Extracto
La helicasa p68 caja DEAD ARN (ddx5) es un importante receptor de andrógenos (AR) co-activador transcripcional en el cáncer de próstata (CaP) y ha terminado -expresada en la enfermedad en etapa tardía. β-catenina es una proteína multifuncional con importantes funciones estructurales y de señalización que está regulado en el CaP y similar a la de p68, interactúa con la AR a la expresión de los genes diana de AR co-active. Es importante destacar que, p68 forma complejos con nuclear β-catenina y promueve la transcripción de genes en el cáncer de colon que indica una interacción funcional entre estas dos proteínas en la progresión del cáncer. En este estudio, se explora la relación entre p68 y β-catenina en el CP para evaluar su potencial de cooperación en la expresión génica AR-dependiente, que puede ser de importancia en el desarrollo del cáncer de próstata resistente a la castración (CRPCa). Utilizamos inmunoprecipitación para demostrar una nueva interacción entre p68 y β-catenina en el núcleo de las células de CaP, que es dependiente de los andrógenos en células LNCaP, pero independientes de andrógenos en una hormona derivada refractario de la misma línea celular (representativo del tipo de enfermedad CRPCa). actividad AR mejorada se observa en los ensayos de reportero de luciferasa dependientes de andrógenos sobre transitorios co-transfección de p68 y β-catenina como un efecto aditivo, y p68-agotado cromatina Immunoprecipitation (CHIP) mostró una disminución en el reclutamiento de la AR y β- catenina a los andrógenos regiones promotoras de respuesta. Además, encontramos p68 inmunoprecipitada con la forma processive y de no procesamiento de la ARN polimerasa II (RNAP II) y mostrar p68 reclutados para el alargamiento de las regiones del AR mediada
PSA
gen, lo que sugiere un papel para p68 en la facilitación RNAP II transcripción de genes mediada por AR. Estos resultados sugieren que p68 es importante para facilitar la β-catenina y Ar actividad transcripcional en células de CaP
Visto:. Clark EL, Hadjimichael C, R Temperley, Barnard A, Fuller-Pace FV, Robson CN (2013) p68 /ddx5 Soporta β-catenina & amp; RNAP II durante receptor de andrógenos mediada por la transcripción en el cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (1): e54150. doi: 10.1371 /journal.pone.0054150
Editor: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Francia |
Recibido: 29 de mayo de 2012; Aceptó 7 de diciembre de 2012; Publicado: 17 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Clark et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la acción Caridad de próstata [PCRF9 /07 como CNR & amp; EL C]; y el Consejo de Investigación Médica, el Cancer Research UK, y el Departamento de Mecanismos de cáncer de próstata de la Salud de la progresión y tratamiento de la colaboración (Solicitud) [G0100100 /64424 como CNR]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el inicio y la progresión del cáncer de próstata (CaP) es impulsado por la función de la transcripción del receptor de andrógenos (AR), y la ablación de andrógenos es una estrategia eficaz en las etapas tempranas de la enfermedad [1]. Sin embargo, PCa puede progresar a un fenotipo resistente a la castración cáncer de próstata (CRPCa) que está actualmente intratables [1], [2]. la activación aberrante de la AR se cree que desempeñan un papel destacado en el desarrollo de CRPCa; un proceso postulado que es, en parte, mediada por la activación incontrolada de proteínas co-activador que facilitan la expresión de genes de respuesta AR en un entorno de hormona mínima [3]. La comprensión de los eventos moleculares por los cuales se produce la progresión a CRPCa, pueden conducir a la identificación de nuevos objetivos y mejorar la supervivencia de los pacientes con enfermedad
.
β-catenina es un componente integral de la vía Wnt, que juega un papel en la transducción de señales. La estabilización frente al citoplasma y la acumulación nuclear de β-catenina es el "sello" de la activación de la vía de señalización Wnt (ver revisiones [4], [5]). En células de la próstata, β-catenina se encuentra asociado con liganded AR y actuar como un AR co-activador mejorar tanto Wnt y andrógenos la transcripción de genes de respuesta (revisado en [6] - [8]). AR activado es capaz de lanzadera β-catenina en el núcleo y aumentar la transcripción AR, lo que indica una interacción dependiente de ligando [9]. Sin embargo, los xenoinjertos recogidas de ratones resistentes a la castración también demostraron un aumento de co-localización y la interacción de AR y β-catenina [10]. En las células LNCaP CaP en ausencia de andrógenos, H2-relaxina fosforilación de Akt y GSK-3β mediada causado el estabilizado acumulación citoplásmica de β-catenina que posteriormente ligado a la AR y transloca en el núcleo, lo que sugiere que la presencia de andrógenos no es esencial para la interacción entre AR y β-catenina en determinadas condiciones [11]. Curiosamente, la co-localización y la interacción de AR y β-catenina no se observó en los tumores recogidos de ratones no castrados, lo que sugiere que esta interacción es específica para la progresión de la PCa a CRPCa y garantiza una mayor investigación. La evidencia directa de β-catenina como parte del complejo de AR transcripcional se ha demostrado a través de inmunoprecipitación estudios de cromatina (ChIP), que muestran β-catenina reclutado para las regiones promotoras de ambos andrógenos y los genes Wnt de respuesta en presencia y en ausencia de andrógenos [11 ], [12]. Más evidencia sugiere que el crecimiento de células tumorales de próstata metastásico en el hueso se realiza a través de andrógenos mediada por la activación de Wnt [13], y el aumento de los niveles de ß-catenina nuclear se han correlacionado con la progresión de la enfermedad del cáncer de próstata [14], [15]. Además, la reducción o pérdida de E-cadherina, que normalmente secuestra β-catenina en la membrana plasmática se postula para aumentar los niveles de β-catenina celular y promover la actividad de AR [7]. Colectivamente, los datos sugieren un papel importante para β-catenina en la progresión de CaP al fenotipo CRPCa. Sin embargo, está claro que los mecanismos precisos por los cuales β-catenina medie AR actividad transcripcional y el crecimiento de CRPCa en ausencia de andrógenos, merece una mayor investigación.
El p68 RNA helicasa (ddx5) es un crecimiento y el developmentally- prototípica regulada de la familia de caja DEAD helicasas. funciones p68 en muchos procesos celulares dysregulated comúnmente en el cáncer incluyendo el procesamiento de pre-ARNm y empalme alternativo, la proliferación celular, el procesamiento microRNA (revisado en [16], [17]), y la biogénesis de ribosomas [18]. p68 también se sabe que interactúan con varios componentes del complejo de la transcripción y para co-activar diversos factores de transcripción tales como p53 supresor de tumores, del receptor de estrógeno α (ER) y β-catenina (revisado en [16], [19], [20 ]). Hemos demostrado anteriormente p68 sobre-expresado en CaP y que funciona como un co-activador de la AR [21]. Además de los tumores de próstata, p68 se sobre-expresa en muchos otros tipos de células de cáncer como el de colon y de mama, lo que sugiere que p68 actúa como un promotor potencial tumor ([22] y revisado en [17]). p68 y la p72 proteína altamente homóloga (ddx17), están sobre-expresadas y forman complejos con β-catenina en el núcleo de las células de cáncer de colon para activar la transcripción de genes y promover la proliferación celular [22] - [24]. La tirosina p68 593 fosforilada también asociada con β-catenina en el citoplasma de células de cáncer de colon, donde promueve β-catenina translocación nuclear a través de una vía de RanGTPase Wnt-independiente a través de la interacción con β-catenina y el desplazamiento de Axin [25], [26 ]. Sin embargo, la investigación en conflicto no encontró ninguna prueba de que se requiere p68 para la translocación nuclear de β-catenina en el mismo tipo de células [27], y la tirosina p68 593 fosforilada no difirió del de tipo salvaje en su capacidad para estimular la transcripción dependiente de β-catenina en otro estudio [23].
en este artículo, utilizamos inmunoprecipitación, técnicas de chip y reportero de la luciferasa en combinación con siRNA oligo caída de nucleótidos, para explorar la relación de p68 con β-catenina para comprender el mecanismo molecular por el que potencialmente mediar la activación aberrante de la AR y el crecimiento de las células de CaP, como parte del complejo transcripcional AR.
resultados
p68 y β-catenina Interact en el núcleo de las células de CaP
Teniendo en cuenta que el receptor de andrógenos (AR) asocia de forma independiente con β-catenina y p68 en células de CaP [21], [28], y p68 y β-catenina interacciona en células de cáncer de colon [23]. Especulamos una posible interacción de proteínas de tres vías entre la AR, β-catenina y p68 en células de CaP. Ligando AR libre es secuestrado en el citoplasma de células de CaP y sobre la hormona de unión mueve predominantemente en el núcleo [29]. Anteriormente, hemos encontrado p68 que es una proteína nuclear en células de CaP cuya localización no fue modificado por el tratamiento de andrógenos [21]. Sin embargo, p68 se ha encontrado en el citoplasma de las células de cáncer de colon, donde se asocia con β-catenina [23], [25], y β-catenina se ha demostrado que interactúan con el AR en el citoplasma de células de CaP y pasar a la núcleo en la presencia y ausencia de andrógenos [9] - [11]. A la luz de estos resultados, hemos tratado de confirmar la localización de β-catenina y p68 en el LNCaP y la línea celular LNCaP-AI CaP refractario hormonal (ver materiales y métodos). Como era de esperar en respuesta al tratamiento R1881 (10 nM), AR transloca en el núcleo, tanto en células LNCaP-ai (Figura 1A) y LNCaP. tratamiento de andrógenos no alteró significativamente la localización nuclear de p68 en células LNCaP-ai LNCaP o y de manera similar, la localización de β-catenina se mantuvo sin cambios después del tratamiento R1881. Proporcionalmente menos β-catenina se encuentra en el núcleo en comparación con el citoplasma de las células LNCaP, con proporcionalmente mayor en el tipo celular LNCaP-AI. Esto refleja los hallazgos previos que demostraron AR constitutivamente lanzaderas β-catenina en el núcleo de las células LNCaP-AI como una adaptación a las condiciones del andrógeno independientes [10], [12].
A. imágenes inmuno-blot recortadas muestran LNCaP citoplasmática y nuclear y lisados de células LNCaP-AI PCA (+/- 10 nM R1881, 8 horas), sondeado secuencialmente con unión (TBP) anticuerpos β-catenina, AR, p68, α-tubulina y TATA . B. La interacción de p68 ectópico y β-catenina en células COS-7. lisados de células enteras de células COS-7 transfectadas con pcDNA
3-p68-myc y los PC
3 + myc
6-β-catenina construye (+/- 10 nM R1881, 8 horas), eran inmunoprecipitaron con β-catenina y el anticuerpo p68 respectivamente. Recortadas inmuno-blots se probaron sucesivamente con β-catenina, p68 y antibody.C myc. La interacción de p68 endógeno y β-catenina en el núcleo de las células LNCaP y LNCaP-AI CaP en presencia y en ausencia de andrógenos. imágenes recortadas inmuno-blot de LNCaP y LNCaP-AI lisados nucleares, inmunoprecipitadas con anticuerpo p68 (+/- 10 nM R1881, 8 horas), y se sondeó secuencialmente con β-catenina y p68. muestras de extracto de células contienen ya sea total o lisado y proteína G sefarosa nuclear sin anticuerpo presente. Control (Con) las muestras contienen anticuerpos y la proteína G Sepharose en tampón de extracción solamente.
Co-inmunoprecipitación de lisados de células HCT-116 con el anticuerpo β-catenina identificado una interacción de p68 endógeno con β-catenina en su totalidad lisados de células de cáncer de colon [23]. Un análisis más detallado usando truncamientos etiquetados-Myc de p68 demostró que el extremo COOH de p68 fue capaz de interactuar con β-catenina, y la interacción fue a través de la helicasa (N-terminal) de dominio de p68. Siguiendo nuestros hallazgos inmuno-blot en la Figura 1A, donde tanto β-catenina y p68 se encuentran en el núcleo de las células LNCaP y LNCaP-AI en presencia y en ausencia de andrógenos, se investigó si p68 y β-catenina interactuaron directamente en el núcleo de células de CaP. La Figura 1B muestra ectópico co-inmunoprecipitación de sobre-expresado p68 myc-etiquetada y proteínas de fusión de β-catenina en la línea celular negativa del receptor de andrógenos COS-7, tanto en la presencia y ausencia de R1881 (10 nM). Demostrar que, en
in vitro | condiciones actuales, p68 y β-catenina son capaces de unirse directamente con independencia de AR y los andrógenos. (N. B. la banda superior en la transferencia de inmunoprecipitación β-catenina es una banda no específica detectada por el anticuerpo myc). Sin embargo, la proteína endógena se inmunoprecipitó a partir de extractos LNCaP nucleares mostró la interacción β-catenina-p68 fue facilitada en presencia de andrógenos (R1881, 10 nM), pero por el contrario en la línea celular LNCaP-AI la interacción fue facilitada en ausencia de andrógenos ( R1881, 10 nM) (Figura 1C). (N. B. la inmunoprecipitación inversa usando anticuerpos β-catenina para tirar hacia abajo la proteína p68 no mostró una interacción entre las dos proteínas, ya sea en el LNCaP o tipo de células LNCaP-AI, a pesar de numerosos intentos con diferentes anticuerpos para ß-catenina). También se encontró ninguna interacción endógena entre p68 y β-catenina en la línea celular PC3 negativo AR (véase la figura S1 en la información de apoyo), lo que indica que la presencia de un AR funcional es posiblemente importante para una interacción endógena de p68 y β-catenina en células de CaP [21], [28].
p68 interactúa con RNAP II y es reclutado para regiones funcionales de la
PSA
génica
Hemos descrito previamente como p68 funcionamiento como un "adaptador" o proteína "de acoplamiento 'que pueden coordinar los procesos estrechamente integradas de iniciación de la transcripción, elongación y empalme del ARNm en la expresión génica AR-regulado [30]. El reclutamiento de p68 a genes de respuesta AR endógenos puede facilitar el montaje spliceosome y aumentar la tasa de alargamiento de la ARN polimerasa II (RNAP II), lo que afecta el reconocimiento del sitio de empalme y la promoción de la omisión de exón en las transcripciones nacientes. Debido a los roles establecidos ß-catenina y el juego de p68 en el inicio de la transcripción de los genes regulados AR, hemos tratado de ampliar estos hallazgos e investigar la relación de p68 con RNAP II en células de CaP. Encontramos p68 inmunoprecipitaron con tanto endógenas processive (fosforilación en Ser-2) y de no procesamiento (fosforilación en Ser-5) formas de RNAP II en células de CaP, tanto en presencia como en ausencia de andrógenos (Figura 2A R1881, 10 tratamiento nM ). Que indica un posible papel para la actividad de p68 (además de la función de AR co-activador), durante las etapas de elongación de la transcripción AR regulado. Hemos demostrado anteriormente por la cromatina Immunoprecipitation (CHIP) y análisis de QPCR durante un tratamiento con andrógenos 100 minutos (R1881, 10 nM) curso de tiempo, un co-reclutamiento de p68 con la AR en los andrógenos sensibles promotor y potenciador regiones del AR regulados
PSA
de genes [21]. Ampliando estos resultados, hemos optimizado cebadores de QPCR a otras áreas de la
PSA
gen (en el medio de la región potenciador y promotor (PE), el exón 1, intrón 2, exón 3, el intrón 3, 5 y exón regiones 3'dsF), para establecer si p68 fue reclutado para sitios distintos de iniciación de la transcripción. (NB La ubicación y la secuencia de información de cebadores para estas regiones se puede encontrar en la Tabla S1 en la información de apoyo. No fue posible optimizar cebadores de QPCR para intrón 1, el exón 2, el intrón 4 o exón 4 regiones de la
PSA
gen). La figura 2B muestra significativa (
p Hotel & lt; 0,05 *) el enriquecimiento diferencial de la AR en el tratamiento R1881 (10 nM) en el conjunto de puntos de tiempo (0, 15, 30, 45, 90 y 120 minutos) a la ARE III región de la
PSA
gen, como se ha demostrado anteriormente [31]. El enriquecimiento de AR en otras regiones no se observó. Del mismo modo, la figura 2C muestra significativa (
p Hotel & lt; 0,005 **) el reclutamiento cíclico disociación asociación de p68 tras el tratamiento R1881 (10 nM) para la región están III, aunque el reclutamiento no se limita a esta región como EP , el exón 3, el intrón 3, el exón 5 y 3'dsF regiones también mostró enriquecimiento significativo. El reclutamiento no alcanzó significación en el ARE I, el exón 1 y el intrón 2 regiones. Estos resultados implican p68 se asocia con ambas formas de iniciación y elongación de la transcripción de RNAP II y enriquecido no sólo en los sitios de inicio de la transcripción de un gen regulado AR pero en exonic, regiones intrónicas y 3'dsF, indicando una posible función para p68 en la facilitación de la procesamiento de la transcripción del gen AR por RNAP II.
A. imágenes inmuno-blot recortadas de lisados nucleares LNCaP inmunoprecipitadas con RNAP II H5 (Ser-2), RNAP II H14 (Ser-5), RNAP II CTD monoclonal de ratón y el anticuerpo p68 (+/- 10 nM R1881, 8 horas), sondearon secuencialmente con p68 y el anticuerpo RNAP II. Extraer muestras contienen lisado celular nuclear y la proteína G sefarosa sin anticuerpo presente. Las muestras de control contienen el anticuerpo y la proteína G sefarosa sólo en tampón de extracción nuclear. B. El reclutamiento de p68 AR y C a las regiones del
PSA
gen. células LNCaP se trataron con 10 nM de R1881 y se recogieron a los 0, 15, 30, 45, 90 & amp; 120 puntos de tiempo minuto. Las muestras se inmunoprecipitaron con AR, p68 o el control de anticuerpos IgG y el material procesado por el chip de ensayo se recuperaron. QPCR datos son representativos de n = 3 ensayos de chip independientes normalizaron a los niveles de entrada (+/- SE). (Cebadores N. B. QPCR no podían ser optimizados para todas las regiones exonic y intronic del
PSA
gen). La muestra se combina independiente
se utilizó t
prueba para comparar el enriquecimiento en el reclutamiento entre los diferentes
PSA
regiones y mostrar significación. D. Diagrama de
PSA
gen que representa límites exón /intrón.
función de p68 se requiere para la contratación de AR y β-catenina a las regiones promotoras de los genes sensibles a los andrógenos
Hemos demostrado previamente una disminución en los niveles de proteína y ARNm de la AR y el andrógeno sensibles
PSA
gen p68 tras caída de siRNA [21]. Consistente con los hallazgos de chip descritos anteriormente, β-catenina es reclutado para las regiones promotoras y potenciadoras de genes diana de señalización de andrógenos sensible y Wnt, tanto en la presencia y ausencia de andrógenos [11], [12]. A la luz de estos hallazgos, se realizó un chip experimentos en células LNCaP agotadas de p68 de siRNA para establecer si se requiere la función de p68 para la AR y el reclutamiento de β-catenina en las regiones promotoras de los genes sensibles a los andrógenos. p68 dirigido siRNA expresión desmontables (atenuación de mRNA p68 ~ 50%
p
& lt; 0,0494 * y protein~90% a las 72 horas después de la transfección), no alteró significativamente beta catenina expresión de ARNm o proteína en comparación con los niveles control (no silenciamiento, NS) siRNA en células LNCaPs, en presencia o ausencia de R1881 (Figura 3A, B y C respectivamente). estimulación androgénica facilitó una selección modesta (0,8 veces) de AR de la región son I de la
PSA
promotor en el control (NS) siRNA transfectadas las células LNCaP como se esperaba (Figura 4A), que fue significativamente atenuada para controlar los niveles p68 en las células agotadas (
p Hotel & lt; 0,0077 **). Del mismo modo, la estimulación androgénica aumentó el reclutamiento AR a la región potenciadora ARE III de la
PSA
gen 9 veces en el control de las células transfectadas (NS) siRNA (Figura 4B), mientras que en las células con p68 empobrecido, la contratación en la misma región fue reducido en 4 veces (
p Hotel & lt; 0,0008 ***). Un patrón similar de atenuación en el reclutamiento AR también se observó a
KLK2 gratis (0,25 veces,
p = 0,1593
Figura 4C) y
TMPRSS2 gratis (1 pliegue,
p Hotel & lt; 0,0016 ** Figura 4D) en las regiones promotoras de p68 dirigido siRNA células agotados por tratamiento R1881, aunque esto no alcanzó significación y la estimulación androgénica no mostró enriquecimiento de contratación AR en el
KLK2
promotor . Sin embargo, hemos visto la contratación de la AR a la
KLK2
promotor en otros puntos de tiempo (datos no mostrados). Curiosamente, un patrón similar en la atenuación del reclutamiento de β-catenina en p68 dirigido siRNA desmontables también se observó. Aumento de la contratación β-catenina que ambos son I (0,6 veces) y SE se observó III (0,8 veces) regiones tras la estimulación androgénica en el control (NS) células siRNA transfectadas en comparación con las células no tratadas (Figura 4E y 4F, respectivamente), como se esperaba . Sin embargo, en las células p68 agotado, el reclutamiento β-catenina fue atenuada significativamente por debajo de control de los niveles (NS) siRNA en ambas regiones (1,1 veces,
p
& lt; 0,0023 ** y 1,3 veces, p & lt; 0,0011 ** respectivamente). Un patrón similar de β-catenina de-reclutamiento se repitió en el
KLK2
y
TMPRSS2
promotor en células con p68 empobrecido (1,25 veces,
p Hotel & lt; 0,0003 ** * Figura 4G, y 1 veces,
p Hotel & lt; 0,0005 *** Figura 4H, respectivamente). Aunque es de señalar que en contraste con el reclutamiento AR, un aumento en el reclutamiento de β-catenina (1,75 veces) que se ve en el
KLK2
región promotora en este punto temporal de andrógenos. Nos han informado de una disminución de la AR mRNA y los niveles de proteína en el agotamiento de p68 en las células LNCaP previamente [21], que apoya la idea de que las funciones de p68 como un AR co-activador. Por lo tanto, se esperaría que una reducción en el reclutamiento de AR a las regiones promotoras de genes sensibles a los andrógenos en las células p68 empobrecido como la AR en sí es un gen de respuesta de andrógenos. Sin embargo, en las células agotadas de p68, encontramos el reclutamiento β-catenina reducida a niveles más bajos que las células no tratadas en todas las regiones promotoras evaluados (similares a los niveles de IgG). Lo que sugiere una interacción directa de p68 puede ser necesaria para facilitar la carga de β-catenina a regiones transcripcionalmente activas de los genes sensibles a los andrógenos. Estos datos destacan la importancia de la función de p68 en la contratación del coactivador β-catenina y la AR a las regiones promotoras de los genes sensibles a los andrógenos.
niveles de expresión de ARNm de p68 A. y β-catenina B. en el control (NS) y las células LNCaP siRNA transfectadas con p68 (+/- R1881 10 nM, 16 horas). qPCR datos se normalizó a GAPDH niveles y doble cambio relativo calculado para controlar (NS) (-R1881) los niveles de mRNA (establecer como 1). La muestra independiente
se utilizó t
prueba para comparar las diferencias en los niveles de expresión y mostrar significación. C. imágenes recortadas inmuno-blot de lisados de células LNCaP tratadas con 10 nM R1881 (16 horas) y transfectadas con control (NS) y siRNA p68. Blots sondaron secuencialmente con β-catenina, p68 y anticuerpos α-tubulina.
células LNCaP transfectadas con p68 o control (NS) siRNA, se trató con 10 nM R1881 durante 90 minutos y se inmunoprecipitaron con cualquiera de AR ABC &erio; D. o β-catenina E. F. G. & amp; anticuerpos H. (incluyendo un anticuerpo de control IgG). El material recuperado fue procesado por el chip de ensayo y la captación de
PSA ¿Cuáles son I (A & amp; E), ARE III (B & amp; M),
KLK2 gratis (C & amp; G) & amp;
TMPRSS2 gratis (D & amp; H) regiones promotoras evaluados en relación con el punto el tiempo 0 minuto. el agotamiento de p68 en las células LNCaP demostraron una reducción de AR & amp; β-catenina reclutamiento después del tratamiento con 10 nM R1881 durante 90 minutos a todas las regiones evaluadas en comparación con las células control (NS) siRNA. Los resultados mostrados representan n = 3 experimentos independientes (+/- SD). La muestra independiente
t
test fue utilizado para comparar las diferencias en los niveles de expresión y mostrar significación.
p68 y β-catenina aditiva potenciar la actividad transcripcional del receptor de andrógenos genes regulados
Dado que p68 y β-catenina en las células interactúan con CaP y p68 facilita el reclutamiento de β-catenina a los andrógenos promotores de genes de respuesta. A continuación elegimos para investigar el efecto combinado de la co-expresión de p68 y β-catenina en la actividad transcripcional del AR usando ensayos de reportero de luciferasa dependientes de andrógenos en células COS-7. El p mediada por AR (ARE)
3 Luc reportero robusta fue estimulada 2 veces por la AR en R1881 (10 nM) de tratamiento de andrógenos (Figura 5, comparar barra gris claro + R1881 y barra gris oscuro -R1881). La sobreexpresión de la β-catenina mostró insignificante p (ARE)
3 reportero actividad Luc en presencia o ausencia de R1881 que demuestra que β-catenina no afecta directamente a p (ARE)
3 reportero actividad Luc en ausencia de AR. Sin embargo, la co-expresión de AR y β-catenina mostró un incremento de 8 veces en p (ARE)
3 actividad Luc reportero tras el tratamiento R1881, confirmando β-catenina como un co-activador de la AR en consonancia con los resultados anteriores [28 ]. Del mismo modo, la co-expresión de AR y p68 mostró un aumento de 5 veces en p (n) la actividad del indicador
3 Luc después del tratamiento R1881, confirmando también p68 como un co-activador de la AR coherente con los resultados anteriores. (N.B. p68 se ha demostrado que no afecta a p (ARE)
3 actividad de reportero Luc directamente en ausencia de AR [21]). Sin embargo, la co-expresión de AR, β-catenina y construcciones p68 demostró una significativa 18 veces (
p & lt; 0,0011
**
)
aumento en p (ARE)
3 Luc reportero la actividad en el tratamiento R1881, 10 veces mayor que AR y β-catenina co-expresión, lo que demuestra p68 tiene un efecto aditivo significativo en la actividad transcripcional de AR y β-catenina. Esto también se observó con otro andrógeno regulado
PSA
reportero de luciferasa promotor (p (PSA) Luc), con lo que la co-expresión de AR, β-catenina y construcciones p68 mostraron un significativo 8 veces (
p
& lt; 0,0057 **) aumento de la actividad de reportero, 5 veces mayor que AR y β-catenina co-expresión, lo que confirma el efecto aditivo de p68 en β-catenina y Ar actividad transcripcional (ver información de apoyo, la figura S2). p68 se ha descrito la formación de heterodímeros con el p72 helicasa altamente homóloga (ddx17), y co-activate β-catenina mediada por la expresión de genes anteriormente [23]. Hemos encontrado que la co-transfección de AR, β-catenina y construcciones p72 no tuvo un efecto aditivo significativo en p (ARE) la actividad del indicador
3 Luc comparación con el co-transfección de AR, β-catenina y construcciones p68 (véase información de apoyo, Figura S3
p = 0,3646
). Esto es similar a un informe anterior que encontró p72 no fue capaz de aumentar la actividad transcripcional del AR p (ARE) reportero
3 Luc [21], y sugiere una especificidad para p68 en la activación transcripcional del AR en el CaP. En conjunto, estos datos sugieren β-catenina y p68 pueden trabajar juntos como co-activadores para mejorar la transcripción regulada AR.
COS-7 transfectadas transitoriamente células por triplicado con p (ARE)
reportero 3Luc y pCMV β-galactosidasa plásmidos, junto con vectores de mamífero de expresión para AR, β-catenina y p68 (+/- 10 nM R1881). La actividad de luciferasa se corrigió para la actividad β-galactosidasa correspondiente para dar actividad relativa. El rango de niveles de plásmido (+ y ++) corresponde a 50 y 100 ng, respectivamente. Los datos presentados en relación con la actividad de AR solo (-R1881) (establecer como 1), y el representante de al menos n = 3 experimentos de ensayo de luciferasa (+/- SE). La muestra independiente
se utilizó t
prueba para comparar las diferencias en los niveles de expresión y mostrar significación.
Discusión
En este estudio, se describe una interacción funcional entre p68 , β-catenina y la AR en el núcleo de células de CaP. La AR se ha demostrado que la señal a través de la vía Wnt /β-catenina en PCa como una adaptación a niveles de castración de los andrógenos [12], y β-catenina se sabe que interactúan con otros co-activadores de la AR [32]. Aquí presentamos inmunoprecipitación, chip p68-agotado y
PSA
datos reportero de luciferasa para confirmar una interacción entre p68, β-catenina y la AR en células de CaP. Inicialmente se confirmó la directa
in vitro la interacción
p68-β-catenina por transfección transitoria de las construcciones en la línea celular negativos AR COS-7 (que no era dependiente de los andrógenos). Sin embargo, tras una investigación complementaria que encontramos en condiciones endógenas de la interacción p68-β-catenina se vio facilitada en presencia de andrógenos en la línea celular LNCaP CaP, pero a la inversa en el refractario hormonal (LNCaP-AI) derivados de esta línea celular (representativas de la enfermedad de tipo CRPCa), la interacción fue facilitada en ausencia de andrógenos. Esto es similar a una constatación de aumento /formación del complejo β-catenina AR endógeno en una castración resistente CaP xenoinjertos de ratones modelo, en el que no se detectó interacción entre AR y β-catenina en presencia de andrógenos [10]. Esto puede sugerir un mecanismo adaptado por el que p68 y β-catenina co-activadores mantienen cooperativamente actividad transcripcional del AR (y genes de andrógenos regulado), facilitando la supervivencia celular de la (CRPCa) enfermedad de tipo resistente a la castración. Sin embargo, es necesario seguir trabajando para corroborar el mecanismo molecular completa de esta reclamación. datos Immuno-blot confirmó la localización celular de p68 y β-catenina no fue influenciada por la hormona (encontramos p68 y β-catenina en el núcleo de células de CaP, tanto en la presencia y ausencia de andrógenos), y
PSA
datos reportero de luciferasa mostraron co-transfección de p68 y construcciones de β-catenina tenía un efecto aditivo sobre la actividad transcripcional de AR en presencia de andrógenos. Estos datos sugieren que p68 y β-catenina trabajan juntos como co-activadores para mejorar de forma aditiva la actividad transcripcional del AR que curiosamente, puede tener implicaciones en la progresión de la enfermedad de tipo CRPCa.
También mostramos el uso de derribo de la expresión de p68 de siRNA oligonucleótidos combinado con chip, se requiere que p68 para el reclutamiento óptimo de la AR y β-catenina a promotor regiones de los genes regulados de andrógenos. estimulación androgénica contratación facilitado de la AR que ambos son I y III SON regiones del
PSA
promotor,
KLK2
y
TMPRSS2
regiones promotoras de control (NS) y siRNA células LNCaP transfectadas, que se atenuó posteriormente en las células agotadas p68. El reclutamiento observado β-catenina a los mismos de andrógenos regulado regiones promotoras se redujo en p68 empobrecido células LNCaP por tratamiento de andrógenos, pero a niveles más bajos que las células no tratadas (similar al control de IgG). Este es un hallazgo interesante, ya que sugiere que una reducción en el reclutamiento de β-catenina en las regiones promotoras de los genes andrógenos regulado en p68 agotadas las células no es sólo una consecuencia de la menor AR disponible para contratación, e implica que se requiere la función de p68 de carga β-catenina a regiones transcripcionalmente regulados de andrógenos genes de respuesta.
El papel de p68 en el empalme alternativo del ARNm está bien documentada (revisado en [19], [21], [33]). Hemos especulado anteriormente que p68 puede funcionar como un "adaptador" o proteína "de acoplamiento 'que coordina los procesos fuertemente integrados de la transcripción y el procesamiento del ARN, lo que facilita la diafonía entre la transcripción y el procesamiento del ARN en los genes regulados por la AR, posiblemente mediante el control de la tasa de iniciación de la transcripción /alargamiento de RNAP II [30]. RNAP II tiene dos sitios de fosforilación fisiológicamente importantes en el C-terminal que son importantes para la transición de la polimerasa a partir de una forma de iniciación transcripcional (fosforilación en Ser-5), hasta el establecimiento de la elongación forma compleja transcripcional (fosforilación en Ser-2) . En este estudio, se demuestra el uso de extractos nucleares endógenos de las células LNCaP con CaP, que p68 interactúa tanto con el processive (fosforilación en Ser-2) y de no procesamiento (fosforilación en Ser-5) forma de RNAP II, en presencia y ausencia