Extracto
El cáncer de pulmón es muy heterogénea y está compuesta por varios subtipos que se encuentran en diversas etapas diferenciales. Las proteínas de integrina interactuar recientemente identificados kindlin-1 y kindlin-2 son los activadores de integrinas de receptores transmembrana que juegan un papel importante en la progresión del cáncer. En este informe se presentan los perfiles de expresión de kindlin-1 y kindlin-2 en los cánceres de pulmón utilizando muestras de pacientes y establecimos su correlación con la progresión del cáncer de pulmón. Se encontró que kindlin-1 se expresa en cáncer de pulmón no microcítico epitelios derivados, especialmente en el cáncer de pulmón de células escamosas, pero expresa en niveles bajos en el cáncer de pulmón de células grandes poco diferenciado. Sin embargo, kindlin-2 fue altamente expresado en el cáncer de pulmón de células grandes. Tanto kindlin-1 y kindlin-2 se encontró que no se expresa o se expresa en niveles muy bajos en el cáncer de pulmón de células pequeñas neuroendocrino derivados. Es importante destacar que el nivel de expresión kindlin-1 se correlacionó positivamente con la diferenciación de cáncer de pulmón de células escamosas. Sorprendentemente, se encontró que las proteínas de la familia kindlin muy homólogas, kindlin-1 y kindlin-2, exhibido contrarrestar papeles funcionales en células de cáncer de pulmón. La expresión ectópica de kindlin-1 en células de cáncer de pulmón de células no pequeñas inhibido
in vitro
la migración celular y en
in vivo
el crecimiento tumoral in, mientras que kindlin-2 promovido estas funciones. Mecánica, kindlin-1 prohibido epithelail de transición mesenquimales en células de cáncer de pulmón de células no pequeñas, mientras que kindlin-2 mejorado epithelail de transición mesenquimales en estas células. Tomados en conjunto, hemos demostrado que kindlin-1 y kindlin-2 diferencialmente regulan la progresión de células de cáncer de pulmón. Además, los niveles de expresión de kindlin-1 podrían usarse potencialmente como un marcador para la diferenciación de cáncer de pulmón y la orientación kindlin-2 podría bloquear el crecimiento invasivo de cáncer de pulmón de células grandes
Visto:. Zhan J, Zhu X, Guo Y, Wang Y, Wang Y, Qiang G, et al. (2012) de papel junto a kindlin-1 y kindlin-2 en cánceres de pulmón. PLoS ONE 7 (11): e50313. doi: 10.1371 /journal.pone.0050313
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Julio, 2012; Aceptado: October 18, 2012; Publicado: 29 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Zhan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF) de proyectos clave 30830048, el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China 2010CB912203 y 2010CB529402, NSFC31170711, los 111 Proyecto del Ministerio de Educación y la Fundación de Ciencias Naturales Beijing 7.120.002 de HZ, y también gracias a una subvención de Staffan Strömblad del Centro de Biociencias en el Instituto Karolinska. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción cáncer
pulmón es una enfermedad compleja que se pueden clasificar en histológicamente carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC), que representa casi el 20% del cáncer de pulmón, y la mayor parte es no microcítico de pulmón de células beta del cáncer (NSCLC), que representa más del 80% de cáncer de pulmón [1]. NSCLC abarcan carcinoma de células escamosas (SCC), adenocarcinoma (AC), y carcinoma de células grandes (LCC) [2]. carcinomas diferenciados y pobremente diferenciados altamente diferenciadas, moderados pueden verse en SCC y AC. El cáncer de pulmón es bastante heterogénea en el crecimiento tumoral, invasión y metástasis, así como en los resultados después del tratamiento. El cáncer de pulmón en diferente estado de diferenciación discrepancia en tumores malignos, por ejemplo, está representada, carcinomas de pulmón de bajo diferenciados son más malignos que los cánceres de alto diferenciado, que está creciendo rápido y altamente metastásico.
miembro de la familia Fermitin 1 (FERMT1) que codifica kindlin -1 es un FERM (4,1-Ezrin-Radixin- Moesin) -Con un contenido de proteína que pertenece a la familia kindlin. Kindlins son proteínas que interactúan integrina que regulan la activación de la integrina a través de la interacción con la integrina β subunidad dominio citoplasmático [3], [4]. Kindlin-2 codificada por FERMT2 se encontró para controlar una señalización bidireccional a través de la integrina [5]. Kindlin fue designado de síndrome de Kindler que fue acuñado en 1954 ofrecido por una combinación de atrofia epidérmica, capilares y pigmentación cutánea moteada ensanchado [6]. Las mutaciones de kindlin-1 se habían identificado como la causa del síndrome de Kindler [7], [8]. Hasta hace poco miembro de la familia kindlin han sido conectados a la progresión de los tumores [9]. Kindlin-2 se ha demostrado que se expresa en el mesotelioma maligno y regula la adhesión y la migración [10], y el nivel de expresión de kindlin-2 está relacionado con la sensibilidad de las células de cáncer de próstata a la muerte celular inducida por cisplatino [11]. Se encontró kindlin-2 expresión correlacionada con la invasión tumoral, metástasis en los ganglios linfáticos, y el resultado del paciente en el cáncer gástrico [12]. Kindlin-1 se ha encontrado sobreexpresada en el 60% de cáncer de pulmón y el 70% de cáncer de colon como examinado por los niveles de expresión de ARN de cada diez pacientes [9]. Muy recientemente, Sin et al demostraron que kindlin-1 juega un papel en el crecimiento del cáncer de mama y la metástasis de pulmón [13]. Además de la expresión en las células tumorales, kindlin-2 también se encontró que estaba altamente expresado en el estroma del tumor en los cánceres de vejiga [14]. Sin embargo, mientras kindlin-1 y kindlin-2 están relacionados con la progresión del cáncer, kindlin-3 es contributivo en los trastornos hematopoyéticos [15] - [19]. Kindlin-2 expresa ampliamente en el músculo liso endotelial y vesicular [3], [20], y es un componente esencial de los discos intercalados que se requiere para la estructura cardiaca vertebrado y la función [21]. Sin embargo, hasta ahora se conoce poco acerca de los roles de kindlin-1 y kindlin-2 en la progresión del cáncer de pulmón.
En este estudio se pretende responder en primer lugar, que si kindlin-1 y kindlin-2 juegan un papel en la la progresión del cáncer de pulmón. Debido a la alta heterogenecity de cáncer de pulmón también queremos contestar que si kindlin-1 y kindlin-2 expresados diferencialmente en diversos tipos de cáncer de pulmón y funciones claramente en células de cáncer de pulmón. Con este fin, hemos investigado la expresión de kindlin-1 y kindlin-2 en un panel de muestras de tejido de cáncer de pulmón y la atención que se presta para comparar los niveles de expresión relativa kindlin-1 y kindlin-2 en el mismo paciente. Curiosamente, hemos identificado un papel recíproco de kindlin-1 y kindlin-2 en la regulación de la progresión del tumor tanto en células y animales. Tomados en conjunto, nuestros resultados proporcionan una nueva comprensión de kindlin-1 y kindlin-2 en la progresión de células de cáncer de pulmón y pueden ayudar para el diseño de fármacos futura hacia la terapéutica del cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Ética
el Comité de Ética de la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud ha aprobado el estudio actual para experimentos con ratones (Número de Permiso: LA2011-73). El Comité de Ética del Hospital de Amistad China-Japón ha aprobado el estudio actual utilizando tejidos tumorales de pacientes con cáncer de pulmón con fines de investigación (Número de Permiso: ZRLW-5) .Los procedimientos para ratones y humanos materiales manipulación estaban en conformidad con las normas éticas de la Helsinki Declaración de 1975 y la revisados en 1983.
los vectores de expresión, cultivo de células y transfección estable de células líneas
kindlin-1 cDNA de longitud completa se clonó a partir de una biblioteca de ADNc de placenta humana utilizando cebadores: CAGAATCCATGCTGTCATCCACTGACTTTAC (cebador directo) y GATCTAGATCAATCCTGACCGCCGGTCAA (cebador inverso). El producto de PCR fue clonado en el vector pCRII, y luego se clonó adicionalmente en pCMV10-3 Flag × vector (Sigma) utilizando los sitios HindIII-EcoRI. U1752, H1299, líneas celulares A549 y U1810 se adquirieron de ATCC en los EE.UU. o Centro de Recolección de células de la Escuela de Medicina de la Unión de Pekín en China y se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen) con 10% de SFB y 50 mg /ml de gentamicina. Las células fueron cultivadas en 75 cm
2 frascos de cultivo o placas de 60 mm a 37 ° C en la humedad con 5% (v /v) de CO
2. Los medios se cambian cada dos días. Para el establecimiento de clones estables que expresaban kindlin-1 y kindlin-2 por separado, las células H1299 se transfectaron con la bandera-kindlin-1, Bandera-kindlin-2 y vacío vector usando Lipofectamine. Veinticuatro horas después de la transfección las células se pasaron y se añadió G418 a una concentración final de 1,200 g /ml. Los clones individuales que expresaban kindlin-1 o kindlin-2 se agruparon para evitar efectos clonales. Las células que expresan agrupados kindlin-1 o kindlin-2 se utilizaron para los estudios funcionales como se indica en el texto.
tejidos tumorales
muestras de tejido de cáncer de pulmón se obtuvieron del Departamento de Cirugía Torácica entre China y Japón hospital de la amistad, Beijing, china, y se seccionaron en el Departamento de Ciencias de la Salud Centro de Patología de la Universidad de Pekín, Beijing, china. Entre las secciones de tejido tumoral 140 que se utilizaron para los análisis de inmunohistoquímica, 65 son SCC, 43 son de CA, 12 son LCC y 20 son SCLC (Tabla 1). Todas estas muestras se sometieron a kindlin-1 y kindlin-2 tinción. Además, 7 frescos tejidos de cáncer de pulmón con los tejidos tumorales alrededores emparejados incluyen 3 SCC, AC 3 y 1 LCLC. Estos tejidos se utilizaron para extraer el ARNm para la detección de qPCR kindlin-1 de expresión.
Western El análisis de transferencia
PBSTDS tampón de lisis con la presencia de cóctel inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics, GmbH) se utilizó para extraer los lisados de células totales. 80% de los lisados de células se añadió a 20% de 5 x tampón de carga de SDS, a continuación, resuelto por 10% de gel de SDS-PAGE y se transfirieron sobre membranas de PVDF (tamaño de poro 0,45 micras). Los anticuerpos primarios anti-kindlin-1 anticuerpo monoclonal de ratón (dilución 1:500; Clone 4A5.14, Millipore, EE.UU.), anticuerpo monoclonal de ratón anti-kindlin-2 (1:1000 dilución; Clone 3A3, Millipore, USA), anti anticuerpo monoclonal -Vimentin conejo (1: 2000 dilución; Epitomics, EE.UU.), anticuerpo monoclonal de conejo anti-Ecadherin (1: 3000 dilución; Epitomics, EE.UU.), anticuerpo monoclonal de conejo anti-N-cadherina (1: 10000 dilución; Epitomics, EE.UU. ), anticuerpo anti-Flag-monoclonal (1:10000 dilución; Clon M2, Sigma, EE.UU.) y anti-β-actina anticuerpo monoclonal de ratón (dilución 1:1000; clon C4, Santa Cruz, EE.UU.) se incubaron con las membranas separado bajo rotación. Después de un lavado a fondo, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios que reconocen de conejo o Ig de ratón (Jackson Laboratories, EE.UU.) correspondiente. Por último, las bandas se visualizaron por la quimioluminiscencia mejorada (Pierce).
PCR cuantitativa
PCR cuantitativa (qPCR) se realizaron ensayos para detectar la expresión de kindlin 1-mRNA en tejidos tumorales de pulmón. En resumen, los tejidos y tumores de pulmón ARNm totales normales se aislaron por Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), y 2 g de ARN total fue transcrito invertir utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Promega, CA, EE.UU.). A continuación, se realizó la PCR usando Taq PCR Mastermix (Tiangen, China) con la configuración como: 94 ° C 2 min; 94 ° C 30 seg, 60 ° C 30 seg, 72 ° C 30 seg, durante 30 ciclos; 72 ° C 5 min. El primer secuencias fueron los siguientes: para kindlin-1 humano, hacia adelante: TCATGTTGGAGGAGTGATGC, revertir: AAGCCAGCAATGCTTCTGTT; para la actina, hacia adelante: CTGAGCGTGGCTACTCCTTC, revés: GCCATCTCGTTCTCGAAGTC. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 2,5% en presencia de bromuro de etidio para la visualización. PCR cuantitativa también se utilizó para identificar los cambios en el nivel de ARNm inducidos por MMP-1 y kindlin kindlin-2 en la línea celular H1299. MMP-2 hacia adelante: AGCTCCCGGAAAAGATTGAT, revertir: GGTGCTGGCTGAGTAG- ATCC; MMP-7 hacia adelante: GTCTCGGAGGAGATGCTCAC; Reverso: TACCCAAA-GAATGGCCAAGT; MMP-9 hacia adelante: TCTTCCCTGGAGACCTGAGA; Reverso: ATTTCGACTCTCCACGCATC. veces los cambios relativos en la qPCR se determinaron por el método ΔΔCt.
ensayos de la motilidad celular
Transwell cámaras (Costar) con 8 micras de tamaño de poro se utilizaron para llevar a cabo el ensayo de migración celular. En primer lugar, el colágeno tipo I se utiliza para recubrir la superficie inferior de las membranas Transwell durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, las células H1299 estable transfectadas con Flag-BAP (fosfatasa alcalina bacteriana), Flag-kindlin-1 y Flag-kindlin-2 se sembraron en la superficie superior de la Transwell. Después de 6 h de incubación en tampón de migración (RPMI 1640, CaCl 2 mM
2, mM MgCl 1
2, MnCl 0,2 mM
2, y 0,5% de BSA) a 37 ° C en 5% humidificado CO
2, las membranas Transwell fueron fijadas con 4% de formaldehído durante 15 min y se tiñeron por cristal violeta durante 10 minutos. Por fin, 6 campos microscópicos fueron elegidos al azar para el recuento de las células migradas.
Para celular herida experimento de curación, 48 h después de la transfección las células en monocapa se rayan con una punta de pipeta estándar de 100 l. Las monocapas heridos se lavaron dos veces para eliminar las células no adherentes con 0,1 M PBS (pH 7,2). Doce horas más tarde se observó la herida con un objetivo 20 × (Nikon, Japón) y se midió la anchura de las heridas de células. Se observaron y fotografiaron seis campos microscópicos para cada plato.
La inmunohistoquímica (IHC)
diapositivas obtenidas de tumores de pulmón, del Hospital Amistad Japón-China estaban fijados con formalina y paraffinembeded. Desparafinización y la hidratación se realizaron y seguidas por la supresión de la actividad de peroxidasa endógena usando 0,3% de peróxido de hidrógeno durante 30 min y microondas para la recuperación de antígenos en tampón de 10 mM citrato de sodio (pH 6,0) durante 20 min. Se utilizó anticuerpo purificado por afinidad policlonal anti-kindlin-1 (PKU Facility Animal) a 2 mg /ml y monoclonal anti-kindlin-2 (Millipore, EE.UU.) a 2 mg /ml para realizar estos experimentos. El anticuerpo primario se utilizó a 4 ° C durante la noche. Entonces PV9000 2 pasos más poli-HRP /se aplica el sistema de detección de IgG de conejo (Zhong Shan Jin Qiao) anti-ratón. El método de estreptavidina-peroxidasa de biotina se utilizó para la detección y diaminobencidina se aplicó para sustrato (kit de detección ChemMate, DAKO). Hematoxilina se utilizó para la contratinción. Se realizaron controles negativos omitiendo el uso del anticuerpo primario.
Evaluación de la inmunohistoquímica
Dos patólogos independientes evaluaron todos los immunostainings y una justificación de consenso sobre la base de la discusión se registró. La evaluación se clasificó en 4 grados: ninguna reactividad marcado como 0, reactividad débil como 1+, la reactividad moderada como 2+ y 3+ reactividad fuerte como
in vivo de xenoinjertos
el crecimiento del tumor. experimentar
Balb /c ratones desnudos se implantaron subcutáneamente en el flanco con 1 × 10
6 células que se sobreexpresan de forma estable kindlin-1, kindlin-2 y el vector de control por separado. Los tumores se midieron por sus tamaños en dieciocho días y continuar registrando durante el tiempo indicado. Los ratones fueron sacrificados mediante eutanasia cuando el crecimiento del tumor a 1 cm de diámetro. Los tumores se sacan y se ponderan.
análisis El análisis estadístico
estadístico de materiales de pacientes se realizaron con la prueba de Kruskal-Wallis y análisis estadísticos para muestras apareadas utilizó la prueba t de Student. Todos los análisis estadísticos se utilizan SPSS version14.0. Los resultados se consideraron estadísticamente significativa en el nivel de
P
. & Lt; 0,05
Resultados
kindlin-1 se expresa en el tejido pulmonar normal y diferentes subtipos de cáncer de pulmón
kindlin-1 de expresión en el cáncer de pulmón se ha sugerido preliminarmente
9,13. Sin embargo, nada se conoce en detalle para kindlin-1 de expresión en diversos subtipos de pacientes con cáncer de pulmón. Para entender la involement Posible de kindlin-1 y kindlin-2 en la progresión del cáncer de pulmón, lo primero que examinó la expresión de kindlin-1 en tejidos de pacientes con cáncer de pulmón utilizando immnohistochemistry (IHC) con un anticuerpo policlonal purificado por afinidad kindlin-1 anticuerpo, con normalidad pulmón tejidos como control. Se encontró que kindlin-1 no era detectable en los alvéolos pulmonares normales y señal débil en los vasos sanguíneos pulmonares normales se observó (Fig. 1a-A). Curiosamente, kindlin-1 se encontró altamente expresado en el citoplasma y núcleos de las células en forma de cono y células fusiformes distribuidas en el epitelio columnar (Fig. 1A-B). Sin embargo, kindlin-1 se encontró débilmente expresado en las células colummar, células caliciformes y no se expresa en la memberane sótano. En los tejidos tumorales de pulmón, kindlin-1 se encontró altamente expresado en el citoplasma así como la membrana de SCC (Fig. 1A-C). Además, kindlin-1 se encontró moderadamente expresado en el citoplasma de epitelio glandular tumoral en AC (Fig. 1A-D) y débilmente expresado en LCC (Fig. 1A-E). Sorprendentemente, no se observó expresión de kindlin-1 total en SCLC (Fig. 1a-F) (Tabla 2).
a. Kindlin-1 de expresión en los tejidos normales y de subtipos diferentes de cáncer de pulmón examinados por IHC. Fotos mostradas son pulmonar normal (A), el epitelio columnar ciliado pseudo-estratificado (B), SCC (C), AC (D), LCC (E), y el SCLC (F). segundo. Determinación de los niveles de mRNA de kindlin-1 en las muestras clínicas frescas medidos por qPCR. do. Re-análisis de kindlin-1 de expresión en la base de datos Oncomine. Izquierda: kindlin-1 de expresión en el conjunto de datos extraídos de pulmón Hou; Derecha: kindlin-1 de expresión en el conjunto de datos extraídos de pulmón Garber. Los análisis estadísticos entre los diferentes grupos de pacientes fueron examinados por
t de Student
. ** Representa para
p
. & Lt; 0,01
Además, se analizó la expresión del ARNm kindlin-1, incluso los tejidos tumorales de SCC, AC y el SCLC de pulmón recién preparada pacientes con cáncer. Se encontró que el SCC mostraron niveles más altos de kindlin-1 de expresión de CA y SCLC visualizará el de más baja de kindlin-1 entre los diversos tipos de pacientes con cáncer de pulmón examinados (Fig. 1b).
Es alentador que el anterior kindlin -1 perfil de expresión tal como se determina ya sea por inmunohistoquímica o qPCR fue apoyado además por la re-Analizing kindlin-1 perfil de expresión de ARNm en los conjuntos de datos del paciente a partir de bases de datos Oncomine (www.oncomine.com). Tras el análisis de conjuntos de datos de Affymetrix del paciente de cáncer de pulmón Hou y Garber, encontramos que kindlin-1 expresión en diferentes tipos de NSCLC en el nivel de ARNm se incrementó significanly (Fig. 1c), que está de acuerdo con los resultados de IHC anteriores. Estos datos sugieren que kindlin-1 es de hecho altamente expessed en SCC mediante el examen de diferentes co-horts paciente.
kindlin-1 de expresión se correlaciona con la diferenciación celular en SCC pero no en AC
mencionados arriba resultados indicaron que incluso dentro de SCC, kindlin-1 de expresión es heterogénea. Esto sugiere que kindlin-1 de expresión puede variar con el cambio de la diferenciación celular en el cáncer de pulmón. Con este fin, analizamos la expresión kindlin-1 en SCC con diferentes etapas de la diferenciación celular. Curiosamente, se encontró que kindlin-1 es altamente expresado en el SCC bien diferenciado que el moderado diferenciada SCC (Fig 2-A y -B.); y la moderada diferenciado SCC expresaron mayor kindlin-1 que el SCC pobremente diferenciado (Fig. 2-B y -C). Sin embargo, esta tendencia de kindlin-1 de expresión que se encuentra en SCC no era aplicable a AC (datos no mostrados). Tomados en conjunto, estos datos indican que la etapa de diferenciación mayor responde a la más alta expresión de kindlin-1 en SCC (Tabla 2).
fotos representativos que reflejan kindlin-1 expresión en SCC se han seleccionado y los análisis estadísticos pueden ser encontrado en la Tabla 2. a, bien diferenciado SCC. B, SCC diferenciada moderada. C, SCC pobremente diferenciado.
kindlin-1 y kindlin-2 se expresa de forma diferente en diferentes subtipos de cáncer de pulmón
Hasta ahora no hay ningún informe sobre kindlin-2 expresión en el pulmón líneas celulares de cáncer, así como en pacientes con cáncer de pulmón. Es de interés saber si tanto kindlin-1 y kindlin-2 se expresan en pacientes con cáncer de pulmón. Con este fin, hemos examinado la expresión kindlin-2 en el mismo panel de muestras de pacientes antes mencionados. Si bien se encontró kindlin-2 se expresa en los vasos sanguíneos de los tejidos pulmonares normales (Fig. 3a-A), kindlin-2 fue encontrado altamente expresado en el citoplasma y núcleos de las células en forma de cono (Fig. 3a-B) similares a la tinción kindlin-1 como se muestra en la Fig. 1a-B. Esto indica que tanto kindlin-1 y kindlin-2 se expresan en la epithilium bronquios normal. Curiosamente, kindlin-2 patrón de expresión es bastante diferente de la de kindlin-1 en SCC. En lugar de expresarse en SCC y AC, kindlin-2 se encontró hihgly expresa en el estroma tumoral (Fig. 3a-C y -D), que contrastan con el patrón de expresión de kindlin-1 en estos tipos de cáncer de pulmón. Además, kindlin-2 se encontró altamente expresado en LCC en la membrana celular y el estroma tumoral circundante en comparación con la expresión débil de kindlin-1 en LCC (Fig. 3a-E). Además, se observó poca o ninguna tinción positiva de kindlin-2 en SCLC (Fig. 3a-F), que es similar a la tinción kindlin-1 en el mismo tipo de células (Fig. 1a-F). Estos resultados IHC se han reforzado aún más por la re-análisis de kindlin-2 mRNA expresión en bases de datos Oncomine Hou pulmón y Garber pulmonares (Fig. 3b). En la serie de secciones de tejido de SCC paciente, kindlin-1 se expresa fuertemente en las células tumorales, mientras que kindlin-2 se encontró expresa principalmente en el estroma del tumor (Fig. 3c-A, -B). Estas observaciones indican que kindlin-1 y kindlin-2 se expresan diferencialmente en células de cáncer de pulmón.
a. Kindlin-2 expresión en los tejidos de los tejidos normales y cáncer de pulmón examinados por IHC. Fotos mostradas son pulmonar normal (A), el epitelio columnar ciliado pseudo-estratificado (B), SCC (C), AC (D), LCC (E), y el SCLC (F). segundo. Re-análisis de kindlin-2 expresión en la base de datos Oncomine. Izquierda: kindlin-2 expresión extraída del conjunto de datos de pulmón Hou; Derecha: kindlin-2 expresión extraída del conjunto de datos de pulmón Garber. Los análisis estadísticos entre los diferentes grupos de pacientes fueron examinados por
t de Student
. ** Representa para
p Hotel & lt; 0,01. do. La comparación de las expresiones de kindlin-1 y kindlin-2 en SCC de la misma paciente. Como se muestra kindlin-2 es altamente expresado en el estroma del tumor, pero no en células de cáncer de pulmón.
Tabla 2 summerized la expresión de kindlin-1 y kindlin-2 en los tumores de diferentes pacientes de cáncer de pulmón. Kindlin-1 de expresión fue positiva en el 84% de los pacientes con cáncer de pulmón. Para los diferentes subtipos de tumores, tanto kindlin-1 y kindlin-2 mostraron una alta tasa positiva en el CPNM que en SCLC (
p Hotel & lt; 0,0001). Curiosamente, dentro de NSCLC kindlin-1 expresado en niveles bajos en LCC, moderados en AC, y la más alta expresión de kindlin-1was encontrado en SCC (
p Hotel & lt; 0,0001). Sin embargo, kindlin-2 tiene un perfil de expresión de reciprocidad: el nivel de expresión de kindlin-2 es baja en SCC, moderado en CA y la más alta expresión de kindlin-2 se observó en LCC (
p Hotel & lt; 0,0001) . Curiosamente, se encontró que la expresión kindlin-1 se correlacionó con la diferenciación de los tumores. SCC, compuesta por epitelio escamoso, y AC integrado por los epitelios glandulares se exhibieron mayor kindlin-1 de expresión de LCC que se clasifica como carcinoma indiferenciado (
p Hotel & lt; 0,0001). Por otra parte, bien diferenciado SCC tiene una mayor kindlin-1 de expresión de SCC pobremente diferenciado (
p = 0,0024
). En comparación, no se identificó ninguna correlación para kindlin-1 de expresión con la diferenciación de AC (
p = 0,8523
). Del mismo modo, no se encontró kindlin-2 expresión que se correlaciona con la diferenciación de los diferentes subtipos de cáncer de pulmón (
p
= 0,1759).
kindlin-1 y kindlin-2 regulan opuesta cáncer de pulmón la progresión de células
in vitro
Dado que kindlin-1 y kindlin-2 se expresan diferencialmente en células de cáncer de pulmón, es tentador para entender si kindlin-1 y kindlin-2 también funcionan diferencialmente a regular la progresión de células de cáncer de pulmón. Hemos determinado anteriormente que kindlin-2 fue altamente expresado en la parte delantera invasivo tumor en el mesotelioma maligno [10]. Con este fin, hemos examinado la expresión de kindlin-1 y kindlin-2 en el
de novo
SCC que se localiza en los sitios secundarios de la difusión intra-pulmonar de un paciente SCC. Como se muestra en la Fig. 4a-A, kindlin-1 se expresa fuertemente en la masa tumoral de
de novo
SCC pero débilmente expresado en el frente invasivo del tumor. Sin embargo, kindlin-1 tinción se concentra en los núcleos de las células en la parte delantera invasivo tumor de la
de novo
SCC, sugiriendo un citoplasma al núcleo de transición puede existir para kindlin-1 (Fig. 4a-A.Arrowed) . Por el contrario, kindlin-2 no se encuentra expuesto en el mismo tipo de estructura del mismo paciente (Fig. 4a.B). Curiosamente, un citoplasma al núcleo de transición kindlin-2 también se encontró en la parte delantera invasivo tumor (Fig. 4a-B.Arrowed). En conjunto, estos datos sugieren que kindlin-1 pero no kindlin-2 está implicada en la regulación de la colonización de células de cáncer de pulmón en SCC. Por lo tanto, continuamos para caracterizar el papel diferencial de kindlin-1 y kindlin-2 en la regulación de la progresión del cáncer de pulmón. En primer lugar, detectamos las expresiones de kindlin-1 y kindlin-2, así como transición epitelio mesénquima (EMT) marcadores de E-cadherina y vimentina en líneas celulares de cáncer de pulmón derivados de SCC, AC y LCC y encontramos que kindlin-1 y Kindlin- 2 fueron expresadas diferencialmente en líneas celulares de cáncer de pulmón (Fig. 4B). entonces establecimos H1299 células que sobreexpresan de forma estable kindlin-1. Encontramos que los marcadores de EMT N-cadherina y vimentina se downregulated en las células H1299 cáncer de pulmón de forma estable sobreexpresan kindlin-1 en comparación con las células de control que expresan Flag-BAP (Fig. 4c), lo que sugiere un papel de kindlin-1 en la inhibición de programa de EMT en células de adenocarcinoma de pulmón. Además, para examinar el papel diferencial de kindlin-1 y kindlin-2 en la regulación de la motilidad celular de cáncer de pulmón, se realizó el ensayo de migración hepatotactic sobre el colágeno de tipo I que media β1 migración celular relacionados integrina. Se encontró que kindlin-1 inhibió mientras kindlin-2 promueve la migración de células H1299 en un ensayo Transwell (Fig. 4d). Mientras tanto, el papel distinto de kindlin-1 y kindlin-2 en la regulación de la invasión de células de cáncer de pulmón, se examinó mediante la determinación de la expresión de metalloprotenases incluyendo MMP7, MMP9 y MMP13. Se encontraron MMP7 y MMP9 ser downregulated con la expresión ectópica de kindlin-1, mientras que MMP7 y MMP13 se upregulated con la expresión ectópica de kindlin-2 (Fig. 4e). En una transfección transitoria, la sobreexpresión de kindlin-1 condujo a la regulación por disminución de N-cadherina (Fig. 4f panel de la izquierda), lo que sugiere un papel inhibitorio de kindlin-1 en EMT ocurrencia. Sin embargo, desmontables de endógeno kindlin-2 se redujo el nivel de N-cadherina (Fig. 4f panel de la izquierda), un efecto que es equivalente a la sobreexpresión de kindlin-1. Además, se examinaron los niveles de expresión de kindlin-2 en LCC primaria y secundaria y se encontró que kindlin-2 se expresa fuertemente en los ganglios linfáticos de metástasis LCC (Fig. 4g-B, flechas) en comparación con el tumor primario del mismo paciente ( Fig. 4G-A). Este hallazgo sugiere que el alto nivel de kindlin-2 expresión puede corresponder a un alto potencial de invasión LCC. Tomados en conjunto, estos datos indican que las expresiones diferenciales de kindlin-1 y kindlin-2 en pacientes con cáncer de pulmón corresponden a una regulación opuesta sobre la migración celular, así como de la capacidad invasiva de células.
a. Expresión de kindlin-1 y kindlin-2 en el secundario
de novo
SCC de un paciente SCC invasivo. A. kindlin-1 de expresión en el
de novo
SCC. B. expresión kindlin-2 en el
de novo
SCC del mismo paciente como en A. b. Panel izquierdo: Expresión diferencial de kindlin-1, kindlin-2, E-cadherina y vimentina en varias líneas celulares de cáncer de pulmón controlados por actina para la carga. Panel derecho: La cuantificación de los niveles relativos de expresión de proteínas. do. Panel izquierdo: La expresión estable de kindlin-1 en las células H1299. Indicado se mezclan clones estables que expresan Bandera-kindlin-1. Panel derecho: La cuantificación de los niveles de proteína relativos para kindlin-1 regulado N-cadherina y vimentina. re. Kindlin-1 y kindlin-2 diferencialmente regulan la migración de las células H1299. Que se muestra es la cuantificación y la trama como media ± SEM de tres experimentos independientes. Los análisis estadísticos entre los diferentes grupos de células fueron examinados por
t de Student
. ** Representa para
p Hotel & lt; 0,01. mi. Kindlin-1 y kindlin-2 diferencialmente regulan los niveles de mRNA de MMP analizados por qPCR en células H1299 de forma estable que expresan kindlin-1 y kindlin-2. Insertar muestra la expresión de kindlin-1 y kindlin-2 en los clones estables mixtos aplicados en qPCR. F. paneles de la izquierda: Expresión de kindlin-1 regula negativamente la N-cadherina y Derribo de kindlin-2 regula a la baja la N-cadherina. paneles de la derecha: La cuantificación de los niveles de proteína relativos para kindlin-1- y kindlin-2-regulados N-cadherina. Los análisis estadísticos entre los diferentes grupos de células fueron examinados por
t de Student
. ** Representa para
p Hotel & lt; 0,01. gramo. Expresión de kindlin-2 en metástasis de los ganglios linfáticos gran paciente con cáncer de pulmón de células. A. Primaria gran cáncer de pulmón de células; el nodo B. La linfa metástasis de cáncer de pulmón de células grandes del mismo paciente.
kindlin-1 y kindlin-2 en sentido opuesto regulan el crecimiento celular del cáncer de pulmón en un
in vivo
modelo de xenoinjerto de ratón
con base en el hallazgo anterior de que kindlin-1 y kindlin-2 se expresaron diferencialmente en las muestras de pacientes con cáncer de pulmón, y la migración de células de cáncer de pulmón en oposición regulada
in vitro
, estábamos ansiosos por saber si kindlin -1 y kindlin-2 juega un papel distinto en la regulación del crecimiento tumoral
in vivo
. Con este fin, los xenoinjertos tumorales de ratón con kindlin-1 sobreexpresión crecieron más lento y los tamaños de los tumores eran más pequeñas que la del control (Fig. 5a y b). Sin embargo, los tumores con kindlin-2 sobreexpresión crecieron mucho más rápido y los tamaños de los tumores fueron mucho más grande que la del control (Fig. 5a y b). Curiosamente, los tejidos tumorales se recuperaron a partir de los xenoinjertos de ratón también muestran una mayor N-cadherina y la expresión de vimentina en los kindlin-2 tumores que sobreexpresan, sin cambios de N-cadherina y vimentina en kindlin-1 sobreexpresados o los tumores de control (Fig. 5c). Estos datos demuestran claramente que kindlin-1 y kindlin-2 no sólo el crecimiento del tumor en oposición regulado sino también el potencial invasivo de tumores en el
in vivo
modelo de xenoinjerto de ratón.
a. curva de crecimiento del tumor. El volumen del tumor H1299-Flag-kindlin-1 grupo es significativamente menor que el grupo Bandera-BAP (
p Hotel & lt; 0,01 según el análisis de la
t de Student
) en el día 22 y mientras tanto el volumen de la bandera-kindlin-2 grupo es obviamente mayor que el grupo Bandera-BAP (
p Hotel & lt; 0,01 según el análisis de
t de Student
). segundo. Los tumores recuperados de los ratones en el día 27. c. Panel izquierdo: Determinación de la expresión de N-cadherina y vimentina de xenoinjertos de tumores que expresan de forma estable kindlin-1, kindlin-2 y el BAP control por parte de los análisis de Western blot. Panel derecho: La cuantificación de los niveles de proteína relativos para regulado kindlin-2 kindlin-1 y N-cadherina y vimentina. Los análisis estadísticos entre los diferentes grupos tumorales fueron examinados por
t de Student
.