Extracto
Cortactin (CTTN), identificado por primera vez como un importante sustrato de la tirosina quinasa Src, participa activamente en la ramificación conjunto de F-actina y en la motilidad celular y la invasión.
CTTN
gen se amplifica y su proteína se sobreexpresa en varios tipos de cáncer. Se requiere que la forma fosforilada de cortactin (pTyr
421) para la motilidad celular y la invasión del cáncer. En este estudio, hemos demostrado que la mayoría de las muestras de tumores colorrectales primarios probados muestran la expresión de pTyr mucho mayor
421-CTTN, pero ningún cambio en el nivel de ARNm en comparación con sujetos sanos, lo que sugiere la activación postraduccional en lugar de la amplificación de genes en estos tumores. La curcumina (diferulolylmethane), un compuesto natural con quimiopreventivo prometedor y efectos quimiosensibilizantes, reduce la asociación indirecta de Cortactin con la fracción de proteína de membrana de plasma en células de adenocarcinoma de colon medida por biotinilación superficie, espectrometría de masas, y transferencia Western. La curcumina disminuyó significativamente la pTyr
421-CTTN en células HCT116 y células SW480, pero fue ineficaz en células HT-29. La curcumina interactúa físicamente con fosfatasas de tirosina PTPN1 para aumentar su actividad y conducir a la desfosforilación de pTyr
421-CTTN. la inhibición PTPN1 elimina los efectos de la curcumina en pTyr
421-CTTN. Transducción con CTTN codificada adenovirally-aumento de la migración de HCT116, SW480 y HT-29. La curcumina disminuye la migración de las células HCT116 y SW480 PTPN1 que es altamente expreso, pero no de células HT-29 con redujo significativamente la expresión endógena de PTPN1. La curcumina redujo significativamente la interacción física de CTTN y pTyr
421-p120 catenina con CTTN (CTNND1). En conjunto, estos datos sugieren que la curcumina es un activador de PTPN1 y pueden reducir la motilidad celular en el cáncer de colon a través de la desfosforilación de la pTyr
421-CTTN que podría ser explotado para nuevos enfoques terapéuticos en la terapia del cáncer de colon basado en tumor pTyr
421 expresión -CTTN
Visto:. Radhakrishnan VM, Kojs P, Young G, R Ramalingam, Jagadish B, puré de EA, et al. (2014) pTyr
421 Cortactin se sobreexpresa en el cáncer de colon y se desfosforila por cúrcuma: La participación de no receptor tipo 1 de proteína tirosina fosfatasa (PTPN1). PLoS ONE 9 (1): e85796. doi: 10.1371 /journal.pone.0085796
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Agosto, 2013; Aceptó 2 de diciembre de 2013; Publicado: 22 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Radhakrishnan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Institutos Nacionales de Salud [5 R01 DK067286 a la PRK y FKG]. subvención del NIH, CA 23074 P30 [EAM] NIEHS conceder ES006694 al Centro de Ciencias de la Salud Ambiental de Southwest (SWEHSC), NIH /NCI subvención CA023074 al Centro de Cáncer de Arizona y por el Instituto BIO5 de la Universidad de Arizona. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cortactin, codificada por el
CTTN EMS1
gen /, es un sustrato v-Src localizada con la actina cortical en la membrana plasmática y se sobreexpresa en muchos tipos de cáncer [1]. sobreexpresión cortactin resultados de la amplificación de la región cromosómica 11q13.3 en diversos tipos de cáncer, como el carcinoma escamoso de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, cáncer de mama y vejiga, y se correlaciona con mal pronóstico del paciente y disminución de la supervivencia [2] - [5]. Cortactin, generalmente presentes en varios tipos de células diferentes, se enriquece en estructuras corticales tales como volantes de membrana y lamelipodios, y juega un papel clave en las interacciones de microfilamentos de la membrana, así como en las señales de transducción de la superficie celular al citoesqueleto [6], [7 ]. Cortactin participa activamente en la polimerización de actina mediada por 3 Arp2 /asociada con la membrana plasmática [7] y actúa como un modulador de F-actina en tirosina quinasa regulada por la reorganización del citoesqueleto [8] que sugiere un mecanismo para su papel en la motilidad. Su papel en la migración celular y la invasión se ha estudiado bien en las células epiteliales, fibroblastos, células endoteliales y células de cáncer de mama [8] - [10]. La fosforilación de cortactin murino en Tyr
421, Tyr
466 (Tyr
470 en los seres humanos) y Tyr
482 (Tyr
486 en los seres humanos) se requiere para la motilidad celular eficiente en varios tipos de células , lo que indica que la fosforilación de la tirosina cortactin juega un papel importante en la migración celular [8], [11], [12]. En general, la fosforilación de la tirosina de cortactin desencadena reclutamiento de proteínas SH2 de dominio, incluyendo varias quinasas y la proteína adaptadora NCK NCK1, que une Cortactin con síndrome de Wiskott-Aldrich proteína del síndrome similar (WASL, N-WASP) y fue /WASL interactuando miembro de la familia de proteínas 1 (WIF1, WIP). Esto a su vez conduce a una mayor activación del 3 Arp2 /(proteína relacionada con actina-2 homólogo /3 homólogo) y conduce a la ramificación de filamentos de actina [13] - [16].
Numerosos estudios epidemiológicos han demostrado que compuestos fenólicos de origen vegetal en la dieta agentes juegan un papel importante en la quimioprevención del cáncer colorrectal [17], el segundo cáncer más común en los hombres y el tercero más común en las mujeres. El consumo regular de frutas y verduras que contienen estos compuestos se ha asociado con una disminución en la incidencia de cáncer de colon [18]. Entre los compuestos fenólicos naturales bi-, la curcumina, un curcuminoid a partir del rizoma
Curcuma longa
, es bien conocido por sus propiedades anti-cáncer y anti-inflamatoria, la actividad antioxidante in vivo e in vitro [19] - [ ,,,0],21], y es bien tolerado en grandes dosis. En un estudio de fase II con pacientes con cáncer de páncreas avanzado, una dosis de 8 g se administró durante 2 meses con toxicidad observada [22]. Otra fase I de ensayos clínicos evaluaron la tolerabilidad de la curcumina en 25 sujetos con lesiones precancerosas de alto riesgo. Se observaron mejoras histológicas en 7 de los 25 sujetos, sin toxicidad relacionada con el tratamiento hasta 8 g /día [23]. Los efectos contra el cáncer de la curcumina y sus derivados normalmente se han atribuido a la inhibición de la proliferación celular, la detención del ciclo celular, y /o la inducción de la apoptosis [21], [24], [25]. Un estudio clínico demostró que la administración de dosis de hasta 2,2 g de
Curcuma
extracto (que contiene 180 mg de curcumina) por día durante hasta 4 meses mostró beneficios clínicos en pacientes con cáncer colorrectal avanzado resistente [26].
en el presente estudio, hemos demostrado que pTyr
421 cortactin se sobreexpresa en el cáncer colorrectal sin cambios concomitantes en los niveles de ARNm. La curcumina disminuye los niveles de pTyr
421 cortactin en células de cáncer de colon
in vitro fotos: por interactuar físicamente con el no-receptor tipo 1 de proteína tirosina fosfatasa (PTPN1; PTP1b) para aumentar su actividad, y Cortactin dephosphorylate, reduciendo así la migración de células de cáncer. Nuestros datos sugieren la utilidad potencial de pTyr
421 cortactin inmunoticción como un biomarcador de cáncer de colon invasivo y proporcionar más información sobre el mecanismo de los efectos quimiopreventivos de la curcumina y su posible papel en la prevención del cáncer de colon metastásico.
Materiales y métodos
Reactivos
la curcumina con 98,05% de pureza y libre de contaminación de curcuminoides (curcumina desmetoxi- y bis-demetoxi curcumina), fue medida purificado por ChromaDex (Irvine, CA). inhibidor PTPN1 XXII (3-(3,5-dibromo-4-hydroxy-benzoyl)-2-ethyl-benzofuran-6-sulfonicacid-(4-(thiazol-2-ylsulfamyl)-phenyl)-amide), una célula-permeable, selectivo, reversible, y un inhibidor alostérico no competitivo de PTPN1 [27] se obtuvo de EMD Millipore (Billerica, MA). cortactin adenoviral recombinante se obtuvo de Vector Biolabs (Philadelphia, PA).
Los anticuerpos, las líneas celulares y tejidos humanos
T-84 células (carcinoma colorrectal humano) descrito originalmente por Murakami y Masui [28 ] fueron proporcionados por el Dr. Declan McCole, Universidad de California en San Diego, CA. HCT116, las células HT29 y SW480 se obtuvieron de ATCC y se cultivaron en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gemini Bio Products, West Sacramento, CA), 10% de suero bovino fetal (Cellgro, Manassas, VA), y 1% de penicilina-estreptomicina (Life Technologies, Grand Island, NY). Las células se cultivaron en una placa de 10 cm o en placas de seis pocillos (Greiner Bio-One, Monroe, NC). Ratón monoclonal anti-GAPDH, policlonal de conejo fosfo-específico (pTyr
421) de anticuerpos Cortactin, y el anticuerpo anti-PTPN1 se adquirieron de Merck Millipore. monoclonal de ratón anti-cortactin y anticuerpos policlonales de conejo anti-cortactin se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA). anticuerpo anti-catenina p120 monoclonal de ratón se adquirió de BD Biosciences, (San Jose, CA). las muestras de tumor de colon humano congelados y tejidos no malignos se obtuvieron de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos, Vanderbilt University Medical Center (Nashville, TN). Se seleccionaron 44 muestras basado en el tipo de tumor y el porcentaje de contenido de células tumorales (& gt; 80%) junto con 37 tejidos normales. Estos estudios fueron evaluados por la Universidad de Arizona Sujetos Humanos Programa de Protección y juzgados estuvieran exentos, se identificaron de-los especímenes.
QRT-PCR
ARN total fue extraído de los tejidos utilizando Trizol de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Sciences). 500 ng de ARN total fue inverso-transcrito utilizando un kit de síntesis de cDNA (Bio-Rad; Hercules, CA). El qPCR se realizó con Taqman qPCR mezcla (Quanta BioSciences; Gaithersburg, MD) y los cebadores TaqMan prediseñados y sondas (todos de Applied Biosystems /Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante con iCycler CFX96 (Bio-Rad). La medición qPCR se evaluó en base a la cuantificación relativa del gen CTTN normalizado a la expresión de GAPDH. Los datos se expresaron como valores de Ct y se utilizó la prueba t de Student para analizar los datos.
La inmunohistoquímica
array de tejidos de cáncer colorrectal embebidos en parafina núcleos de muestra se obtuvo de los Estados Unidos BioMax Inc. (Rockville, MARYLAND). Phosphospecific anti-pTyr
421 Cortactin y anticuerpos totales cortactin se utilizaron para la inmunotinción. Los portaobjetos se desparafinaron, se enjuagó con tampón fosfato salino (PBS; pH 7,4) y se bloquearon con suero de cabra (Santa Cruz). Después se incubaron con los anticuerpos primarios durante 4 horas a 4 ° C. Los portaobjetos se lavaron y después se incubaron con el anticuerpo conjugado con HRP de cabra anti-conejo (Santa Cruz) a temperatura ambiente durante 1 h. Los portaobjetos se revelaron con un kit de sustrato DAB (Vector Labs) y de contraste con hematoxilina.
se llevó a cabo en la superficie celular biotinilación
celular apical biotinilación superficie como se describe anteriormente [29]. En resumen, 2 × 10
5 T84 células de cáncer de colon se sembraron en los filtros Transwell (Corning Incorporated) y se cultivaron durante de 5 -7 días hasta que la resistencia monocapa obtuvo al menos 600 Ω
.cm
2. Las células se trataron luego con la curcumina (50 M) o sulfóxido de dimetilo (DMSO, vehículo) en el lado apical durante 1 hora. proteínas de la superficie se biotinilaron mediante la aplicación de 0,5 ml de NHS-S-S-biotina (Pierce; Rockford, IL) en PBS durante 30 min a 4 ° C en el lado apical. Después de inactivar, los filtros se cortaron y se lisaron las células con inhibidores de proteasa y de fosfatasa que contienen 0,5 ml de tampón de lisis RIPA (cóctel inhibidor de proteasa Halt /fosfatasa; Pierce). muestras lisadas se sometieron a ultrasonidos brevemente, se centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 min a 4 ° C, y se recogió el sobrenadante y se usaron para ensayo de proteínas y desplegable experimentos. proteínas biotiniladas fueron derribadas con perlas de estreptavidina-agarosa (Pierce). Las proteínas unidas se eluyeron mediante la incubación de las perlas en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA; mM Tris HCl 50 pH 7,42, NaCl 150 mM, 1% NP-40, 0,25%, de la proteasa y el inhibidor de fosfatasa cócteles-desoxicolato de Na, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo) en 98 ° C durante 5 min. Las muestras se centrifugaron a 10.000 rpm durante 5 minutos, y el sobrenadante se separó y se mezclan con 0,125 ml de ácido tricloroacético (TCA), se incubaron durante 10 min en hielo, y se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 min. Los sobrenadantes se descartaron y los sedimentos se lavaron tres veces con acetona enfriada con hielo. Los gránulos se secaron al aire y la proteína cuantificados antes de que se procesó para el análisis de MS. Para la inmunotransferencia, las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE, seguido por inmunotransferencia con anticuerpo anti-cortactin. Incluso de carga de proteínas de superficie biotiniladas se confirmó con un anticuerpo anti-receptor de transferrina de cabra policlonal (Santa Cruz).
Identificación de proteínas por el tiempo de cuadrupolo en tándem de vuelo espectrometría de masas (QTOF MS /MS)
Four cien gramos nano de la membrana de proteínas asociadas a células, obtenidas como se ha descrito anteriormente, se procesaron para la digestión con tripsina y se analizaron mediante espectrometría de cromatografía-masa líquida por la instalación compartida de Arizona Proteómica Consorcio. análisis QTOF MS /MS de las proteínas tripsina digerido se llevaron a cabo utilizando un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo (QTOF; Waters Q-TOF Premier, 2008). Los péptidos se eluyeron utilizando Vydac C18 (Hesperia, CA), usando un gradiente de 0-65% de disolvente (98% de metanol /2% de agua /0,5% de ácido trifluoroacético ácido fórmico /0,01%) durante un período de 60 min a una velocidad de flujo de 350 nl /min. La solución de péptido se pulverizó a un potencial de 1,6 kV, y la temperatura capilar a 200 ° C. escaneado depende de los datos se realizó por la Xcalibur v 2.0 software SR2 [30] con una carga predeterminada de 2, una anchura de aislamiento de 1,5 amu, una amplitud de activación de 35%, el tiempo de activación de 30 ms, y una señal mínima de 10.000 ion recuentos . La configuración global de datos dependientes fueron los siguientes: rechazan ancho de masa de 1,5 amu, la exclusión dinámica activada, número de repeticiones de 1, repetir duración de 1 min, y la duración de la exclusión 5 min. serie de eventos de exploración incluyó una exploración completa con rango de masas 350 - 2.000 Da, seguido de 3 exploraciones dependientes MS /MS del ión más intenso. dinámica de exclusión se enciende por un período de 60 segundos. Tandem espectros de MS de péptidos se analizaron con Turbo SEQUEST ™ v 3,1, un programa que permite la correlación de datos de MS en tándem experimental con los espectros teóricos generados a partir de secuencias de proteínas conocidas. Los criterios de búsqueda que se utilizaron para una identificación positiva péptido preliminar son los mismos que los descritos anteriormente, es decir, iones precursores de péptidos con una carga 1 que tiene un Xcorr & gt; 1,8, 2 Xcorr & gt; 2,5 y 3 Xcorr & gt; 3.5. Una puntuación DCN & gt; 0,08 y una relación de iones fragmento de experimentación /teórico & gt; 50% también se utilizaron como criterios de filtrado para la identificación de péptidos emparejado fiable [31]. Todos los péptidos emparejados fueron confirmados mediante examen visual de los espectros. Todos los espectros se registraron en contra de la base de datos de proteínas ipiHuman 3,72 que tiene en el mismo la secuencia de la
Rhodobacter
y albúmina de suero bovino. Por lo general, se añade la albúmina de suero bovino como proteína de referencia pero desde bovino y albúmina de suero humano son similares, se utilizó la secuencia mutante T33V de
Rhodobacter
. Andamios (versión Scaffold_3.1.2, Proteoma Software Inc., Portland, OR) se utilizó para validar MS /MS identificaciones de péptidos y proteínas a base. péptido identificaciones fueron aceptados si podían establecerse en más del 90,0% de probabilidad según lo especificado por el péptido profeta algoritmo [30]. la identificación de proteínas fueron aceptados si podían establecerse en más del 90,0% de probabilidad y contenían al menos un péptido identificado. probabilidades de proteína se asignan por la proteína profeta algoritmo [32]. Las proteínas que contienen péptidos similares y no pueden ser diferenciados en base al análisis de MS /MS solo se agruparon para satisfacer los principios de la parsimonia.
Western Blot e inmunoprecipitación
Los lisados proteicos obtenidos a partir de tejidos tumorales de colon y líneas celulares de cáncer de colon se prepararon con tampón RIPA. Las muestras de proteína se cuantificaron precleared [kit de ensayo de proteína colorimétrico (Detergente-compatibles) DC; Bio-Rad], y las muestras se separaron mediante SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia. Las transferencias se visualizaron con SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Pierce). Para la inmunoprecipitación, las células se lisaron con tampón RIPA y la proteína se cuantificó con un kit de ensayo de proteínas DC (Bio-Rad). 5 g de anti-pTyr
421 anticuerpo cortactin se añadió a 1 mg de lisados de células HCT-116 a 4 ° C y se incubaron durante la noche. Las muestras se incubaron después con A /G cuentas de agarosa de proteína (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante 1 hora a 4 ° C. La inmunotransferencia se llevó a cabo a partir de los complejos lavados y desnaturalizadas.
inmunofluorescencia
Las células fueron cultivadas en EZ-cámaras (Millipore), y se trató con la curcumina a una concentración 50 mM durante 15 minutos y se fijaron con 2 % de paraformaldehído en tampón de fosfato 0,2 M, pH 7,4 (45 min), se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 en PBS (10 min), y se incubaron secuencialmente con anti-fosfo cortactin (Millipore) o anticuerpo anti-cortactin (Santa Cruz) . El Alexa Fluor 647 de IgG de cabra anti-conejo, (Life Technologies) fue utilizado como anticuerpo secundario. Los portaobjetos se montaron utilizando medio de montaje de fluorescencia (Dako; Carpinteria, CA) y se examinaron con un microscopio confocal Zeiss equipado con software ZEN (Carl Zeiss Microscopy, GmbH)
ensayo de actividad
PTPB1B /PTPN1
HCT células 116 se cultivaron hasta confluencia y se trataron con la curcumina o DMSO (vehículo) en los medios de 30 min. Las células se lavaron con PBS y se lisaron con tampón RIPA, se sonicaron durante 5 segundos, se centrifugaron, y se ensayaron para la concentración de proteínas. Un kit PTPB1B ensayo se obtuvo de Millipore y se utiliza de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Secuencia de PTPN1 región de codificación
ARN total fue extraído de HCT116, HT29 y las células SW480 usando TRIZOL (Life Technologies ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a transcripción inversa utilizando un kit de síntesis de ADNc (Quanta), y se amplificó usando el cebador, 5 'ATGGAGATGGAAAAGGAGTTCG-3' y cebador inverso, 5 'CTATGTGTTGCTGTTGAACAGGA-3' (basado en el gen de adhesión NM_002827.2 ) y
Pfu
Taq ADN polimerasa (Life Technologies). Los productos de PCR se purificaron en gel, se subclonaron en pGEM-T Easy (Promega, CA), y secuenciados de 5 'y 3' utilizando T7 y SP6 primers de secuenciación.
La migración de células de ensayo
La ensayo de migración transwell se realizó como se informó anteriormente [33] con modificaciones menores. En pocas palabras, la membrana Transwell (de 24 pocillos de inserción, tamaño de poro 8 micras, policarbonato; Corning Inc, NY) se utilizó para determinar el efecto de la curcumina sobre la migración celular de cáncer de colon
in vitro
. se tripsinizaron las células, se lavaron, y se mantuvieron en suspensión en medio sin FBS. Se añadió a los pocillos inferiores de las cámaras, medio de migración inductores (con 10% de SFB). pocillos superiores se llenaron con medio libre de suero con las células (20.000 células por pocillo), en algunos casos, que también contiene 25 mM de curcumina. A continuación, la cámara se colocó en un CO humidificado
2 incubadora. Después de 12 h, los ensayos se detuvieron mediante la eliminación del medio de los pocillos superiores y la eliminación cuidadosa de los filtros. Los filtros fueron fijadas con metanol mediante una breve inmersión y las células de lado superior se eliminaron por lavado con PBS. Los filtros se tiñeron con tinción con violeta cristal (0,2%, w /v con etanol 2%, v /v, en 0,5 M Tris-HCl, pH 7,8) durante 10 min a temperatura ambiente. La capa de células teñida se enjuagó a fondo con 0,5 M Tris-HCl (pH 7,8) tres veces, los filtros se secaron al aire, se incubaron con 500 solución de l SDS (0,5% en 50% de etanol, 50% 0,5 M Tris-HCl, pH 7,8 ) durante 60 min a 37 ° C, y se leyó a 586 nm usando un espectrofotómetro (Molecular Devices, CA). Para las células transducidas Ad-CTTN, 24 h después de la infección con Ad-CTTN (10 MOI), las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS, y se añade a la parte superior de la cámara Transwell, y los ensayos se realizaron como se ha descrito anteriormente.
la síntesis química de la curcumina biotinilado
Las reacciones se llevaron a cabo utilizando material de vidrio secado a la llama bajo una presión positiva de argón. disolventes higroscópicos se transfirieron
a través de
una jeringa o cánula secado al horno. Todos los reactivos y disolventes eran disponibles comercialmente y se utilizaron tal como se recibieron. Las soluciones se concentran
a vacío
usando un evaporador rotatorio. cromatografía en capa fina analítica (TLC) se realizó sobre gel de sílice pre-recubierta 60 placas de vidrio F-254. visualización TLC requiere el uso de una cámara de yodo, luz UV, y /o solución de PMA (5 g de ácido fosfomolíbdico, 100 ml de EtOH al 95%) para la tinción. Flash y cromatografía por gravedad se llevaron a cabo usando gel de sílice 60 (malla 230-400). Los puntos de fusión están sin corregir. Resonancia magnética nuclear (RMN) los experimentos se realizaron en un espectrómetro de 500 MHz. Los espectros de RMN fueron referenciados a CD
3OD (3,31 ppm, 49,0 ppm). La espectrometría de masas se llevó a cabo utilizando ESI en un instrumento Bruker MALDI TOF Daltonics.
N- (13-amino-4,7,10-trioxatridecanyl) biotinamida (2).
A una solución caliente de biotina (0,24 g, 1,0 mmol) y
N
-hydroxysuccinamide (0,12 g, 1,0 mmol) en DMF (8 ml) se añadió DCC (0,26 g, 1,3 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura. Los sólidos se separaron por filtración, se lavó con DMF (2 ml), y el filtrado (~ 10 ml) gota a gota a una solución agitada de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina (2,20 g, 10,0 mmol, 2,2 ml) en DMF (20 ml). Después de 3 h, el disolvente se eliminó a presión reducida. El aceite resultante se trituró con éter (50 ml) y la mezcla se agitó durante 30 min. El sólido se recogió por filtración y se sometió a cromatografía ultrarrápida en columna sobre gel de sílice (50 g). La elución con metanol /EtOAc (04:01) dio 2 (0,38 g, 0,85 mmol, 85% en dos etapas) como un sólido incoloro, pf 104-106 ° C, R
f
0.36 ( MeOH /EtOAc /aq. NH
4OH 08:02:01). La
1 H y
13C espectros de RMN estaban de acuerdo con los datos publicados [34].
5,21-Dioxo-25-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-10,13,16-trioxa-6,20-diazapentacosan-1-oic Ácido (3).
A una solución de 2 (0,38 g, 0,85 mmol) en metanol (4 ml) se añadió anhídrido glutárico (0,12 g, 1,02 mmol) y la mezcla se agitó durante la noche. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice (50 g). La elución con CH
2Cl
2 (200 ml) seguido de CH
2Cl
2 /MeOH (05:01) dio 3 (0,40 g, 0,71 mmol, 84%) como un sólido de color blanco, pf 124-126 ° C, R
f
0,42 (CH
2Cl
2 /MeOH 01:01).
1 H RMN (500 MHz, CD
3OD) δ 1,44 (2, m), 1,56-1,70 (4, m), 1,70-1,78 (6, m), 1,88 (2, quinteto,
J
= 7,5 Hz), 02/18 a 02/25 (4, m), 2,32 (2, m), 2,70 (2, m), 2,93 (2, dd,
J
= 8 Hz, 5 Hz), 3.19 a 3.21 (2, m), 3,25 (4, t,
J
= 7 Hz), 3,52 (4, m), 3,59 (5, m), 3,64 (5, m) , 4,30 (1, m), 4,49 (1, m);
13C RMN (125 MHz, CD
3OD) δ 22.3, 26.8, 29.5, 29.7, 30.4, 34.2, 36.1, 36.8, 37.8, 41.0, 56.9, 61.26, 63.3, 69.9 (2), 71.2, 71.5 , 166.1, 175.2, 175.9, 176.8; HRMS (MALDI TOF) calculado para C
25H
45N
4O
8S 561.2952, observaron 561.2930.
4-((1E,6E)-7-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-3,5-dioxohepata-1,6-dien-1-yl)-2-methoxyphenyl-5,21-dioxo-25-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-10,13,16-trioxa-6,20-diazapentacosan-1-oate (4).
A una solución de 3 (100 mg, 0,18 mmol) en DMF (2 ml) se añadió
N
-hydroxysuccinamide (21 mg, 0,18 mmol) seguido de DCC ( 48 mg, 0,23 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Los sólidos se retiraron por filtración, se lavó con DMF (2 ml), y el filtrado (~ 4 ml) gota a gota a una solución agitada de la curcumina (330 mg, 0,89 mmol) y trietilamina (45 mg, 0,44 mmol, 62 l) en DMF (10 ml). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente y los volátiles se eliminaron a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice (75 g). La elución con CH
2Cl
2 (200 ml) y CH
2Cl
2 /MeOH (50:1, 200 ml) dio la curcumina. La elución adicional con CH
2Cl
2 /MeOH (20:01), seguido de la eliminación de los disolventes, dio 4 como una goma de color amarillo oscuro que se disolvió en 20% acetonitrilo en agua y la solución liofilizada. derivado de la curcumina biotinilado 4 (78 mg, 0,085 mmol, 48% de rendimiento sobre las dos etapas) se obtuvo como un sólido de color amarillo oscuro mullido, R
f
0,68 (CH
2Cl
2 /MeOH 05:01). ESI-MS: 911,2 (M + H
+). El espectro de RMN
1 H estaba de acuerdo con los datos publicados [35].
El análisis estadístico
La prueba t de Student para datos independientes se utilizó para el análisis estadístico en todas partes.
Resultados
pTyr
421cortactin expresión se incrementa en tejidos de cáncer de colon primarios
La sobreexpresión de cortactin se ha encontrado en cánceres invasivos, incluyendo el glioblastoma, el melanoma, el cáncer de mama, y la cabeza y el cuello carcinomas escamosos, como resultado de la amplificación del gen EMS1 [36]. En este estudio, se investigó cortactin expresión en el cáncer de colon. Se analizó la expresión de ARNm primera cortactin en 81 muestras de tejido de colon congelados, que incluyeron 37 tejidos normales, 5 benigna, y 39 tumores malignos, por RT-PCR cuantitativa. Los tumores de colon y los tejidos normales adyacentes no mostraron diferencias en la expresión de ARNm cortactin (Fig 1A). Se observó ninguna diferencia significativa entre la expresión CTTN mRNA en tejidos normales y muestras de tumores de colon (Fig 1B). A continuación, examinó 19 parejas de muestras de tumores de colon para la expresión de proteínas Cortactin por Western blot. 14/19 (73%) mostraron niveles elevados de pTyr
421 Cortactin y Cortactin totales (Fig. 1C, panel izquierdo), 2/19 muestras mostraron disminución de la expresión de ambas formas (pTyr
421 y total) de cortactin y 3/19 no mostraron cambios (datos no mostrados). El análisis inmunohistoquímico de las matrices tisulares con 6 secciones normales y 18 secciones de tumor de colon mostró tinción de membrana intensa de pTyr
421 Cortactin y Cortactin totales en 13/18 muestras tumorales analizadas en comparación con las secciones de tejidos normales, como se ejemplifica en la figura. 1D. También se investigó la fosforilación en Tyr Cortactin
482 y Tyr
470 en muestras de tumores de colon. Se encontró que en el 50% de los tejidos malignos analizados, hubo un incremento en la expresión de pTyr
482 en comparación con los controles emparejados (datos no mostrados). Sin embargo, la fosforilación en este sitio no se vio afectada por la curcumina en las células HCT116 (no mostrados), y desde Oser et al [37]. demostró que pTyr
482 no contribuye a la regulación del número de púas libre termina en invadopodios, no continuamos con este sitio aún más. No fue posible analizar de forma fiable la expresión de pTyr
470 en muestras de tumor con cualquiera de los anticuerpos disponibles comercialmente.
(A) ARN total fue extraído a partir de muestras congeladas de lo normal y los tejidos tumorales y la expresión de ARNm se determinó Cortactin utilizando RT-PCR cuantitativa. Los diagramas de cajas representan cantidades relativas de cortactin normalizaron a GAPDH en tejidos normales y tumorales (n = 37 para las muestras normales, n = 44 para muestras de tumor). (B) Análisis de ADN en gel de los productos de PCR obtenidos a partir del análisis qPCR (representante de 37 tejidos normales, 5 tumores benignos y tumores malignos 39). (C) Los lisados tisulares de pares emparejados (N-normales, M-malignas) de los especímenes de colon preparados a partir de las mismas muestras de tumores como en (A) se analizaron la expresión de pTyr
421-cortactin (pTyr
421 -CTTN) y cortactin total mediante transferencia Western. Los resultados representativos se muestran a partir de tres pares emparejados. β-actina se utilizó como control de carga. (D) Representante pTyr
421-cortactin inmunomarcación Cortactin y total de muestras de tumor de colon. matriz de tejido que contiene una serie de carcinomas de colon se tiñeron para pTyr
421-CTTN y Cortactin total. La tinción citoplasmática era sobre todo para Cortactin total, mientras que pTyr
421-CTTN que muestra una mayor intensidad de la tinción en la membrana plasmática.
La discrepancia entre la expresión de ARNm inalterada y niveles elevados de Cortactin total y fosforilada excluye la posibilidad de amplificación de genes y sugiere una posible modificación postraduccional (s) y los cambios en la estabilidad de la proteína en los tumores colorrectales.
Los cambios en las proteínas de la superficie celular después del tratamiento con biotina curcumina en células T84
Las células de cáncer de colon T84 se han utilizado ampliamente para estudiar la biogénesis de la polaridad celular epitelial [38] y formar monocapas bien polarizadas y apretado cuando se cultivan en un soporte de filtro semi-permeable. Lo primero que investigó la distribución y los efectos de la curcumina en las principales proteínas asociadas a la membrana en monocapas de células T84. Para reproducir el exposición a administrar por vía oral-(o la dieta) curcumina, las células fueron tratadas con el compuesto o DMSO (vehículo) en el lado apical. Las proteínas de la membrana apical y de la membrana asociada a continuación, se biotinilaron, derribados con agarosa conjugada con estreptavidina, y se analizaron por LC-MS /MS. Los resultados de estos experimentos se resumen en la Fig. 2. 56 proteínas se identificaron mediante LC-MS /MS. 13/56 mostraron superficie disminución o la expresión asociada a la superficie que oscila desde 20 hasta 80% en las células tratadas con la curcumina en comparación con el control de DMSO (p & lt; 0.0001- p & lt; 0,05) (Fig 2A). Sólo una proteína [isoforma 1 de repeticiones ricas en leucina (en FliI) que interactúan las proteínas 2, LRRFIP2) mostró incremento en la expresión (datos no mostrados). Aunque la función de LRRFIP2 no está completamente claro, un informe ha demostrado que desempeña un papel importante como un activador de la vía canónica de señalización Wnt, en asociación con la proteína segmento de polaridad despeinado homólogo DVL-3, aguas arriba de β-catenina (CTNNB1) , lo que conduce a la estabilización de esta última [39]. Para el propósito de este estudio, nos centramos en los niveles disminuidos de cortactin en respuesta al tratamiento curcumina, porque se sobreexpresa frecuentemente en cánceres y se ha informado para mejorar la migración de células tumorales y la invasión [40]. Higo. 2B representa regulación a la baja de cortactin en la fracción proteica asociada a la membrana a partir de células tratadas con la curcumina, una observación confirmada por Western Blot en las células tratadas con 50 micras, con el lado apical durante 1-4 horas (Fig. 2C). receptor de transferrina (CD71), usado aquí como control, no mostró ningún cambio, similar a nuestro informe anterior [29].
(A) Tabla con las proteínas asociadas a la membrana de plasma de 13 identificados por QTOF-MS /MS como disminuido significativamente en monocapas de células T84 tratados con curcumina. Los datos muestran la media de número único péptidos identificados a partir de tres experimentos diferentes ± SD. (B) Análisis cuantitativo de la expresión de cortactin en las células T84 por M /S. Los valores de espectro se obtuvieron a partir de tres experimentos diferentes. Los datos de cuantificación de la proteína cortactin se deriva de M /S utilizando el software Andamios proteoma (versión Scaffold_3.1.2). Los datos son medias ± SE, *
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con las células no tratadas, prueba de la t de Student. (C) La confirmación de la expresión de la proteína CTTN por Western Blot con la fracción de superficie celular con biotina proteína preparada a partir de células T84 tratadas con DMSO (CTRL) o 50 mM curcumina durante 1-4 horas. CD71 (receptor de transferrina) se utilizó como control de carga. CTRL representa las células tratadas con DMSO durante 4 horas.
desfosforilación de pTyr
421-Cortactin por curcumina
Un mecanismo bien definido para determinar la migración aberrante de las células cancerosas es mediada por (SEGUNDO). (DO). GAPDH sirvió como control de carga. GAPDH sirvió como control de carga. GAPDH sirvió como control de carga. GAPDH sirvió como control de carga. GAPDH sirvió como control de carga. Como se muestra en la Fig.