Extracto
Antecedentes
cáncer de vejiga urotelial es el noveno cáncer más común. A pesar del tratamiento quirúrgico y quimioterápico el pronóstico sigue siendo pobre vez que el cáncer de vejiga progresa a un estado músculo invasivo. Descubrimiento de nuevos marcadores de diagnóstico y efectores fisiopatológicos podría ayudar a contribuir a opciones diagnósticas y terapéuticas novedosas. La forma por la matriz extracelular microambiente matriz extracelular afecta críticamente funciones de las células del tumor y de células de estroma. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar la posible implicación de las pequeñas biglicano proteoglicanos ricos en leucina en la progresión del cáncer urotelial de vejiga humana.
Métodos y Resultados
Para este propósito de biopsias de tumores 76 pacientes con cáncer de vejiga con diferentes estadios tumorales (PTA, pT1-T4) fueron investigados en relación con biglicano expresión y correlacionados con un largo plazo (10 años) el seguimiento clínico. Curiosamente, una mayor expresión de ARNm de biglicano se asoció con etapas tumorales más altos y de invasión muscular.
En
in vitro
knock-down de biglicano endógena en células de carcinoma urotelial humanos (células J82) aumento de la proliferación, mientras que la adición de biglicano recombinante y la sobreexpresión de la proliferación de células tumorales inhibidas biglicano. En línea con este efecto inhibidor del crecimiento de biglicano, el trasplante de células J82 después de knock-down de biglicano resultado aumentado en forma significativa el crecimiento de tumores de xenoinjertos subcutáneos en ratones desnudos
en
in vivo
. Además, el tratamiento con dos, la tirosina quinasa antiproliferativos de múltiples receptores de inhibidores-sunitinib y sorafenib-fuertemente upregulated expresión biglicano. Colectivamente, los datos experimentales sugieren que la alta expresión biglicano se asocia con la proliferación celular tumoral reducida. De acuerdo, el análisis de Kaplan-Meier reveló una mayor supervivencia a 10 años en los pacientes con alta expresión de ARNm biglicano en biopsias de tumores.
Conclusión
En conclusión, los datos actuales sugieren que el biglicano es un inhibidor endógeno de la proliferación celular del cáncer de vejiga que se regula positivamente en respuesta a inhibidores de tirosina quinasa anti-proliferativas. Además, la alta expresión biglicano se asocia con un pronóstico favorable
Visto:. Niedworok C, Rock K, Kretschmer I, Freudenberger T, N Nagy, Szarvas T, et al. (2013) papel inhibidor de la Pequeña ricos en leucina proteoglicanos El Biglycan en el cáncer de vejiga. PLoS ONE 8 (11): e80084. doi: 10.1371 /journal.pone.0080084
Editor: Nikos K Karamanos, Universidad de Patras, Grecia
Recibido: 2 de mayo de 2013; Aceptado: 9 Octubre 2013; Publicado: 6 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Niedworok et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue financiado en parte por el Ifores Programm de la Clínica Universitaria de Essen (D107-10800; http://www.uni-due.de/med/forschung/forschungsfoerderung/ifores.shtml) y por la Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG (FI 682 /4-1; http://gepris.dfg.de/gepris/OCTOPUS/;jsessionid=E43949FD6A49E805D72DE1129F1DB078?context=person&displayMode=print&findButton=Finden&id=1433803&keywords_criterion=Jens+Fischer&module=gepris&nurProjekteMitAB=false&task=showDetail). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
urotelial cáncer de vejiga es el noveno cáncer maligno humano más común con la creciente incidencia y prevalencia [1]. carcinoma invasivo de vejiga no músculo se trata mediante la resección transuretral de la instilación y la terapia adyuvante en caso de enfermedad de alto grado o en los casos con múltiples tumores, se repiten con frecuencia. La enfermedad invasiva no muscular de bajo grado puede progresar a cáncer de vejiga invasivo muscular alto riesgo. El tratamiento de elección para el cáncer de vejiga invasivo muscular es cistectomía radical [2,3], que todavía proporciona sólo un bajo (~ 50%) supervivencia a 5 años. la causa principal de esta devastadora supervivencia está ocurriendo con frecuencia la progresión metastásica en estos pacientes [6,7]. el cisplatino en combinación con gemcitabina representa la opción de tratamiento adyuvante de primera línea para los pacientes con vejiga localmente avanzado o metastásico cáncer. Nuevas estrategias quimioterapéuticos, que implican inhibidores de la tirosina quinasa del receptor, están actualmente investigados en modelos preclínicos y estudios clínicos en [4,5]. Por lo tanto, a pesar de las opciones de tratamiento quirúrgico y quimioterapéuticos de la gravedad de la enfermedad y los pobres Urge pronóstico para el descubrimiento de nuevos marcadores para la progresión de la enfermedad, así como nuevos conocimientos sobre la fisiopatología de la progresión del cáncer de vejiga.
Para este fin, el objetivo fue investigar los cambios específicos en el micromilieu extracelular tal como se define por la matriz extracelular (ECM) que están asociados con la progresión de cáncer de vejiga y si una actividad biológica específica podría atribuirse a moléculas candidatas . ECM se sabe que afecta tanto, las células tumorales y del estroma con respecto a sus características fenotípicas que son relevantes para la progresión del cáncer, tales como la invasión, proliferación y apoptosis. Además, la composición de la micromilieu ECM es probablemente parte de la comunicación intercelular entre las células tumorales y el estroma. Proteoglicanos, componentes clave de la ECM, son cada vez más relevantes para la biología del cáncer debido a una gran cantidad de funciones que son críticos para las interacciones tumor-estroma [8]. Los proteoglicanos se componen de una proteína núcleo y una cadena de glicosaminoglicano que está sujeta a modificaciones postraduccionales. Ambas proteínas del núcleo y cadenas de glicosaminoglicanos contribuyen a la función de los proteoglicanos en la ECM. proteoglicanos pequeños ricos en leucina (SLRP) son una familia de proteoglicanos extracelulares que se caracterizan por repeticiones ricas en leucina en la proteína núcleo. Los SLRPs se secretan en el espacio extracelular, donde interactúan con otras proteínas incluyendo factores de crecimiento, citoquinas [9-11] y los receptores de transmembrana [12]. Biglicano (BGN) es un miembro de SLRPs que interactúa con receptores transmembrana del tipo P2X7 purinérgicos y con el receptor de tipo Toll (TLR) 2 y TLR4 [13,14]. Los primeros están involucrados en la activación de la inflamasoma, mientras que la última activación causa del sistema inmune innato. Estas acciones atribuyen propiedades moduladoras inmunitarias a BGN que podrían ser de interés para ambos, la carcinogénesis y la progresión del tumor, así como para la metástasis. Además, BGN se ha demostrado que contribuyen a la formación de la red de colágeno y la estabilidad, a la fibrilogénesis fibronectina, a fibroblastos diferenciación y se propone contribuir a las respuestas angiogénicas [15-18]. En resumen, BGN probable modula la biología del tumor efectuando importantes mecanismos de control, tales como las respuestas inmunes, el montaje de matriz y modulación de la actividad del factor de crecimiento. Esto probablemente se consigue por tanto, la señalización celular directa evocada por BGN así como por la configuración del microambiente a través de sus efectos sobre la formación de la matriz de colágeno y fibronectina.
En línea con el hecho de que BGN exhibe tanto, inhibidor y la promoción de efectos sobre las células tumorales, los roles polémicos se han descrito para BGN en varios tipos de cáncer. Por ejemplo, en el cáncer gástrico y colorrectal, así como en el adenocarcinoma de páncreas, se encontró expresión BGN que se correlaciona con mal pronóstico [19-21]. Por otra parte, se observó la sobreexpresión de BGN en el cáncer de páncreas humano y se encontró que inhiben el crecimiento de células de cáncer pancreático
in vitro
[22]. Por otra parte, BGN baja regulación se asoció con HER-2 /neu mediada por la transformación oncogénica que fue fuertemente asociada con el fenotipo maligno de estas células [23]. Por lo tanto, el papel de BGN en la progresión tumoral probablemente depende del tipo de tumor, el estadio y la diferenciación. En consecuencia, estas preguntas tienen que ser tratados específicamente en las distintas entidades tumorales. Además, la capacidad de respuesta de BGN a las intervenciones terapéuticas no se ha investigado todavía. Objetivo de este estudio fue evaluar por primera vez la expresión y función de BGN en pacientes con cáncer de vejiga.
Materiales y Métodos
Las muestras tumorales
La expresión de genes se realizado en muestras de tejido congelado de 76 pacientes (19x PTA, 15x pT1, 14x pT2, pT3 14x y 14x pT4), que fueron sometidos a tratamiento quirúrgico debido a un cáncer urotelial de vejiga en el hospital Universitario de Essen entre 1990 y 2004. Todas las muestras de tejido congelado eran cortadas y teñidas con H & amp; e para verificar su contenido tumoral. Sólo las muestras que contienen células tumorales ≥ 70% fueron sometidos para su posterior análisis. Además, 20 casos de carcinomas de vejiga incluidas en parafina (4x pTa - pT4) se evaluaron mediante inmunohistoquímica. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito y el Comité de Ética del Hospital aprobó el protocolo de estudio. El criterio de valoración principal de este estudio fue la supervivencia al cáncer fi co-específica (con exclusión de todas las otras causas de muerte). La causa de muerte se obtuvo de certi fi cados de la muerte. Los sujetos fueron seguidos desde la línea base (fecha de la cirugía) encuesta hasta julio de 2009. tejido de la vejiga normal se tomó de los pacientes que sufren de enfermedades no malignas (estenosis pieloureteral, vejiga neurogénica) y sirvió como control para el análisis de la expresión génica.
la inmunohistoquímica
la inmunohistoquímica se realizó en base a los protocolos proporcionados por el fabricante. Para BGN inmunotinción, las secciones fueron pretratadas con condroitinasa ABC para exponer los epítopos de la proteína del núcleo BGN como se describe anteriormente [24]. En pocas palabras, la digestión con chrondroitinase ABC se llevó a cabo mediante el tratamiento de los portaobjetos con condroitinasa ABC antes de la incubación con el anticuerpo primario a 37 ° C durante 1 hora. Muestras de tejido fueron incubadas durante 16 horas a 4 ° C con conejo anti-BGN-IgG (1: 250 amablemente proporcionados por Larry Fisher, Instituto Nacional de Investigación Dental, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, EE.UU.). Secciones con omisión del anticuerpo primario sirven como controles negativos. La detección se realizó utilizando 3,3 'diaminobencidina (DAB). Las imágenes fueron capturadas utilizando una Leica
® sistema DM2000 y áreas representativas de todos los portaobjetos teñidos fueron documentados. Además se determinó el porcentaje de células Ki67 positivas como marcador de células en proliferación en los tumores de xenoinjertos (conejo anti-IgG Ki67, 01:25, Novus Biologicals, Ltd., Cambridge, UK). Se determinó la densidad media de los microvasos (MVD) como se ha descrito antes [25]. En pocas palabras, un mínimo de dos secciones de tejido separadas (10 mM) de 6 ratones de cada grupo fueron teñidas utilizando anticuerpo policlonal de conejo primaria CD31 (1:50, Abcam®, Cambridge, Reino Unido,) y el anticuerpo anti conejo de cabra Alexa Fluor 568 secundario (1 : 200, Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.). Imágenes de toda la zona fueron tomadas con un microscopio Zeiss Observador Z1 con el objetivo de 10x. Posteriormente, tres áreas altamente vascularizados de 0,49 mm
2 fueron elegidos para contar los vasos. Cualquier grupo de células endoteliales CD31-positivo separado y distinto de los vasos adyacentes se definió como microvasos. Los valores resultantes se promediaron para cada ratón.
Análisis de la intensidad de la tinción se realizó utilizando el software ImageJ 1.46 (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland, EE.UU.) como se describe anteriormente [26].
transcripción inversa cuantitativa en tiempo real PCR (RT -qPCR)
El ARN total fue aislado de muestras de tumores de flash-congelados utilizando kits de ARN total RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania). concentración de ARN y la pureza se evaluó por medición fotométrica a 260/280 nm. 1 RNA g se utilizó para la síntesis de ADNc usando el QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). Las reacciones de PCR se realizaron con el Platinum® SYBR® verde qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) en el sistema de PCR 7300 en tiempo real (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). El gen GAPDH se utilizó para normalizar la expresión de genes objetivo. niveles relativos de expresión se calcularon utilizando el método 2
-ΔΔCq. Se utilizaron las siguientes secuencias de cebadores:. BGN humana, CTCCTCCAGGTGGTCTATCT avance, retroceso GGTTGTTGAAGAGGCTGATG y GAPDH humano, GTGAAGGTCGGAGTCAACG avance, retroceso TGAGGTCAATGAAGGGGTC
Cultivo de células
J82 células fueron cultivadas en medio RPMI con 10% del feto de suero bovino. Inhibidores de la tirosina quinasa del receptor sorafenib y sunitinib se utilizaron como solución en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de 10 mM (sorafenib) y 1 M (sunitinib) y DMSO se usó como control. Las células se sembraron a una densidad de 1x10
5 células por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos (Sigma-Aldrich
®, Hamburgo, Alemania) resultante en el 60-70% de confluencia de los cultivos en el día siguiente. Posteriormente, las células se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS, Gibco
®) y se cultivaron en medio libre de suero durante 6 horas. El medio después se retiró y se añadió medio que contiene suero 10% y el respectivo inhibidor de la tirosina quinasa del receptor. 12, 24 y 48 horas después de la estimulación se recogió el sobrenadante y se utilizó para inmunotransferencia, mientras que las células se recogieron para el análisis de ARNm como se describe antes [27]. se añadió al cultivo en 0,01-1 g /ml (0,26 - 26 de nM); purificada BGN (D Systems GmbH, Wiesbaden, Alemania BGN humana recombinante, R & amp). la síntesis de ADN se analizó utilizando [
3H] -timidina ensayo como se ha descrito antes [28]. experimentos adicionales para determinar el efecto de BGN sobre la proliferación de células tumorales se realizaron después de la siembra de las células a 10.000 células /3,9 cm
2 plusminus BGN recombinante en suero de ternera fetal al 2% como se especifica anteriormente. Después se determinó el número de células de 7 días utilizando un FACS y fluoroesferas Flow-Count (Beckman Coulter, Krefeld, Alemania) como estándar interno. Se realizaron tres experimentos independientes, cada uno de ellos con seis repeticiones.
inmunotransferencia
Se cultivaron las células y los sobrenadantes se recogieron a medio día 7 después de la transducción lentiviral (véase más adelante). aislamiento BGN y detección por Western blot se realizó como se ha descrito anteriormente [29] utilizando el anticuerpo policlonal de conejo BGN LF159 (1: 500, proporcionado amablemente por Larry Fisher, Instituto Nacional de Investigación Dental, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, EE.UU.) o anti-BGN (1: 1000, Santa Cruz, Heidelberg, Alemania). ß-tubulina se detectó utilizando el anticuerpo ab11323-β-tubulina anti-ratón (1: 5000, Abcam®, Cambridge, UK). La cuantificación se realizó mediante anticuerpos secundarios fluorescentes y el Sistema Odyssey Infrared Imaging (LI-COR Biosciences, Lincoln, EE.UU.). ABC condroitinasa (0,4 U /muestra, Sigma-Aldrich®, Hamburgo, Alemania) se utilizó para eliminar GAG cadenas como se indica. Medio derivado de las células musculares lisas coronarias humanas (PromoCell, Heidelberg, Alemania) se utilizó como control positivo para inmunotransferencias BGN.
transducción Lentiviral
J82 células fueron cultivadas a 60-70% de confluencia. Para knock-down BGN en células de cáncer de vejiga J82 humanos, ARN corto horquilla (shRNA) secuencia dirigida BGN (adelante: 5'CCGGGAACATGAACTGCATCGAGATCTCGATGCAGTTCATGTTCTTTTTTG-3 ') se utilizó en el vector pLKO.1 (Sigma-Aldrich®, Hamburgo, Alemania). Revueltos shRNA se utilizó para el grupo de control. Lentiviral sobreexpresión BGN se llevó a cabo como se describe anteriormente [16]. La producción de vectores, se realizó cultivo de células de riñón embrionario humano (HEK-293T), la cosecha de partículas recombinantes y transducción lentiviral de células de cáncer urotelial J82 humanos como se ha descrito antes para la sobreexpresión lentiviral y derribo de genes de la matriz [16,26]. la sobreexpresión de proteoglicanos BGN se realizó usando el ADNc completo de biglicano como se indica antes [16]. Para
células J82 experimentos in vivo se transdujeron a una multiplicidad de infección de 01:10 para Knock-down. Las células fueron cosechadas en el día 7 después de la transducción lentiviral y BGN knock-down o sobreexpresión se verificó mediante RT-qPCR antes de los ensayos funcionales adicionales.
modelo de xenoinjerto
Male NMRI nu /nu ratones desnudos fueron utilizados para los xenoinjertos de células tumorales J82 humanos y análisis del crecimiento del tumor de xenoinjerto. Cada grupo constaba de 6 animales. Las células (1x10
6 células tumorales suspendidas en 100 l de PBS) se inyectaron bilateralmente en los flancos de cada animal. Posteriormente, los animales se controlaron durante 7 semanas. Medición del tamaño del tumor se realizó dos veces por semana. Los animales fueron sacrificados y el tejido tumoral, hígado y pulmón fueron cosechadas. Las secciones congeladas se prepararon a partir de todas las muestras tumorales para las secciones de tinción, pulmón e hígado BGN se prepararon para H & amp; E tinción para buscar metástasis. El centro local de animales, así como la LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, NRW) aprobaron los experimentos con animales y los protocolos para el manejo y seguimiento.
El análisis estadístico
La expresión génica datos fueron analizada ya sea por análisis de varianza y la prueba post hoc de Bonferroni o por
t de Student
según corresponda. Los datos se presentan como medias ± S.E.M. La significación estadística se asigna al nivel de
p Hotel & lt; 0,05. Los datos relativos a los resultados clínicos de los parámetros del paciente se carecía de distribución normal, lo que indica el uso de la no-paramétrica de dos colas prueba de Wilcoxon de suma de rangos (U de Mann-Whitney) para comparaciones de grupos apareados. El análisis de los datos de supervivencia de los pacientes se realizaron utilizando el algoritmo estándar de Kaplan-Meier (PROC LIFETEST, SAS-PC 9.3, SAS-Institute, Cary, EE.UU.). Para la separación óptima de los grupos con respecto a la expresión BGN relativa, se evaluaron los puntos de corte variables y los valores de p de la prueba de log-rank se registraron. separación óptima de dos grupos correspondientes a un valor de p mínimo fue encontrado en un valor de expresión BGN relativa de 0,09. Para el análisis multivariable se utilizaron riesgos proporcionales de Cox modelos de regresión. Todos los análisis estadísticos se calcularon utilizando el software de análisis estadístico IBM SPSS (versión 18.0, Chicago, IL, EE.UU.).
Ética declaración
El protocolo de estudio y el procedimiento de consentimiento fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Duisburg-Essen, Alemania y cada paciente presentó un consentimiento informado por escrito. El número de proyecto era 07-3537 para el almacenamiento de material tumoral congelado y con parafina fresca y los datos clínicos relevantes.
Los experimentos se realizaron en ratones de acuerdo con las reglas y normas de la LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, NRW) y el Servicio de Animales local de la Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf. El LANUV aprobó los experimentos y confirmó el cumplimiento de normas de calidad. El proyecto se identifica por el número 87-51.04.2010.A149.
Resultados
expresión BGN mRNA en el cáncer de vejiga humana
En primer lugar, las muestras de 76 pacientes con diferentes estadios del cáncer de vejiga se analizaron con respecto a la expresión BGN ARNm y se comparan con la expresión en tejido de vejiga sana. Curiosamente, no se detectaron diferencias significativas en los niveles de expresión de ARNm con respecto a la invasividad tumoral (Figura 1A), la clasificación (Figura 1B) y puesta en escena (Figura 1C), lo que sugiere el aumento de BGN mRNA en etapas progresados de cáncer de vejiga. Sin embargo, a pesar de esta asociación positiva con la estadificación del tumor análisis multivariado reveló que el nivel de expresión BGN ARNm (
p = 0,155
) no fue un factor pronóstico independiente. Por el contrario, el estadio tumoral (
p = 0,012
) y el compromiso de los ganglios linfáticos (
p = 0,039
) fueron factores pronósticos independientes para la supervivencia específica del cáncer como se esperaba (Tabla 1). Por otra parte, no hubo correlación entre la expresión y la hora BGN ARNm de aparición de metástasis (
p = 0,862
), progresión de la enfermedad (
p = 0,624
) o recurrencia de la enfermedad (
p
= 0,142). BGN fue mayor en las muestras tumorales de mujeres en comparación con los de los hombres (4,86 veces en comparación con 1,66 veces de control, respectivamente,
p
= 0,003) y en los fumadores en comparación con los de los no fumadores (3,40 veces ; los fumadores 2,01 veces, respectivamente,
p = 0,008
, Tabla 2)
BGN ARNm se investigó en 76 pacientes con cáncer de vejiga por RT-qPCR y se comparó con tejido de la vejiga no maligno. . Se detectó una elevación significativa de la expresión BGN mRNA en el músculo invasivo en comparación con los tumores no invasivos (A) y en alto grado en comparación con los tumores de bajo grado (B). Además, la expresión BGN mRNA correlacionó con el aumento de la etapa del tumor (C). n = 76 pacientes, *
p
. & lt; 0,05, ***
p = 0,0003
supervivencia cáncer específica
variables
HR
95% IC
p
Etapa (músculo invasivo) 1.4881.090-2.0300.012Grade (alto grado) 2.1260.954-4.7400.065Lymphnodes (N +) 2.4001.045-5.5090.039BGN (alto ) 0.9460.876-1.0210.155Table 1. el estadio del tumor y el estado de los ganglios linfáticos son parámetros de pronóstico independiente para la supervivencia específica del cáncer de vejiga.
en un análisis multivariado de regresión proporcional de Cox de supervivencia en peligro de n = 76 pacientes en estadio del tumor y los ganglios linfáticos fueron capaces de predecir la supervivencia específica del cáncer independiente de otros parámetros,
p-valores
& lt; 0,05 se determinaron como significativos. Descargar CSV CSV
expresión génica BGN
P =
valuesΣ 76median (rango) Edad ≤ 65 352,81 (0.06-24.33) 0,847 & gt; 65 n1.95 (0,06-8,28) Sexo Masculino 591,66 (0.06-8.28) 0,003 femenino 174.86 (0,16-24,33) Etapa Ta 191,00 (0.13-4.01) 0,986 T1 151,06 (0.12-4.26) 0,512 T2 141.30 (0,06-5,53) 0,069 T3 143.78 (0,23-12,62) 0,909 T4 145.21 (0,24-24,33) no invasiva 341,03 (0,12-4,26) 0,004 músculo-invasivo 423,37 (0,06-24,33) Grado G1 130.76 (0,12-4,01) 0,919 G2 271,08 (0,13-4,26) 0.002 G3 363,80 (0,06-24,33) de bajo grado (G 1-2) 380,97 (0.12-4.26) 0,001 de alto grado (G3) 373,76 (0,06-24,33) de los ganglios linfáticos N0 /Nx622.05 (0,06-24,33) 0,196 N 143.66 (0,23 a 15,3) Primer 433,01 (0,12-24,33) 0.883Recurrent 331,44 (0,06-8,08) fumar Sí 422,01 (0,06-24,33) 0,008 ninguna 233.40 (0.13-15.28) desconocidos niveles de expresión de ARNm 18Table 2. BGN son elevados en tumores del músculo invasivos, tumores de alto grado, no fumadores y pacientes género femenino.
niveles de expresión génica ARNm de n = 76 pacientes con cáncer de vejiga. Los datos fueron obtenidos a partir de muestras tumorales de flash-congelado. Se utilizó un análisis de regresión de riesgos proporcionales de supervivencia univariante de Cox para el análisis de datos, un
p-valor
& lt; 0,05 fue considerado como significativo. Descargar CSV CSV
BGN expresión de la proteína en los carcinomas de vejiga humanos
BGN tinción en muestras de tumores humanos revela sólo señales débiles en el tejido estromal de Ta no invasivo y tumores T1 (Figura 2A). intensidad de la tinción BGN aumentó en etapas de tumores musculares invasiva (Figura 2B y C). Como era de esperar, la morfología del tumor en etapas superficiales fue similar a la morfología normal de la vejiga con una clara diferenciación entre el tejido tumoral y el tejido estromal. En etapas más altas tumorales (T4), células del estroma y las células tumorales fueron mezclados y ambos tipos de células mostraron asociación con BGN tinción (Figura 2B y C). Sin embargo, debido BGN es un proteoglicano secretado la fuente celular no puede deducirse de la inmunotinción de tejidos. La cuantificación de la fracción de área positiva confirmó el aumento de la intensidad de la tinción de BGN en etapas tumorales musculares invasiva (T2-4) en comparación con no músculo Ta invasiva y etapas T1 (Figura 2D). Además, se detectó una correlación de la fracción de área positiva BGN y la invasividad del tumor (
p
= 0,0025, Figura 2E).
A - C, BGN inmunotinción se realizó en secciones de tejidos embebidos en parafina. (A), Ta; (B), T2; (C), T4. (D), el análisis de imagen cuantitativo de BGN en los tumores no invasivos (Ta, T1) y las etapas de tumores musculares invasiva (T2-T4). (E), la correlación de la fracción de área positiva BGN con la estadificación del tumor. n = 5 biopsias de pacientes de cada etapa del tumor, ***
p Hotel & lt; 0,0001, **
p = 0,0025
Efecto antiproliferativo de BGN en. las células del cáncer de vejiga humana
in vitro
Los resultados de las muestras de cáncer de vejiga humana sugieren que la expresión BGN asocia con la progresión tumoral. Para obtener una visión mecanicista, se investigaron los efectos potenciales de BGN sobre el fenotipo de las células tumorales
in vitro
como se detalla a continuación. En primer lugar, una inmunotransferencia de BGN secretada se realizó a partir de los medios de comunicación de la línea celular de cáncer de vejiga humana, J82 (Figura 3A) acondicionado. Tal como se detecta en la muestra de células J82 sin condroitinasa ABC digestión BGN proteoglicanos fue lanzado en cantidades relativamente pequeñas en el medio. Además, se detectó la proteína del núcleo BGN en estas muestras también. Como control para células que secretan grandes cantidades de BGN proteoglicano, se incluyó la inmunotransferencia de medio condicionado derivado de las células del músculo liso vascular humanos coronarias (dos carriles a la izquierda). La inmunotransferencia reveló además que BGN recombinante utilizada en los experimentos posteriores consistía principalmente en la proteína del núcleo debido a bandas no se desplazaron por la condroitinasa ABC (Figura 3A) y se ejecutan en el tamaño típico de la proteína del núcleo. A continuación, se utilizó proteína recombinante núcleo biglicano en un ensayo de proliferación (Figura 3B). La adición de 0,26 a 26 nM BGN núcleo (0,01 a 1 mg /ml) produjo una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación celular en las células J82 (Figura 3B). Por último, para establecer las bases para un
in vivo de xenoinjertos
experimento y para desentrañar el papel de BGN endógena, lentiviral derribo de BGN se realizó en la línea celular de cáncer de vejiga humana, J82. Es importante destacar que, knock-down de BGN causó aumento de la proliferación (shBGN 1,39 ± 0,06 veces mayor de control,
p Hotel & lt; 0,05) que fue revertido por la adición (2,6 nM) de BGN exógena (0,83 veces mayor de ± de control 0,06) (Figura 3C). La adición de BGN exógeno a las células transducidas con shRNA revueltos causó una tendencia a disminución de la proliferación. A continuación, se determinó la proliferación después de la sobreexpresión de BGN humano. Gratuito al efecto pro-proliferativa después de BGN knock-down, BGN sobreexpresión resultó en una reducción significativa de la síntesis de ADN en comparación con el control de vector vacío (oeBGN, 0,50 ± 0,06 veces de control; PCL-1, 1,0 ± 0,09 veces de el control, la figura 3C).
(A) La inmunotransferencia de BGN purificó a partir de medio condicionado de células de carcinoma de vejiga J82 humanos y de BGN plusminus condroitinasa ABC recombinante digestión. Como medio de control condicionado de células humanas de músculo liso vascular coronario (CaSMC) se utilizó debido a que estas células son conocidos para secretar grandes cantidades de proteoglicanos BGN (a la izquierda dos carriles). Condroitinasa ABC se aplicó como un control adicional (carril derecho) (B) células J82 se incubaron en bajo suero (2%) con cantidades crecientes de número BGN y células recombinantes se determinó mediante análisis FACS después de 7 días; n = 3. representativos se muestran imágenes microscópicas de luz. células (C) J82 humano fueron transducidas ya sea lentivirally de knock-down expresión BGN o BGN sobreexpresan humano. Los respectivos controles eran células transducidas con shRNA revueltos (SCR) o el control de vector vacío (PCL-1). Además, se utilizó BGN recombinante. Nueve días después de la transducción, se determinó la proliferación como se evidencia por la síntesis de ADN. El BGN knock-down tuvo un efecto proliferativo que fue revertida por adición de BGN recombinante (2,6 nM = 100 ng /ml). La sobreexpresión de BGN resultó en la síntesis de ADN reducida; n = 5, *
p Hotel & lt; 0,05.
knock-down de BGN acelera el crecimiento J82 xenoinjerto en ratones desnudos
J82 células transducidas con shRNA orientación BGN y revuelto ARNhc se xenotransplantes en ratones nu /nu nude para investigar el efecto de BGN descenso de regulación del
in vivo
. Medición del volumen del tumor de xenoinjerto reveló elevación significativa del crecimiento del tumor en el grupo de knock-down BGN comparación con el grupo de control tratado con revueltos shRNA 49 días después de la inyección de las células (día 49, shBGN 374.7mm
2 ± 82,8 mm
2, revueltos shRNA 204,2 mm
2 ± 28,5 mm
2, n = 6,
p Hotel & lt; 0,001, Figura 4). Los tumores eran de apariencia firme, sin signos de necrosis y sólo uno de los tumores en el grupo shBGN estaba infiltrando el tejido circundante (en este caso las costillas inferiores). Ninguno de los tumores en el grupo de control se infiltran el tejido circundante. No hubo crecimiento visible metastásica de las células tumorales en el pulmón y el hígado como se juzga por la histología. análisis inmunohistoquímico Siguiente mostró que BGN tinción todavía se redujo en el grupo de knock-down BGN (BGN fracción de área positiva en el grupo shBGN 10,82 ± 2,3% y 25,25 ± 2,4% en el grupo control shRNA revueltos) después de 7 semanas (Figura 5 A-C). Es importante destacar que, en línea con el
in vitro
datos que se muestran en la Figura 3, se aumentó la proliferación de las células tumorales después de BGN knock-down como se evidencia por la tinción de Ki67 en comparación con el control (Ki67 fracción de área positiva en el grupo shBGN 16,68 ± 2,1 % y 7,18 ± 1,2% en el grupo control shRNA revueltos,
p = 0,005
, figura 5D-F). vascularización tumoral no se vio afectada como se evidencia por la tinción de CD31 (Figura 5G-I).
Después de derribo de BGN en las células J82 humanos
en
in vitro
las células transducidas se inyectaron bilateralmente en los flancos de ratones crecimiento y tumor nude se controló durante un período de 7 semanas. Como resultado, el volumen de los tumores fue significativamente mayor después de la aplicación de las células J82 transducidas con orientación shRNA BGN en comparación con control mezclado (375 mm
2 frente a 204 mm
2); n = 6, ***
p Hotel & lt; 0,001.
Los xenoinjertos de tumores se recogieron después de 7 semanas y se procesaron para inmunotinción y el análisis morfológico. BGN inmunotinción y análisis de imágenes revelado disminución de la expresión BGN comparación con el control revuelto (A, B). La fracción de área de la tinción BGN positivo fue 25,3% en los controles frente a 10,8% en los tumores de xenoinjertos derivados de las células shBGN, n = 6, **
p
= 0,0087 (C). A continuación, el índice de proliferación se evaluó mediante el antígeno Ki67. En comparación con el control (D) el porcentaje de la fracción de área de las células Ki67 positivas fue significativamente elevado en los tumores formados por células J82 shBGN transducidas (E, F; 7,2% vs 16,7%, n = 6, **
p
= 0,005). (GI) La densidad media de los microvasos (MVD) como se determina por inmunotinción CD31 no se vio afectada en los xenoinjertos de tumores, n = 6.
inhibidores Multi-tirosina quinasa receptora inducen BGN
El
in vivo
y
in vitro
datos descritos anteriormente sugiere fuertemente que BGN es un inhibidor del crecimiento de células de cáncer de vejiga humana. Hasta la fecha no se han descrito moduladores terapéuticos de expresión BGN en el cáncer. Por lo tanto, se investigó el efecto de los inhibidores de tirosina quinasa del receptor de moléculas pequeñas sobre la expresión BGN. Para ello, los inhibidores de tirosina quinasa de varios receptores, sorafenib y sunitinib, se utilizaron en concentraciones que se sabe que inhiben la proliferación de células de cáncer incluyendo el cáncer de vejiga (J82) células [30-32]. La morfología celular no se vio afectada dentro de las 24 horas de tratamiento con sorafenib y sunitinib. Es de destacar que el tratamiento con sorafenib (10 mM) y sunitinib (1 mM) dio lugar a una fuerte regulación de la expresión BGN ARNm después de 24 horas (Figura 6A).