 ng /ul), 12,5 ul de 2x Taq seleccione DNA polimerasa, 0,2 ul de dNTP 25 mM y agua ultra-pura (Sigma-Aldrich) a un volumen total de 25 ul de cada reacción. Las condiciones de ciclación fueron: 95 ° C durante 10 min, seguido de 39 ciclos, con desnaturalización a 95 ° C durante 45 ", hibridación a 64 ° C durante 45", y extensión a 72 ° C durante 1 min, de una incubación de 10 minutos a 72 ° C seguido de un 4 ° C. 5 ul de producto de PCR se comprobó en un gel de agarosa al 2%. El producto de PCR se limpió con ExoSAP-IT (Affymatrix, Santa Clara, CA):.
Para validar la secuencia en el ADN genómico, los mismos métodos fueron utilizados como anteriormente, usando los siguientes cebadores para amplificar y secuenciar el exón 16 :
F - CGCTGCCAGTTGAGCCGATTACA
R - CTCTGGCATCATTGTGCTACTAAGC
real-Time RMN actividad GAP ensayo
dominio GTPasa con etiqueta de RAS 1-171 se expresa a partir de pET15b vectores en
E. medios coli
en M9 suplementado con
cloruro de amonio 15N y se purificaron por cromatografía de afinidad Ni-NTA. Sus etiquetas se separaron por escisión de trombina y GTPasas monoméricas se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de filtración en gel (Superdex 75) [32], [33]. Las muestras se concentraron, y si es necesario intercambiaron en tampón de RMN (por ejemplo, 25 mM HEPES pH 7,0, NaCl 100 mM, MgCl 5 mM
2, DTT 1 mM, y 10% D
2O).
Para ensayar la hidrólisis de GTP intrínseca, una muestra de GTP-cargado fue preparado mediante la incubación de la proteína RAS (~ 10 min a 37 ° C o más a temperatura ambiente) en presencia de 10 veces el exceso molar GTP y EDTA 10 mM [34 ]. Tras el intercambio, MgCl
2 se añade a una concentración final de 20 mM para estabilizar el nucleótido recién unida, y la muestra pasa a través de una columna de filtración en gel o de desalación (PD MidiTrap ™ G-25 (GE Healthcare) equilibrada con NMR tampón para eliminar el exceso de nucleótidos y entonces la muestra eluida se concentró rápidamente y se congeló.
las células se recogieron por raspado en un volumen mínimo (150 ml para una placa de 10 cm) de tampón de lisis como se describe para la transferencia Western, luego se aclaró por centrifugación breve (16.000 g durante 30 s) y la proteína celular total en el sobrenadante se analizó utilizando el reactivo de ensayo de Bradford (BioRad) para estandarizar la cantidad de proteína utilizada en cada ensayo. Una concentración de 10 a 20 g /l proteína total en el lisado se consiguió y se añadió 35 ug en 3.5 l al fragmento unida a GTP purificada RAS.
la recolección de datos se inició posteriormente lo más rápidamente posible. la mitad de vida de las reacciones se calcularon inicialmente mediante inspección visual de los espectros, a continuación, la fracción del PIB determinada GTPasa presente en cada punto de tiempo se evaluó a partir de varios pares de picos y los datos se ajustaron a una función de decaimiento exponencial monofásica para obtener los tipos de cambio /de hidrólisis [35].
actividad RAS ensayo
las células fueron suero de hambre durante 24 horas y luego se ensayaron con respecto a ras activa utilizando el kit de activación de RAS (Millipore) según las indicaciones. Brevemente, las células se lisaron en tampón de lisis 1x MLB y cantidades iguales de proteína se mezclaron con el RAS-dominio de unión de RAF1 fusionada a glutatión
S
transferasa y acoplado a perlas de glutatión-Sepharose. Después de balanceo a 4 ° C durante 1 h, las perlas se lavaron en el mismo tampón de lisis y se resuspendieron en tampón de muestra 2x SDS. Western Blot se desarrolló como se ha descrito anteriormente.
ensayo de tumorigenicidad subcutánea
Ética Declaración.
Todas las manipulaciones se realizan para minimizar el sufrimiento animal, de acuerdo con los protocolos aprobados por el Instituto de Cáncer de Ontario Cuidado de animales (OCI) en el marco del uso de animales número de protocolo AUP 736,9.
severa combinar inmunodeficientes (SCID) los ratones fueron criados en el lugar y obtuvieron del Instituto del cáncer de Ontario (OCI, Toronto, ON). Un millón de células se inyectaron por vía subcutánea en la región del hombro derecho de 4 a 6 semanas de edad, los ratones SCID machos (n = 5-8 por línea celular). Una vez que los tumores eran palpables que se midieron cada 3 días hasta que se alcanzó punto final humano, que era o bien cuando los tumores alcanzaron 1,5 cm, o cuando se convirtieron en ulceradas al punto de angustia animal. El volumen del tumor se midió usando la fórmula (longitud x anchura
2) x π /6. Los ratones fueron sacrificados mediante CO
2, tal como fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la OCI, se extirparon los tumores, y las porciones eran o bien se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido para el aislamiento de ADN y proteínas o fijado en formol para inclusión en parafina y tinción inmunohistoquímica. Para el análisis estadístico, se utilizó un modelo de efectos mixtos lineales (LME) para incorporar la alta correlación que ocurre entre las mediciones tomadas en el mismo ratón. Todas las mediciones de volumen de los tumores se transformó de raíz cuadrada para estabilizar la varianza, y se utilizó Wald p-valor para indicar la significación.
Resultados
Pérdida de RasGAP conduce a la pérdida de la fosforilación RhoGAP
Para estudiar más a fondo el papel de la fosforilación en las células DLD1 RhoGAP, se investigó su interacción con RasGAP, uno de sus principales socios de unión. Al mismo tiempo, queríamos saber si la pérdida de mutante
KRAS
en la línea celular derivada isogénica DKO4 tendría un efecto sobre esta interacción. Se encontró que RhoGAP sólo podía ser fosforilada en células DLD1, no en DKO4, mientras que los niveles totales de RhoGAP permanecen sin cambios. Este fosforilada RhoGAP co-inmunoprecipitado con RasGAP (Figura 1A). Además, hemos encontrado que la expresión de RasGAP no era detectable en la línea celular DKO4 (Figura 1A). Se ha informado de que la fosforilación RasGAP con frecuencia se produce aguas abajo de la tirosina quinasa del receptor de señalización [18], [36], [37], [38], [39]. Sin embargo, encontramos que el principal tirosina banda que aparece después de la inmunoprecipitación de RasGAP era en realidad en ~190 kDa, más probable es que representa RhoGAP (Figura 1A), lo que indica que sí RasGAP no es altamente fosforilada en estas células fosforilados.
A) RhoGAP y RasGAP se inmunoprecipitaron a partir de células DLD1 y DKO4. Los inmunoprecipitados se sometieron a transferencia de Western y se sondearon para el total de fosfotirosina, RasGAP y RhoGAP. Transferencia Western de lisados de células enteras (A) y RT-qPCR (C) se utilizaron para determinar la proteína total y los niveles de ARNm, respectivamente, en estas líneas celulares.
RasGAP expresión se pierde en las células DKO4
Se encontró que mientras que la línea celular DKO4 expresa poca o ninguna proteína RasGAP comparación con DLD1, los niveles de mRNA de la
RASA1
gen se mantuvo en el 50% de la línea de célula madre (Figura 1, B & amp; DO). Se realizó SNP arrays para examinar las posibles alteraciones en el número de copias entre estas parejas de células isogénicas. Encontramos muy poca diferencia entre las dos líneas celulares (datos no mostrados). Un resultado similar se encontró recientemente en una serie de clones alternos (DKO3 y DKO1) derivadas del modelo DLD1 [40]. Es importante destacar que no se observaron diferencias en el número de copias del cromosoma 5q13.3, demostrando que la disminución en el nivel de ARNm en DKO4 no se debe a la pérdida cromosómica.
RasGAP mutación en CRC
A continuación, buscamos mutaciones que podrían explicar las diferencias en el nivel de expresión RasGAP. Hemos secuenciado tanto el ADN genómico y el ADNc a partir de células DLD1 y DKO4. Se encontró una mutación puntual heterocigotos en el ADN genómico de ambas líneas celulares. Esta C & gt; T transición es una mutación sin sentido, que codifica un cambio R709 * (Figura 2, A & amp; B), que se encuentra entre los dominios C2 y RasGAP de RasGAP. Si el gen mutado se traduce en una proteína truncada, una banda de ~77 kDa debería haber sido detectable en transferencias de Western, usando un anticuerpo RasGAP que reconoce la porción N-terminal de la proteína. Sin embargo, no hemos visto una banda de este tamaño en cualquier condición celulares.
A) cromatograma que muestra las intensidades relativas de cada par de bases después de la secuenciación de Sanger, tanto en el ADNc genómico y derivados de las líneas celulares. B) Ilustración de localización de la mutación en el nivel de la proteína RasGAP. datos C) de expresión RASA1 derivados de todas las líneas celulares en la línea celular de amplio Cáncer Institute enciclopedia. Las barras representan la media.
Curiosamente, la secuencia de ADNc en las líneas celulares DLD1 y DKO4 mostró que la línea celular DLD1 había perdido casi por completo la expresión del gen mutado, expresando sólo el de tipo salvaje, mientras que el DKO4 línea celular mantiene el 50% de cada uno de los de tipo salvaje y mutante
RASA1
producto génico (Figura 2A).
Se buscó la presencia de la mutación C2330T en los tejidos tumorales y metástasis primarias de CRC pacientes, pero no fueron capaces de identificar esta mutación en cualquiera de nuestras muestras. Sin embargo, hemos sido capaces de encontrar esta mutación en tres líneas celulares a partir de la línea celular de cáncer de amplio Instituto Enciclopedia (http://www.broadinstitute.org/ccle) [41]: las líneas celulares de cáncer colorrectal y HRT18 HCT15, así como la línea celular de cáncer urinario tracto 639 V. Esto implica que, aunque la mutación es rara, está presente en ciertos tipos de cáncer. Esta mutación también no se encuentra en la base de datos de SNP humanos, lo que implica que no se encuentra en la población en general.
Para investigar más a fondo nuestra hipótesis de que la mutado
RASA1 Versión taquigráfica es inestable y posiblemente degradado, se compararon los niveles de expresión de ARNm de
RASA1
en las tres líneas celulares que contienen la mutación C2330T al resto de las líneas celulares de cáncer en la línea celular enciclopedia. Estas tres líneas de células expresan significativamente menos
RASA1
que la mayoría de otras líneas celulares de cáncer en la base de datos (Figura 2C). Aunque no es concluyente, esto parece indicar que esta mutación truncar podría resultar en la disminución de la expresión génica ARNm.
Estos hallazgos sugieren varios niveles de regulación de RasGAP, todos posiblemente como resultado de la pérdida de KRAS activos en DKO4. En primer lugar, la falta completa de mRNA p120RasGAP mutante en la línea celular DLD1 como se detecta por secuenciación indica que, o bien el alelo mutante no se transcribe en ARNm en esta línea celular, o que el mRNA mutante es muy inestable y se degrada inmediatamente después de ser transcrita. Curiosamente, aunque el mRNA mutante estaba presente en la línea celular DKO4, la disminución de 50% en general
RASA1
niveles de mRNA detectado por qPCR en tiempo real sugieren que este ARNm mutante también se degrada, pero posiblemente no tan rápidamente o tan eficientemente como en DLD1
en total, parece que la pérdida de KRAS activos en DKO4 disminuye la presión en la celda para estabilizar la expresión de RasGAP, tanto en el nivel de ARNm y proteína.; sin embargo, el mecanismo por el cual los niveles de proteína de RasGAP están reguladas en estas líneas celulares en aún se desconoce.
Regulación de la expresión de ARNm RasGAP por KRAS mutado
Para aclarar el papel que la pérdida de mutante
KRAS Hoteles en DKO4 juega en la expresión de RasGAP, que sobreexpresa de forma estable el pBabePuro (PBP) vector vacío, vector que contiene la longitud completa de tipo salvaje
KRAS
, o vector que contiene
KRAS
con mutaciones puntuales en el codón 12 (G12V o G12D) o el codón 13 (G13D), en células DKO4. La hipótesis de que la mutación G13D tendría el efecto más grande en la estabilización y el rescate de la expresión RasGAP en DKO4, debido a esta mutación es la que se produjo originalmente en esta línea celular. Sin embargo, después de varios intentos, sólo hemos podido sobreexpresan el
KRAS
G12V gen mutante en esta línea celular (Figura 3A). La sobreexpresión de G12V fue acompañado por un aumento general de GTP-KRAS, como se esperaba (Figura 3C). Curiosamente, la transfección transitoria de estos constructos mostró que KRAS fue capaz de ser sobreexpresado hasta 7 días después de la transfección con todos los mutantes, indicando que la expresión a largo plazo de KRAS construye otro que G12V no se mantuvieron en DKO4. La sobreexpresión de
KRAS
G12V causó un aumento significativo en
RASA1
ARNm; sin embargo, este aumento no fue vista en el nivel de proteína (Figura 3, B & amp; C). Curiosamente, a pesar de que no hemos podido detectar ninguna
KRAS
sobreexpresión con el mutante G13D, todavía observó un ligero aumento de
RASA1
la expresión de ARNm, aunque no fue significativa (p-valor = 0,074).
de tipo salvaje (WT) o mutante del gen KRAS se sobreexpresa en las células DKO4. ARNm se extrajo de las células y se cuantificó mediante RT-qPCR para medir KRAS (A) o RASA1 (B). C) transferencia de Western que muestra los niveles de estas proteínas, junto con el estado de activación de KRAS. Correlación de mRNA (D) y la expresión de proteínas utilizando el análisis de densitometría de Western Blot (E) de KRAS y RASA1 después desmontables de KRAS usando 11 shRNAs diferentes. Para la correlación de proteínas, se excluyeron los valores atípicos más de 3 desviaciones estándar de la media. Todo es relativo a la cuantificación vector vacío. El análisis estadístico de expresión utilizando unpaired t-test, *** p & lt; 0,001, * p & lt; 0,05
Para investigar más el papel de KRAS activos en la expresión RasGAP, transfectadas transitoriamente células DLD1 con 11. shRNAs separados contra
KRAS
. Se encontró una correlación significativa entre la cantidad de
KRAS
caída y la disminución de
RASA1
la expresión del ARNm en comparación con el control no específica shRNA (Figura 3D). Sin embargo, estos cambios no se observaron en el nivel de proteína (Figura 3E). Para asegurarse de que KRAS shRNA desmontables causó ningún cambio significativo en los genes no específicos, Figura S1 A muestra los niveles de dos genes de limpieza que no son afectadas por la caída. Figura S1 B muestra las transferencias de Western de los que proceda la figura 3E.
En conjunto, estos resultados sugieren que la pérdida de activos KRAS juega un papel parcial en la estabilidad y /o expresión de
RASA1
ARNm, aunque los mecanismos adicionales que están presentes regular la expresión de la proteína en esta línea celular.
RasGAP rescates sobreexpresión RasGAP actividad
para determinar si alguno de los fenotipos se atribuyen a la pérdida de KRAS activos en la célula isogénica DLD1 líneas podrían explicarse por la pérdida de la expresión de la proteína RasGAP, overexpressed RasGAP en la línea celular DKO4 (Figura 4A). A pesar de nuestra capacidad para obtener & gt;. 100 veces la sobreexpresión de ARNm de RasGAP en la línea celular DKO4, los niveles de proteína resultantes fueron similares a la expresión endógena en las células DLD1 (Figura 4D) guía
A) la expresión del ARNm de RasGAP después de la sobreexpresión en las células DKO4 comparación con el control GFP vector. B) El análisis de RMN en tiempo real de la actividad de RasGAP, que muestra velocidad de hidrólisis de GTP (B) y la actividad GAP significa el tiempo (C). Cada curva en (C) se deriva de un solo experimento representativo. Las barras de error en (B) indican el error estándar de la media (SEM). D) ensayo de actividad de RAS que muestra los niveles de KRAS activo después de RasGAP sobreexpresión. Los números indican los valores de densitometría de esta mancha, que es representativo de tres réplicas biológicas. E) RhoGAP se inmunoprecipitó a partir de líneas celulares, se sometieron a transferencia de Western, luego probaron para el total de fosfotirosina, RasGAP y RhoGAP.
Para determinar si la sobreexpresión de RasGAP tuvo ningún efecto sobre la actividad del gen KRAS, un ensayo de actividad de RAS se realizó, utilizando perlas de agarosa Raf-RBD enlaces-para inmunoprecipitar KRAS activo (Figura 4D). Como se ha demostrado previamente [40], KRAS general fue menos activo en las células DKO4 comparación con las células DLD1. Vimos una leve pero significativa disminución en la actividad del gen KRAS en las células DKO4 después de
RasGAP
sobreexpresión, lo que indica que RasGAP es capaz de regular la de tipo salvaje KRAS en DKO4. Para aclarar aún más el papel de RasGAP en estas células, se utilizó un ensayo basado en RMN en tiempo real para determinar la actividad RasGAP. Se encontró que los niveles de actividad RasGAP fueron concordantes con expresión de la proteína RasGAP (Figura 4, B & amp; C). Los extractos de células DLD1 aceleraron RAS hidrólisis de GTP ~1.8 veces, mientras que los extractos DKO4, emparejados por contenido total de proteínas suscitó un modesto aumento de 1,2 veces la velocidad de hidrólisis. Estos resultados fueron consistentes con la presencia de la actividad basal de otros RasGAPs. RasGAP sobreexpresión en DKO4 planteó esta tasa de nuevo a ~1.8 veces.