Extracto
Antecedentes
Análisis de muestras de tumores de mutaciones se está convirtiendo cada vez más importante en el impulso de la terapia personalizada en el cáncer. A medida que se desarrollan las terapias más específicas, las opciones a la encuesta mutaciones en múltiples genes en una sola muestra de tumor será cada vez más atractivo y se espera que se convierta en el pilar del diagnóstico molecular en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) en el futuro.
Materiales y Métodos
238 cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) muestras de tumores se analizaron mediante un panel personalizado de 82 ensayos de mutación en 14 oncogenes, incluyendo
KRAS
y
EGFR
usando Sequenom IPLEX láser asistida por matriz de desorción /ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF). Se han comparado los datos generados por
KRAS mutaciones
a los detectados por el Sistema de amplificación refractaria mutación (ARMS) DxS TheraScreen K-RAS basado mutación kit.
Resultados
Los brazos detectados mutaciones en 46/238 muestras tumorales. Para muestras con mutaciones detectadas por ambos enfoques, se observó un 99,1% acuerdo global. El método MALDI-TOF detectado un 6 muestras adicionales como
KRAS mutación
datos positivos y también proporcionadas sobre las mutaciones concomitantes incluyendo
PIK3CA
y
TP53
.
conclusiones
El método Sequenom MALDI-TOF ofrece un enfoque basado en el panel sensible que hace un uso eficiente de muestras de diagnóstico de pacientes. Esta tecnología podría proporcionar una oportunidad para aportar un cribado exhaustivo de biomarcadores relevantes a la clínica antes en el manejo de enfermedades, sin necesidad de repetir la biopsia y permitir el análisis de aguas abajo adicional en el CPNM, donde puede haberse agotado tejido disponible.
Visto : Sherwood JL, Müller S, Orr MCM, Ratcliffe MJ, J Walker (2014) a base de paneles MALDI-TOF de perfiles de tumor es un método sensible para detectar mutaciones en clínica para no microcítico de pulmón tumor. PLoS ONE 9 (6): e100566. doi: 10.1371 /journal.pone.0100566
Editor: Anthony WI. He aquí, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 21 Marzo, 2014; Aceptado: 23-may de 2014; Publicado: 23 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Sherwood et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Los datos están disponibles en las figuras en el manuscrito y en la tabla complementaria
Financiación:. Este trabajo fue financiado por AstraZeneca. El donante prestado apoyo en los ofmsalaries de forma para autores JLS, MCMO, MJR, y JW y Sequenom GmbH para el autor SM, pero no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recogida de datos o el análisis, la decisión de publicar o preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses: JLS, MCMO, MJR, y JW son empleados de y sean accionistas de AstraZeneca, cuya compañía financiado este estudio. SM es un empleado de Sequenom GmbH. Patentes relacionadas con selumetinib son los siguientes: patenttitle patentid, US200903005, 8, tosilato sal de 6- (4-br0m0-2-chl0r0phenylamin0) -7-fluoro-N- (2-hidroxietoxi) dazole -3-metil-3H-benzimi - 5 - carboxamida, inhibidor de MEK útil en el tratamiento del cáncer, US200924627, 4 farmacéutica composición 271 US201013051, 9 terapia de combinación que comprende AZD2171 y AZD6244 o MEK-inhibidor. II, US200323286, 9 N3 derivados de bencimidazol alquilados como inhibidores de MEK, us7842816 derivados de bencimidazol alquilados N3 como inhibidores de MEK, derivados de bencimidazol US7777050 N3 alquilados como inhibidores de MEK, derivados de bencimidazol US7576114 N3 alquilados como inhibidores de MEK, US8193229, el método de tratamiento utilizando derivados de bencimidazol alquilados n3 como inhibidores de MEK, US8193230, las composiciones que comprenden derivados de bencimidazol alquilados N3 como inhibidores de MEK y métodos de uso de los mismos, us7235537, N3 derivados de bencimidazol alquilados como inhibidores de MEK, US7973170, derivados de bencimidazol alquilado N3 como inhibidores de MEK, US8003805, N3 derivados de bencimidazol alquilados como inhibidores de MEK , derivados de bencimidazol alquilado US7425637, N3 como inhibidores de MEK, derivados de bencimidazol alquilado US8178693, N3 como inhibidores de MEK. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
CPNM representa alrededor del 85% de todos los cánceres de pulmón [1]. Aproximadamente el 20% de los caucásicos con CPNM, el aumento de más del 26% de los pacientes con adenocarcinomas (ADC) tienen mutaciones activadoras en
KRAS
[2]. poblaciones asiáticas tienen un
KRAS
incidencia mutación del 11% en el ADC. Las mutaciones en
EGFR
están presentes en el 48% de los asiáticos NSCLC ADC frente al 19% en el ADC de raza caucásica.
EML4-ALK
mutaciones están presentes en el 6% de raza caucásica NSCLC ADC y 5% de ADC asiática [2]. El análisis molecular de las aberraciones en
EGFR
y
ALK
está bien establecido y se utiliza para identificar a los pacientes adecuados para terapias dirigidas, como los inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR (ITC) gefitinib, erlotinib y afatinib, y
ALK
inhibidores como crizotinib [3].
KRAS
es un importante indicador emergente en el CPNM. El valor clínico de establecer
KRAS
estado de mutación puede aumentar si el desarrollo de inhibidores de MEK en el CPNM con KRAS mutantes entregar resultados positivos beneficios para los pacientes de riesgo. MEK se sabe que es un efector aguas abajo de
KRAS
de señalización y se ha implicado en la proliferación celular y el crecimiento tumoral. Selumetinib (AZD6244, ARRY-142886) es un potente y selectivo no competitivos con ATP MEK1 inhibidor, /2 [4]. Un reciente ensayo clínico de fase II (NCT00890825) comparó la eficacia de selumetinib en combinación con docetaxel frente a docetaxel solo en pacientes pretratados con
KRAS
cáncer de pulmón mutación positiva localmente avanzado o metastásico de células no pequeñas. La mediana de supervivencia global fue de 9,4 meses (6.8-13.6) en el grupo selumetinib y 5,2 meses (95% CI 3,8-no calculable) en el grupo placebo (razón de riesgo (HR) para la muerte was0 · 80, 80% CI 0 · 56 -1 · 14; unilateral p = 0,21). La supervivencia libre de progresión fue de 5 · 3 meses (4 · · 4 6-6) en el grupo selumetinib y 2,1 meses (IC del 95%: 01/04 a 03/07) en el grupo placebo (CRI de evolución 0,58; IC 80% 0,42-0,79 ; unilateral p = 0,014) [5]. La eficacia de selumetinib de tipo salvaje
KRAS
NSCLC aún no ha sido establecida. Otros inhibidores de MEK en desarrollo incluyen cobimetinib (GDC-0973, XL-518) y trametinib. Este último fue aprobado recientemente para su uso por la FDA en
BRAF V600E
mutado melanoma. Demostración de un claro beneficio clínico en un
KRAS
población NSCLC mutación positiva que conduce a la aprobación de medicamentos conduciría la necesidad de identificar relevante
KRAS
mutaciones en pacientes con CPNM el momento del diagnóstico, además de
EGFR
y
ALK
aberraciones, para informar las decisiones de tratamiento.
En el ensayo NCT00890825 se utilizó la base BRAZOS DxS TheraScreen K-RAS mutación kit para identificar prospectivamente
KRAS
pacientes con mutación positiva del que pueden beneficiarse de la asignación al azar y el tratamiento. Se seleccionó metodología ARMS, ya que proporciona una sensibilidad superior y especificidad en parafina fijado con formalina (FFPE) de material incrustado en comparación con la secuenciación directa [6], [7]. En el establecimiento de este método basado qPCR ensayo clínico se podría realizar con un rápido tiempo de vuelta en un pequeño número de pacientes que se recibieron las muestras.
En otro reciente juicio de selumetinib en el melanoma cutáneo, NCT00936221 [8], las muestras fueron analizados mediante una combinación de armas y metodologías de secuenciación para la prueba de
BRAF
mutaciones en el codón V600.
La tecnología Sequenom IPLEX Pro MALDI-TOF permite que múltiples mutaciones en muestras FFPE para ser analizadas en un individuales investigación utilizando reacciones de PCR múltiple [9]. La tecnología utiliza (~ 80 pares de bases) de amplificación pequeño producto de PCR que es óptima para la amplificación de plantillas de ADN fragmentados, como los que se extraen a partir de muestras tumorales FFPE. Después de la amplificación, un solo par de bases etapa de extensión se realiza en el sitio de la base mutada de interés con una masa modificada mezcla terminación ddNTP. La ventaja de este enfoque es la capacidad de resolver las cuatro bases en los espectros. El fragmento resultante, con base modificada en el sitio de la mutación, entonces se analizó mediante el espectrómetro de masas de Sequenom MassARRAY que está diseñado y optimizado específicamente para la detección de ácidos nucleicos. Una clara ventaja de este sistema es la capacidad de identificar cualquier base mutante en la posición dada significa un ensayo cubre todos los tres posibles cambios de base sin la necesidad de un ensayo separado para cada mutación potencial. Por ejemplo, la mutación Gly12Cys en
KRAS
es causada por un G & gt; T transversion en la posición 34. Sequenom IPLEX Pro detectará cualquier mutación en esta posición de base que incluye las mutaciones Gly12Arg y Gly12Ser causados por el G & gt; C transición y el G & gt; A Transversión respectivamente. Esto reduce el requisito de ADN molde y por lo tanto reduce al mínimo la demanda de tejidos.
Aquí mostramos cómo el método MALDI-TOF se compara con las armas como un método para detectar
KRAS
y
BRAF
mutaciones en muestras clínicas y cómo el uso de un panel de múltiplex nos permitió evaluar la prevalencia de mutaciones menos comunes en nuestra cohorte NSCLC.
Materiales y Métodos
Análisis de la muestra del tumor
los 238 muestras de pacientes con CPNM provenían del estudio NCT00890825 [5].
177 muestras de melanoma del estudio NCT00936221 [8] también fueron recogidos y tratados como se describe en Robert et al [8].
todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki (1964, modificado en 1975, 1983, 1989, 1996 y 2000) de la Asociación médica Mundial y todas las muestras de los pacientes sometidos a análisis se realizaron con el consentimiento pleno e informado de la pacientes
Patología
Los pacientes en esta cohorte NSCLC proporciona una muestra de tumor que data desde histológicamente entre mayo de 2007 y mayo de 2010. Las muestras fueron confirmadas o citológicamente como el estadio IIIB-IV NSCLC tras H & amp; e tinción. por un anatomopatólogo cualificado en Labcorp Centro de Biología Molecular y Patología (CMBP), Research Triangle Park, Carolina del Norte, EE.UU..
extracción de ácido nucleico
extracción de ácidos
nucleicos se realizó a Labcorp CMBP, Research Triangle park, NC, EE.UU., a partir de 4 × 5 micras secciones FFPE, con la eliminación de la parafina por fusión.
extracción de ADN se realizó utilizando el Kit de Qiagen QIAamp DNA Mini, (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania), de acuerdo al inserto kit. La elución se realizó en 100 l de agua.
ADN se cuantificó usando el kit TaqMan RNasa P Detección Reactivos y TaqMan PCR Universal Mastermix (Applied Biosystems, Carlsbad, California, EE.UU.) para establecer el rendimiento amplificable.
KRAS mutación Análisis
estado
las muestras de tumor se evaluaron de forma prospectiva para
KRAS
estado de mutación usando el TheraScreen K-RAS BRAZOS mutación Kit (QIAGEN Manchester [anteriormente DxS Ltd], Manchester, Reino Unido).
cuantitativa de reacción en cadena de polimerasa (qPCR) se realizó utilizando un sistema de qPCR 7900 ABI Prism (Applied Biosystems).
KRAS
análisis de mutaciones se llevó a cabo por Labcorp CMBP, Research Triangle Park, Carolina del Norte, EE.UU..
Una alícuota del ADN restante se suministra a Sequenom GmbH, Hamburgo para el análisis utilizando la química Sequenom IPLEX y MALDI-TOF.
Sequenom IPLEX Pro Ensayo diseño em
la Tabla 1 muestra el panel a la medida de los ensayos de mutación que fue diseñado para detectar mutaciones en oncogenes 14 es decir,
BRAF, CDNK2A, CTNNB1, EGFR, erbB2, FGFR, HRAS, KRAS, STK11, MET, las ANR, TP53, PIK3CA
y
PTEN
. Las mutaciones fueron seleccionados en base a la frecuencia conocida en el CPNM o el melanoma, importancia biológica o presencia de cualquier "puntos calientes" significativos se prestan a ensayos específicos [2], [10] - [13].
La mutación El análisis se realizó a Sequenom GmbH (Hamburgo) y consistió en 10 multicines con 82 ensayos para detectar más de 160 mutaciones diferentes. protocolo estándar del fabricante fue seguida [9]. En resumen, 2 l de ADN genómico plantilla se amplificó por PCR multiplex para extender de tipo salvaje (WT) y mutante de ADN, seguido de un tratamiento de camarones-fosfatasa alcalina para eliminar los nucleótidos sobrantes. A continuación, una reacción de extensión del cebador (IPLEX Pro) se realizó con nucleótidos terminadores de masa modificada, y los productos fueron vistos en un SpectroCHIP (Sequenom). Las masas distintas se determinó por MALDI-TOF espectrometría de masas. Los datos fueron analizados utilizando el software MassARRAY Typer Analyser (Sequenom) [9].
Resultados
Análisis de las tasas de éxito
rendimiento de ADN osciló entre ~ 10 copias genómicas por microlitro de ~30,000 copias por microlitro con una media de 1837 copias por microlitro (5,9 ng /l). Once muestras con muy bajo número de copia (≤ 10 copias por microlitro) fallaron análisis utilizando el kit BRAZOS. Todas las muestras fueron analizadas con éxito utilizando el panel de MALDI-TOF.
Comparación entre MALDI-TOF y los brazos Panel Kit para
KRAS Hoteles en NSCLC
238 muestras fueron analizadas usando los ARMAS kit que fue diseñado para detectar los siguientes 7
KRAS mutaciones
: G12C /R /S /V /a /D y G13D. 46/238 (19%) muestras de pacientes fueron clasificados como
KRAS
mutante positivos en la prueba BRAZOS. El método MALDI-TOF cubre G12C /R /S /V /A /D, G13D /V /A /E y Q61L /R /P /E /K /H. 53/238 (22%) muestras fueron clasificadas como
KRAS
positivo por MALDI-TOF, con un paciente que tiene dos mutaciones separadas, una en el codón 12 y uno en el codón 61.
A
KRAS
ensayo de mutación A146 se incluyó en el panel de MALDI-TOF y no se detectaron mutaciones, de acuerdo con informes previos que sugieren que esta mutación particular, aunque relevante en el cáncer colorrectal, no es importante en NSCLC [12], [14] .
Concordancia de MALDI-TOF Método con los brazos Kit
la concordancia entre las dos plataformas se determinó a partir de datos de muestras que fueron evaluables por ambos métodos (es decir, se excluyeron las 11 muestras que fallaron por las armas Método). El método MALDI-TOF detectó 6 (13%) más
KRAS
mutaciones en total, en parte debido a una cobertura más amplia (Tabla 2 & amp; 3). Para aquellas mutaciones detectables por ambas plataformas el acuerdo de porcentaje positivo (PPA) entre el método ARMS y el método MALDI-TOF fue del 97,8% (Tabla 4) y el porcentaje de acuerdo en general (OPA) fue del 99,1%. La especificidad de la plataforma Sequenom en muestras que éstas de tipo salvaje por las armas fue del 98,3% (porcentaje de acuerdo negativo).
Las dos muestras discordantes incluyen una muestra en la que MALDI-TOF detectado una mutación G12D con el resultado del ensayo ARMS superior a los criterios descritos en el inserto kit para un resultado positivo. En la segunda muestra, MALDI-TOF genera ninguna señal detectable mientras BRAZOS detectaron una G12C. La explicación más probable de esto es que la alta proporción de ADN de tipo salvaje puede haber excedido la sensibilidad analítica de Pro química estándar IPLEX. Se ha demostrado por este grupo (datos no publicados) que este panel fue capaz de detectar mutaciones robusta a un 5% (límite de nuestro análisis) usando mezclas de líneas celulares.
Por lo tanto, la plataforma Sequenom MassARRAY realiza en menos tan bien en (OPA = 99,1%) la evaluación de
KRAS
estado de la mutación en muestras FFPE NSCLC clínicamente disponibles como la plataforma de armas (Tabla 4), con una mayor sensibilidad analítica (Tabla 3).
Otros prevalencia de mutaciones en NCT00890825 NSCLC cohorte
datos de MALDI-TOF se generó en las mutaciones adicionales, incluyendo el codón 12, 13 y 61 en
HRAS
y
ANR
y el codón 600 en
BRAF
. 107 de las 238 muestras (45%) fueron positivas para al menos una mutación (véase el cuadro S1). 52/238 (22%) de los pacientes tenían mutaciones en
KRAS
, consistente con la prevalencia esperada en NSCLC [2] (Tabla 5).
ANR
se detectaron mutaciones en 5 pacientes (2,1%), 3 de Q61 mutaciones, un G12 y G13 una mutación. Había 3
BRAF V600E mutante muestras
y 2 muestras mutantes
HRAS
en los codones P61 y G12.
Una serie de conocidos
TP53
Las mutaciones fueron investigados y se encontró que estar presentes en 23/238 (10%) de los pacientes. Debe tenerse en cuenta que el ensayo de MALDI-TOF solamente interrogado 10/480 (2%) de las sustituciones que se han reportado en el pulmón por pantallas sistemáticas en la base de datos COSMIC [13], aunque eran los 10 bases mutadas más comunes en la misma ( Tabla 5).
EGFR
mutaciones se detectaron en 20/238 (8,8%) de las muestras. Esto es un poco más bajo de lo esperado de los informes anteriores que sugieren
EGFR
mutaciones están presentes desde el 10% al 15% en los caucásicos con CPNM [15]. Una serie de factores pueden haber contribuido a la baja prevalencia de
EGFR
mutaciones en nuestro estudio. En primer lugar el 9% de nuestras muestras fueron carcinoma de células escamosas, que tienen mucho menor incidencia de
EGFR
mutaciones que ADC. En segundo lugar, no podemos descartar la preselección local de los pacientes de nuestro estudio, debido al conocimiento de
KRAS
estado positivo después de las pruebas locales,
EGFR
sujetos positivos se desvíen hacia la terapia de TKI y un mayor porcentaje de los sujetos con antecedentes de tabaquismo, lo que sería menos probable que tengan
EGFR
mutaciones [2], [12].
concomitancia de mutaciones en el CPNM
10/52 (19%) de los pacientes con
KRAS
mutaciones tenían mutaciones concomitantes, la más común de las cuales eran
TP53
,
PIK3CA
y
CDNK2A
. La Figura 1a. muestra la concomitancia de mutaciones en cada muestra de tumor que contenía al menos una mutación, n = 107.
B).
KRAS mutado en muestras
NCT00890825 con mutaciones concomitantes.
Figura 1b. muestra las 10 muestras que fueron
KRAS
positivos y tenían mutaciones concomitantes. Cuatro muestras tenían
TP53
mutaciones que eran ya sea en el
TP53
R282 R175 o el ADN mutaciones del dominio de unión. Ambas estas mutaciones están en la parte superior 6 más frecuente
TP53
mutaciones encontradas en el cáncer y son perjudiciales para la función TP53 [16]
.
Dos muestras tenían un
KRAS mutación G12D
co-produciendo con un activador
PIK3CA
mutación. Concomitancia de estas mutaciones se ha observado anteriormente [12]. Una muestra contenía una mutación R248C en el
FGFR
dominio extracelular que era coincidente con
KRAS
G12C.
FGFR3
mutaciones están presentes en alrededor de 3% en el cáncer de pulmón [17] y la mutación R248C es conocido para conducir la formación de tumores en modelos de xenoinjerto que fueron inhibidas por multi-quinasa ponatinib inhibidor.
Uno muestra con un
KRAS
mutación mostró una mutación concomitante con un
EGFR T790M
mutación.
KRAS
y
EGFR
mutaciones activadoras son generalmente considerados para ser mutuamente excluyentes [18], sin embargo, que se han observado en las frecuencias muy bajas [19], [20]. La mutación T790M se sabe que confieren resistencia a
EGFR TKI
de. Excepcionalmente, esta muestra también contenía una doble
KRAS
mutación y un
PTEN
mutación. Cabe señalar que la concentración de ADN fue extremadamente baja en esta muestra y una confirmación adicional mediante secuenciación no era posible.
Rendimiento de la MS Panel MALDI-TOF en muestras de melanoma
El mismo MALDI Panel -TOF MS también fue utilizado en un conjunto de 177 muestras de melanoma de ensayo clínico NCT00936221 que evaluó la eficacia de selumetinib en combinación con dacarbazina en comparación con dacarbazina sola en pacientes de primera línea con
BRAF mutación
cutáneo avanzado positivo o desconocido melanoma primario [8]. 69/177 (39%) muestras fueron
BRAF V600E
positiva utilizando MALDI-TOF. Esto se compara muy bien con los resultados de NCT00936221, que se ha realizado mediante una combinación de pruebas basadas en dos ramas diferentes y secuenciación de Sanger, que detectan mutaciones de BRAF V600E en muestras 69/177. La inmensa mayoría de las muestras se investigaron mediante las pruebas de armas. Dos muestras fueron
BRAF
mutación positiva por MALDI-TOF y negativa mediante secuenciación de Sanger. Los espectrógrafos MALDI-TOF indicaron que estas mutaciones estaban presentes debajo de la sensibilidad nominal de la secuenciación de Sanger, que puede ser tan alta como 20% de ADN mutante en el fondo de tipo salvaje. Dos muestras fueron negativas por MALDI-TOF, pero positivo por una prueba basada BRAZOS. La prueba tuvo una sensibilidad BRAZOS 2%, lo que es mejor que la sensibilidad del 5% establecimos para el panel de MALDI-TOF (datos no mostrados). En general 21/177 (12%) de las muestras de melanoma no análisis utilizando una prueba de brazos o secuenciación de Sanger, mientras que el método MALDI-TOF fue exitosa en todos los casos.
ANR
mutaciones también se detectaron en muestras de 38/177 (22%) de melanoma utilizando el panel de MALDI-TOF. Como una comparación directa con los datos generados por las armas y por secuenciación colectivamente el MALDI-TOF del acuerdo general porcentaje fue del 97% (152/156).
Discusión
En este estudio, se investigó la utilidad de la plataforma Sequenom MassARRAY MALDI-TOF en la detección de mutaciones en el CPNM y melanoma, en comparación con la tecnología de armas que ha demostrado una sensibilidad superior que la secuenciación directa en muestras de FFPE. El método MALDI-TOF tenía una mayor tasa de éxito análisis en muestras con bajo rendimiento de ADN, muy probablemente debido a la tamaño de amplificación más pequeño (~ 80 pb), muy por debajo del tamaño de los fragmentos de ADN promedio obtenible a partir de muestras de FFPE (~ 200 pb). Estudios previos han establecido la sensibilidad analítica de la tecnología de espectrometría de masas de Sequenom como 1-10% [21]. Estos datos muestran que la tecnología MALDI-TOF de Sequenom es de suficiente sensibilidad y especificidad para ser utilizado a la terapia directa para
KRAS
pacientes positivos de mutación, en NSCLC.
La importancia de las pruebas para las mutaciones en el 3 codones (G12, G13 y P61) en
KRAS mutado
comúnmente en el CPNM se demostró por la detección de un 13% más
KRAS
pacientes positivos en esta cohorte clínica. Un ensayo de fase III, SELECT-1, (NCT01933932) está actualmente en curso para evaluar la eficacia y seguridad de selumetinib en combinación con docetaxel en
KRAS mutación
pacientes con CPNM positivas que reciben tratamiento 2ª línea. En este ensayo, los pacientes están siendo seleccionados mediante el sistema cobas
KRAS Mutation Test
(CE /IVD) que está diseñado para detectar 19 mutaciones en los codones 12, 13 y 61 [22].
Otros mutaciones en
HRAS
,
ANR
y
BRAF
también se han detectado. Puesto que estas mutaciones se han relacionado con la activación de MEK, los pacientes que llevan estas mutaciones también pueden ser candidatos para el tratamiento con un inhibidor de MEK aunque se desconoce la importancia de estas mutaciones en NSCLC [23] - [25]. Por ejemplo, las líneas celulares de cáncer de pulmón que contiene
ANR
mutaciones han demostrado ser sensibles a la selumetinib inhibidor de MEK [26].
Los datos generados por
BRAF V600E mutaciones en
muestras de melanoma también mostraron concordancia en 152/156 (97%) de las muestras con los brazos o secuenciación de Sanger que demuestran la exactitud del método MALDI-TOF MS en
BRAF V600E mutaciones
. muestras de melanoma cutáneas a menudo contienen altas concentraciones de melanina que inhibe la PCR. El éxito del análisis de las muestras que fallaron uso de las armas demostró la capacidad del método MALDI-TOF MS para producir con éxito los datos en muestras de melanoma.
Un reto futuro en la clínica es la probabilidad de que la disponibilidad de tejido reducido debido a la mayor demanda para las pruebas. reflejo de las pruebas secuenciales de aberraciones genéticas puede resultar en la necesidad de que los procedimientos de biopsia más invasivos que podrían evitarse en algunos casos mediante pruebas de todos los marcadores informativos en paralelo cuando la primera presenta un paciente con NSCLC.
El valor de la Sequenom la plataforma es que utiliza menos muestra que otros métodos; 2 veces menos de ADN se utilizó para determinar el genotipo de 27 veces más loci (82 frente a 3) a través de 14 genes, que se utilizó para la prueba de armas que se veía sólo a un solo gen. Es concebible 2 × 5 micras secciones se eluyó en 50 l tendría material suficiente para la caracterización molecular de las muestras en esta cohorte. Los datos de nuestro estudio se generó en 1 día laborable que indica su trazabilidad en la clínica en consideración a su vez en torno a los requisitos.
Hemos detectado mutaciones concomitantes con
KRAS Hoteles en 10/52 (19%) de los casos. Dos muestras mostraron concurrentes
PIK3CA mutaciones
con
KRAS
.
PIK3CA
mutaciones en combinación con
KRAS
han demostrado que confieren resistencia a los inhibidores de MEK
in vivo
[27]. La capacidad para detectar mutaciones concomitantes podría proporcionar beneficio clínico adicional y potencialmente ofrecer una penetración en combinación apropiada se acerca a la terapia. El número de pacientes con mutaciones en NCT00890825 concomitantes eran demasiado pequeños para observar cualquier enlace a la respuesta.
Nuestros datos demuestran la utilidad potencial del panel Sequenom MALDI-TOF en muestras clínicas de NSCLC.
Un potencial factor limitante para el uso de pruebas de panel, como Sequenom en el ajuste de diagnóstico es el requisito de las autoridades reguladoras para una amplia validación de cada variante detectable que no siempre es sencillo debido a la disponibilidad de las muestras para la validación.
debe se observó que el uso de esta tecnología para la detección de mutaciones en genes supresores de tumores tales como
TP53
y
CDNK2A
sería un uso poco práctico e ineficaz del tejido debido al número de bases que sería necesario ser interrogado.
tecnología
Next Generation Sequencing (NGS) también puede cubrir múltiples genes. NGS es especialmente ventajoso cuando el cribado genes que tienen patrones de mutación dispares como
TP53
, y pueden detectar nuevas mutaciones, algo logrado menos fácilmente en la plataforma de MALDI-TOF. paneles NGS generalmente requieren una entrada de ADN mayor que este sistema para permitir la generación de bibliotecas de secuenciación utilizables, y sensibilidades pueden limitarse a alrededor de 5%, dependiendo de los requisitos de profundidad leído y contexto de la secuencia. NGS también presenta sus propios desafíos en torno a su vez el tiempo y los costos para el análisis, la curaduría y gestión de datos.
En un entorno de diagnóstico donde pocas mutaciones son de relevancia conocida para las terapias dirigidas, como en el CPNM, Sequenom MALDI-TOF tiene una clara ventaja sobre los métodos de secuenciación directa debido a su probada utilidad en FFPE de ADN derivada, vuelta rápida en el tiempo, los requisitos de almacenamiento de datos y modestos requisito mínimo análisis de usuarios.
en conclusión, el enfoque Sequenom MALDI-TOF de mutación perfilado es un uso eficiente e informativa de las muestras de pacientes. Se muestra la sensibilidad comparable y buena concordancia con una bien establecida extremadamente sensible
KRAS
ARMS prueba cuando se utiliza en muestras de NSCLC, con la capacidad de identificar una gama más amplia de mutaciones, utilizando menos tejido. perfiles de mutación concomitantes en muestras FFPE NSCLC podrían informar a la estrategia de tratamiento que los médicos utilizan sobre una base individual del paciente.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Todas las mutaciones detectadas por el panel de MALDI-TOF personalizado, por ejemplo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0100566.s001 gratis (XLSX)