Extracto
STAT6 factor de transcripción se ha convertido en una molécula potencial para la intervención terapéutica, ya que regula amplia variedad de procesos celulares en una gran variedad de tipos de células. Aunque algunos genes diana y socios que interactúan de STAT6 se han identificado, su mecanismo exacto de acción necesita ser aclarada. En este estudio, hemos tratado de caracterizar mejor las interacciones moleculares, redes y funciones de STAT6 mediante el perfilado de la expresión del ARNm del STAT6 silenciados células pulmonares humanas (NCI-H460) utilizando microarrays. Nuestro análisis reveló 273 genes expresados diferencialmente después de STAT6 silenciamiento. El análisis de los datos de expresión génica con el software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) reveló
La expresión génica, la muerte celular, el metabolismo de los lípidos
como las funciones asociadas con la red de mayor audiencia.
biosíntesis de colesterol era Estar entre las vías más enriquecidos en IPA, así como en el análisis PANTHER. Estos resultados se han validado por el ensayo de PCR y el colesterol en tiempo real utilizando revueltos siRNA como un control negativo. Hallazgos similares se observaron también con el tipo II humanas células epiteliales alveolares pulmonares, A549. En el presente estudio que tenemos, por primera vez, se muestra la relación inversa de STAT6 con la biosíntesis del colesterol en células de cáncer de pulmón. Los presentes hallazgos son potencialmente significativos para avanzar en la comprensión y el diseño de productos terapéuticos para las condiciones patológicas en las que tanto el STAT6 y la biosíntesis de colesterol están implicados a saber. asma, aterosclerosis, etc.
Visto: Dubey R, R Chhabra, Saini N (2011) pequeños ARN de interferencia contra el factor de transcripción STAT6 provoca un aumento de la síntesis de colesterol en líneas celulares de cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (12): e28509. doi: 10.1371 /journal.pone.0028509
Editor: Sunil K. Ahuja, Sistema de Cuidado de la Salud de los Veteranos del Sur de Texas, Estados Unidos de América
Recibido: June 9, 2011; Aceptado: 9 de noviembre de 2011; Publicado: 5 de diciembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Dubey et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores reconocer el Departamento de Biotecnología (DBT) para financiar el proyecto titulado "Estudio del factor de transcripción STAT6 en la regulación de la apoptosis utilizando RNAi Tecnología '(GAP0047). RD fue apoyado financieramente por DBT GAP0047 proyecto. RC fue apoyado con CSIR-Senior Research Fellowship (Consejo de Investigación Científica e Industrial). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
STAT6 es uno de los siete miembros de la familia de factores de transcripción que participan en la regulación de la expresión génica cuando las células se encuentran con diversos polipéptidos extracelulares como citoquinas, hormonas y factores de crecimiento y regulan una amplia variedad de procesos celulares incluyendo la proliferación , la diferenciación y la apoptosis [1], [2], [3], [4]. En general, existen proteínas STAT no fosforilados como formas latentes en el citoplasma. La exposición de citoquinas conduce a STAT fosforilación por quinasas Janus y una vez fosforila la dimerización de proteínas STAT individuales se produce a través de sus dominios SH2 seguido por la migración del dímero de STAT funcional al núcleo donde puede unirse al ADN y directamente activar la transcripción de citoquinas genes de respuesta [5] , [6]. Al igual que los otros miembros de la familia STAT, STAT6 desempeña un doble papel de transductor de señal y activador de la transcripción por cualquiera de la expresión de genes de regulación directa o mediante la interacción con una amplia variedad de otros factores de transcripción [7].
IL -4 y la señalización STAT6 inducida por IL-13 se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la diferenciación de las células Th2, células B inducida por la expresión de IgG e IgE y la pantalla de la superficie celular de MHC de clase II y CD23 [8], [9] , [10], [11]. Aunque STAT6 se conoce principalmente para ser asociado con la inflamación alérgica y asma, STAT6 desregulación también ha sido implicado en varias otras enfermedades. STAT6 juega un papel clave en la hepatitis de células T a través de la mejora de la expresión de las eotaxinas en los hepatocitos y las células endoteliales, e induce la expresión de IL-5, la infiltración de eosinófilos y neutrófilos en el hígado y que conduce a hepatitis [12]. También hay evidencias de que la activación inducida por IL-4 de STAT6 se asocia con una reducción de la expresión hepática de TNF así como la atenuación del reclutamiento de neutrófilos hígado y puede proteger contra la isquemia hepática /lesión de reperfusión [13]. STAT6 También se ha demostrado estar implicado en mechanosensation ciliar en las células epiteliales de riñón [14]. Recientemente, los polimorfismos del gen IL-4 y STAT6 también han sido encontrados asociados con el desarrollo del lupus eritematoso sistémico en pacientes chinos [15]. Shum
et al
en 2006 proporcionó una relación entre la inflamación alérgica y metabolismo de ácidos grasos en los que han demostrado que un gen de IL-4 /STAT6 regulado aP2, que desempeña un papel importante en el metabolismo de los lípidos, que se requiere en Th2 mediada la inflamación alérgica de las vías respiratorias [16], y recientemente STAT6 se ha encontrado que desempeñan un papel en la regulación de la homeostasis de lípidos en el hígado como se observó aumento de la deposición de lípidos en ratones STAT6 knockout [17]. Además de las consideraciones anteriores, Zhang
et al
en 2006 informó que el silenciamiento STAT6 inhibe la proliferación e induce la apoptosis en el cáncer de colon HT-29 células [4]. En otro estudio, Das
et al
en 2007 encontró que el STAT6 es un factor de supervivencia se expresa constitutivamente en el cáncer de próstata humana [18]. Este efecto de STAT6 se fortaleció aún más en un estudio realizado por Cui
et al
en 2007, donde han demostrado que el STAT6 fosforilada transcripcionalmente hasta regula la expresión de COX-2 y protege contra la apoptosis en NSCLC (cáncer no microcítico de pulmón de células células) [19].
a pesar de que unos pocos genes diana y algunos socios que interactúan de STAT6 se han conocido hasta la fecha, los mecanismos precisos de la señalización mediada por STAT6 es en gran parte desconocida. En vista de esto, hemos tratado de estudiar el efecto de silenciamiento STAT6 en el genoma de ancho patrones de expresión génica en células NCI-H460 (cáncer epitelial de pulmón). Los resultados obtenidos después de siRNA mediada por silenciamiento de STAT6 en células NCI-H460 también fueron validados en células A549.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y transfección siRNA
Carcinoma de Pulmón ( se obtuvieron células NCI-H460 y A549) del Centro Nacional para la Ciencia de la célula, Pune, India y mantuvieron en RPMI 1640-media /DMEM, que contiene 10% de suero fetal bovino y antibióticos (100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en el aire.
para la transfección en placas de 12 pocillos, 1,2 × 10
5 células fueron sembradas por pocillo y se dejaron adherir durante la noche. Los día siguiente las células se transfectaron con 60 nM de ARNsi validado (Ambion, EE.UU.), utilizando 4 l de lipofectamina 2000 (Invitrogen, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Siempre que sea indicado, las células se estimularon con 50 ng /ml IL-4 humana (BD Pharmingen, EE.UU.) recombinante para 4 h. Las células se recogieron después de 24 h de post /48 h /72 h de la transfección y se utilizaron para los experimentos. El untransfected revueltos y se recogieron las células siRNA transfectadas después de 48 h para todos los experimentos a no ser que se indique lo contrario.
La extracción de RNA y PCR en tiempo real
El ARN total se extrajo utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, CA, EE.UU.) y 2 g de ARN se transcribe invertir usando RevertAid ™ H Minus kit de transcriptasa inversa (Fermentas, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. PCR en tiempo real se realizó utilizando SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los resultados se normalizaron con 18S rRNA. Los datos fueron analizados utilizando el método de Pfaffl [20]. Las secuencias de los cebadores utilizados para la RT-PCR se dan en la Tabla S1.
Western Blotting
Las células se trataron con tripsina y los sedimentos celulares se lisaron con tampón RIPA modificado {50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de NP40, 0,25% de desoxicolato de Na, 1 g /ml de aprotinina, 1 mg /ml de leupeptina, 1 mg /ml de pepstatina, 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), orthovandate de sodio 1 mM, y 1 mM fluoruro de sodio} y se mantuvo en hielo durante 30 min. El lisado se centrifugó a 12.000 rpm durante 30 min, el sobrenadante recogido y la estimación de la proteína se realizó utilizando el método BCA. Cantidades iguales de proteína (50 mg) se separaron en 12% dodecil sulfato de sodio - electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se bloqueó con leche desnatada al 3% en solución salina amortiguadora Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) con 0,1% de Tween-20 durante 1 h y después se incubaron con el anticuerpo primario en 1% de leche desnatada durante 2 h seguido de incubación con el anticuerpo secundario apropiado (ALP anti-ratón ligado o ALP /anti-conejo ligada) durante 1 h. Las transferencias fueron desarrolladas utilizando NBT- BCIP como sustrato. La igualdad de carga de proteína se confirmó por el uso de anticuerpos GAPDH. La medición de la intensidad de señal en membranas de PVDF después de la transferencia Western se realizó utilizando AlphaImager 3400 (Alpha InnoTech Corporation, San Leandro, California). Los valores se calculan como IDV los valores de densidad de los valores de densidad de banda /GAPDH de proteínas específicas. Después se calculó el factor de cambio con respecto a las células no transfectadas basada en valores IDV. Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces; Se presentan los resultados representativos.
Illumina Microarray
Genoma amplia efecto de silenciamiento STAT6 se estudió utilizando microarrays Illumina. Dos réplicas biológicas de las células NCI-H460 no transfectadas y las células NCI-H460 transfectadas con 60 nM de STAT6 siRNA (para 48 h) se utilizaron en el experimento de matriz. ARN total fue extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, CA, EE.UU.), se purificó y se concentró utilizando RNeasy Kit de Limpieza MinElute (Qiagen, CA, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. Todas las muestras de ARN se ensayaron para determinar la integridad mediante electroforesis en gel. El Kit de Illumina TotalPrep de amplificación del ARN (Ambion, TX, EE.UU.) se utilizó para generar biotina, ARN amplificado. En resumen, 500 ng de ARN total se transcribió de forma inversa con un cebador oligo (dT) usando la enzima ArrayScript y se amplifica durante la noche con ARN polimerasa de T7 y se marcó con biotina de acuerdo con el protocolo del fabricante. Este ARN amplificado marcado (ARNa) se hibridó con Illumina BeadChips de expresión en todo el genoma (Ref Humanos-6 v.3.0, Illumina, CA, EE.UU.), que representa ~43,000 transcripciones humanos a 58 ° C durante la noche. Las matrices fueron incubadas con Cy3 estreptavidina y se lavaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. El chip fue escaneado utilizando el escáner Illumina (iScan) y el análisis de los datos de microarrays se realizó utilizando el software Illumina BeadStudio 2.0. Los datos normalizada era normal y los genes que cruzaron el umbral de detección de valor de p ≤ 0,05 entre todos el valor de p muestras y la puntuación diferencial ≤ 0,05 entre las muestras de ensayo se considera que los genes expresados diferencialmente. El diagrama de flujo de trabajo de este experimento se da en la figura S1. Los datos obtenidos se ha depositado en el NCBI Gene Expression Omnibus [21] y es accesible a través de número de acceso Gene Expression Omnibus (GEO) Serie GSE25942 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi ? acc = GSE25942)
vía de análisis Ingenuity (IPA)
los conjuntos de datos que representan los genes con expresión alterada perfil derivado del análisis de microarrays se importaron en la herramienta de análisis Ingenuity Pathway (Herramienta IAP;. Ingenuity®Systems , Redwood City, CA, EE.UU.; http://www.ingenuity.com). En IPA, los genes expresados diferencialmente se asignan a las redes genéticas disponibles en la base de datos Ingenio y luego clasificados en orden de puntuación.
La base del programa IPA incluye el ingenio Pathway Knowledge Base (IPKB) que se deriva de las funciones conocidas y las interacciones de los genes publicados en la literatura. Por lo tanto, la herramienta de IPA permite la identificación de las redes biológicas, funciones globales y las vías funcionales de un conjunto de datos en particular. El programa también le da el valor de significación de los genes, los otros genes con los que interactúa, y cómo los productos de los genes directa o indirectamente actúan unos sobre otros, incluyendo aquellos que no participan en el análisis de microarrays. Las redes creadas se clasifican en función del número de genes expresados de manera significativa que contienen y también la lista de enfermedades que eran más significativo. Una red es una representación gráfica de las relaciones moleculares entre moléculas. Las moléculas se representan como nodos, y la relación biológica entre dos nodos se representa como un borde (línea). Todos los bordes son apoyados por al menos 1 referencia de la literatura, a partir de un libro de texto, ni de información canónica almacenada en la base de conocimientos Ingenuity Pathways. La intensidad del color de nodo indica el grado de arriba (rojo) o hacia abajo regulación (verde). Los nodos se muestran con diferentes formas que representan la clase funcional del producto génico.
PANTHER análisis
El PANTHER (análisis de proteínas a través Relaciones Evolutivas) Sistema de Clasificación es un recurso único que clasifica los genes por su funciones, usando evidencia experimental científica publicada y relaciones evolutivas para predecir la función, incluso en ausencia de evidencia experimental directa [22]. Los genes expresados diferencialmente obtenidos después de silenciamiento STAT6 en células NCI-H460 se importaron en PANTHER (http://www.pantherdb.org/), donde se comparó el número de genes en cada vía contra el número de genes a partir de
NCBI Homo sapiens
genoma en esa vía. Se utilizó la prueba binomial para determinar estadísticamente sobrerrepresentación de las categorías de clasificación PANTHER. valores de p & lt Bonferroni corregido; 0,05 se consideraron significativos.
se determinó ensayo de colesterol
El contenido de colesterol en las células utilizando el kit de cuantificación de colesterol (Biovision, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. En resumen, 10
6 células se lisaron y los lípidos fueron extraídos por homogeneización con 200 l de cloroformo: isopropanol: Triton X-100 (7: 11: 0,1). Estos extractos de lípidos se secaron al vacío durante 30 min y los residuos se disolvieron en 200 l de tampón de colesterol de reacción proporcionado con el kit. El colesterol se estimó mediante espectrofotometría a λ = 570 nm en una placa de 96 pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de colesterol se normalizaron a cantidades de proteína celular total.
Análisis Promotor
Para identificar los controles de regulación común entre los genes alterados, genes de la ruta de biosíntesis de colesterol (3-hidroxi-HMGCR- 3-metilglutaril-coenzima a reductasa, HMGCS1- 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima a sintasa 1 y IDI1- Isopentenyl-difosfato delta isomerasa 1) se tomaron para el análisis de promotor. Ensembl [23] fue utilizado para recuperar 5,0 kb regiones aguas arriba de los sitios de inicio de la transcripción de estos genes y el factor de transcripción (s) de unión dentro de esta región se determinó usando excesivamente representados factor de transcripción Encuadernación Predicción del sitio de la herramienta (OTFBS) [24] que detecta exceso de motivos representados de factores de transcripción conocidos para un conjunto de genes.
La movilidad electroforética cambio de ensayo (EMSA)
El ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética se llevó a cabo según lo descrito por Shiraga
et al
. [37]. Los extractos nucleares se prepararon a partir no transfectadas, siRNA-transfectadas (60 nM, 48 h /72 h) y revueltos siRNA transfectadas las células NCI-H460 mediante el uso de NE-PER Nuclear y Kit citoplasmática reactivo de extracción (Pierce) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las secuencias de oligonucleótidos utilizados en la EMSA fueron tomados de un estudio publicado anteriormente [25]. ADN de doble hebra fue generado mediante la mezcla de cantidades equimolares de los oligonucleótidos complementarios en tampón de reasociación (Ambion, CA, EE.UU.). secuencia mutada del factor de transcripción también se utilizó para comprobar la especificidad de la unión del factor de transcripción. Estos recocido ADN de doble cadena se marcaron con [C32-P] -ATP (BRIT, Hyderabad, India), en presencia de T4-polynucleotidekinase (New England Biolabs, MA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los extractos nucleares (18 g) de las células no transfectadas y siRNA transfectadas se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente en presencia de tampón de reacción que contiene 8 mM Tris-KCl (pH 8,0), EDTA 2 mM, DTT 1 mM, 12% de glicerol , 1 mg de BSA y 1 mg de poli (dI-dC). a continuación, se añadió O bien el tipo salvaje o mutado oligonucleótido marcado doble cadena (40.000 cpm) a la mezcla de reacción y se incubaron durante 45 min a temperatura ambiente. A la terminación de la incubación, las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida no reductor 6% y electroforesis en 0,5X TBE. Los geles se secaron después y se sometieron a análisis PhosphorImager (FLA 2000, Fujifilm, Japón). Los análisis densitométricos se realizaron utilizando el AlphaImager 3400 (Alpha INNOTECH Corporation, San Leandro, California). La misma caja del rectángulo del tamaño se ha elaborado en torno a cada banda y la intensidad de cada uno fue analizado por el programa después de la sustracción de la intensidad de fondo.
Anexina-V ensayo
La apoptosis se evaluó mediante la guayaba nexina kit y el sistema de guayaba PCA (Guava Technologies, Hayward, CA, USA). La exposición de la fosfatidilserina (PS) en la superficie celular (asociado con el inicio de la apoptosis) forma la base del ensayo de guayaba nexina. El ensayo de guayaba nexina utiliza dos manchas (anexina V y 7-amino-actinomicina D [7-AAD]). Anexina V-PE se une a PS en la superficie celular de las células apoptóticas y 7-AAD, el colorante impermeant celular es un indicador de la integridad estructural de la membrana. 7-AAD es excluido de las células apoptóticas vivos, sanos y los primeros, pero impregna apoptótica etapa tardía y las células muertas. El ensayo se realizó de acuerdo al protocolo y Anexina-PE fluorescencia del fabricante se analizó con la ayuda de software Cytosoft (Guava Technologies, Hayward, CA, EE.UU.). Un mínimo de 2.000 eventos fueron contados.
Ciclo celular ensayo
Para el análisis de la distribución del ciclo celular, las células fueron fijadas con helado de etanol al 70% y se trató con 1 mg /ml de RNasa durante 30 minutos a 37 ° C. Las células se trataron a continuación con yoduro de colorante de fluorescencia de propidio (50 g /ml, Sigma, EE.UU.) que se unen al ADN por intercalación entre las bases a 4 ° C durante 30 minutos y se analizaron usando citómetro de flujo (Guava Technologies, Hayward, California, EE.UU. ). Un mínimo de 5.000 eventos fueron contados.
Resultados
regulación a la baja STAT6 utilizando STAT6 siRNA
La eficacia de STAT6 de siRNA específico para regular a la baja la expresión STAT6 en células NCI-H460 fue evaluados por PCR en tiempo real para la expresión de ARN y transferencia Western para los niveles de proteína. Como se muestra en la Fig. 1b, los niveles de ARN disminuyeron en 1,20 veces a las 24 horas, 2,12 veces (valor p = 0,046) a las 48 h y por 1,66 veces (valor p = 0,05) a las 72 h en siRNA transfectaron células NCI-H460 en comparación con no transfectadas NCI-H460 Células. No hubo ningún cambio significativo en las células no transfectadas y células revueltos siRNA transfectadas en diferentes puntos temporales. Sin embargo, los niveles de proteína de STAT6 se redujeron de una manera dependiente del tiempo. Como se muestra en la Fig. 1a y 1b, había 1,12 veces disminución a las 24 h, 1,79 veces (valor p = 0,02) disminuir a las 48 h y 2,40 veces (valor p = 0,028) disminución a las 72 h después de la transfección de STAT6 siRNA específico en células NCI-H460 en comparación con las células NCI-H460 no transfectadas en los respectivos puntos de tiempo. A continuación comprobamos la expresión de la proteína fosforilada STAT6 (pSTAT6) que es la forma de señalización activadas de STAT6. En concordancia con los niveles de proteína STAT6, la expresión de los niveles de proteína pSTAT6 también se redujo de una manera dependiente del tiempo. Había 1,13 veces disminución a las 24 h, 1,85 veces (valor p = 0,0008) disminuir a las 48 h y 2,67 veces (valor p = 0,001) disminución a las 72 h después de la transfección de STAT6 siRNA específico en células NCI-H460 cuando se compara con no transfectadas NCI -H460 células en respectivos puntos de tiempo (Fig. 1A y B). No se observaron cambios no significativos en las células transfectadas con siRNA revueltos (control negativo) a diferentes puntos de tiempo.
a) La transferencia Western de STAT6 y la forma fosforilada de la proteína STAT6 (pSTAT6) en extractos celulares de no transfectadas, STAT6 específico siRNA y revueltos siRNA transfectadas las células NCI-H460 en diferentes puntos de tiempo como se indica. b) Gráfico que representa el factor de cambio en el nivel de STAT6 ARNm, la proteína STAT6 y el nivel de proteína pSTAT6 comparación con las células NCI-H460 transfectadas en respectivos puntos de tiempo. siRNA revueltos en diferentes puntos de tiempo se utilizó como control negativo. GAPDH se utilizó como control de carga para el análisis densitométrico de un análisis de transferencia Western. Los niveles de mRNA se normalizaron a la expresión de ARNr 18S en el análisis de PCR en tiempo real. Los datos se expresan como la media ± S.D. de 3 experimentos independientes. * Indica que el valor de p & lt; 0,05 en comparación con células no transfectadas. ** Indica el valor de p & lt; 0,01 en comparación con células no transfectadas. c).
Genoma amplios efectos de silenciamiento STAT6 en la línea celular NCI-H460 utilizando microarrays Illumina
Los perfiles de expresión de genes en células no transfectadas NCI-H460 y células NCI-H460 transfectadas con STAT6 de siRNA se determinaron mediante microarrays Illumina usando dos réplicas biológicas. Illumina gama experimento identificado 273 genes expresados diferencialmente (
187 downregulated y upregulated 86)
. Los datos en bruto se analizó usando el software BeadStudio 2.0. La matriz de datos fue la media normalizada y filtrada por la detección de un valor de p ≤ 0,05 y diferenciado valor de p ≤ 0,05. La lista de genes expresados diferencialmente, junto con sus cambios veces se proporciona en la Tabla S2.
Explicación de las rutas y de las interacciones entre los genes expresados diferencialmente
Para investigar las posibles interacciones biológicas de los genes regulados de manera diferente, los conjuntos de datos que representan a los genes con expresión alterada perfil derivado del análisis de microarrays se importaron en la herramienta de análisis Ingenuity Pathway.
la lista de genes expresados diferencialmente analizados por el IPA reveló 20 redes significativas (Tabla S3). Higo. 2a representa la lista de las 5 cadenas identificadas por el IPA. De estas redes,
La expresión génica, la muerte celular, el metabolismo de los lípidos
fue la cadena más alta puntuación con 28 moléculas de enfoque y la puntuación de importancia 54 (Fig. 2b). La puntuación es la probabilidad de que una colección de genes iguales o mayores que el número en una red se podría lograr por casualidad. Una puntuación de 3 indica una probabilidad 1/1000 que los genes de interés se encuentran en una red no se debe a la casualidad. La lista de genes en esta red con sus respectivos cambios veces en la matriz de datos se proporciona en la Tabla S4.
Para investigar las posibles interacciones de los genes regulados de manera diferente, conjuntos de datos que representan a 273 genes con expresión alterada perfil obtenido de la Illumina microarrays se importaron en la herramienta de análisis Ingenuity Pathway y se ilustra los siguientes datos: a) la lista de los cinco principales redes con sus respectivas puntuaciones obtenidas en IPA b) la mayoría altamente red en el análisis de IPA la representación de red de la red más alta calificación de puntuación ( La expresión génica, la muerte celular, el metabolismo lipídico). Los genes que están sombreadas se determinaron a ser significativo a partir del análisis estadístico. Los genes son upregulated roja sombreadas y las que son de color verde están regulados a la baja. La intensidad del sombreado muestra hasta qué punto cada gen estaba arriba o regulados a la baja. Una línea continua representa una interacción directa entre los dos productos de genes y una línea de puntos significa que hay una interacción indirecta. Los genes marcados con asterisco azul han sido validados por PCR en tiempo real. Los genes asociados con la expresión génica, la muerte celular y el metabolismo lipídico están rodeados con los colores naranja, azul y púrpura, respectivamente. c) Lista vía de Toxicología en el análisis de IPA. El eje x representa las funciones de toxicología superior como se calcula IPA basado en genes expresados diferencialmente están resaltados y el eje y representa la relación del número de genes del conjunto de datos que se asignan a la vía y el número de todos los genes conocidos adscrito a la camino. La línea amarilla representa el umbral del valor de p & lt; 0,05 según lo calculado por el test de Fischer.
El análisis de IPA también grupos de los genes expresados diferencialmente en los mecanismos biológicos que están relacionados con grupos de toxicidad. En la lista de toxicología,
biosíntesis de colesterol y p53 señalización
llegaron a ser los dos mejores vías más significativas con un valor p de 0,011 y 0,013, respectivamente (Fig. 2c). Los genes asociados con la lista tox superior también se dan en la Tabla S5.
Al mismo tiempo, la lista de genes expresados diferencialmente obtenido después de silenciamiento STAT6 en células NCI-H460 se alimentó al recurso web PANTHER para revelar las vías enriquecidos. Curiosamente, en este análisis también encontramos la biosíntesis del colesterol y la señalización de la apoptosis entre las vías enriquecido significativamente. Las vías que pasaron el umbral del valor p & lt; 0,05 en el análisis PANTHER se enumeran en la Tabla 1.
silenciamiento STAT6 aumenta la expresión de genes asociados con la biosíntesis del colesterol /homeostasis y mejora los niveles de colesterol
Dado que la mayor parte de la red superior obtenida en el análisis de IPA fue
la expresión génica, la muerte celular, el metabolismo de los lípidos y la biosíntesis del colesterol
salió enriquecido en tanto el IPA y el análisis PANTHER nos registramos los cambios en los niveles de colesterol después de silenciamiento STAT6 de siRNA en células NCI-H460. Revueltos siRNA se utilizó como control negativo. Higo. 3a muestra que el STAT6 silenciamiento aumentó los niveles de colesterol de una manera dependiente del tiempo, con 1,23 veces mayor a las 24 h, 1,8 veces (valor p = 0,005) aumentar a 48 h y 2,3 veces (valor p = 0,004) aumentar a 72 h después de la transfección de ARNsi en las células NCI-H460. Sin embargo, no se observó ningún cambio en los niveles de colesterol en células NCI-H460 transfectadas con siRNA revueltos. También se obtuvieron resultados similares en células A549 (Fig. 3a). Había 1,28 veces mayor a las 24 h, 1,6 veces mayor (valor de p = 0,03) a las 48 h y 2,2 veces de incremento (valor de p = 0,04) a las 72 h después de la transfección de ARNsi en las células A549, indicando de este modo que el aumento de los niveles de colesterol podría ser un efecto general de STAT6 silenciamiento en células pulmonares
.
Los niveles de colesterol total después de STAT6 desmontables se han consultado a diferentes puntos de tiempo en las células A549 NCI-H460 y. siRNA revueltos se utilizó como control negativo. Los datos se expresan como la media ± S.D. de 3 experimentos independientes realizados por triplicado. * Indica que el valor de p & lt; 0,05 en comparación con células no transfectadas. a) se llevó a cabo análisis de transferencia de Western para analizar el cambio en la expresión de la proteína pSTAT6 tras el tratamiento de IL-4 en células NCI-H460. GAPDH se utilizó como control de carga para el análisis densitométrico. Gráfico representa el cambio veces en la expresión de proteínas en comparación con las células NCI-H460 transfectadas. Los datos se expresan como la media ± S.D. de 3 experimentos independientes. * Indica que el valor de p & lt; 0,05 en comparación con células no transfectadas. b) PCR en tiempo real se realizó para determinar los cambios en el nivel de expresión de genes relacionados con la biosíntesis de colesterol y la homeostasis en las células NCI-H460 y células A549 48h después de la transfección de ARNsi STAT6 específico. Las muestras se normalizaron a la expresión de ARNr 18S. Los datos de tiempo real se expresa como la media ± S.D. de 3 experimentos independientes realizados por triplicado. * Indica que el valor de p & lt; 0,05 en comparación con células no transfectadas. c) ensayo de colesterol se llevó a cabo para determinar el efecto del tratamiento con IL-4 en los niveles de colesterol total en no transfectadas y transfectadas siRNA células NCI-H460 y células A549. Los datos se expresan como la media ± S.D. de 3 experimentos independientes realizados por triplicado. * Indica que el valor de p & lt; 0,05 en comparación con células no transfectadas. d) La transferencia de Western de HMGCS1, HMGCR y IDI1 se realizó en extractos de células no transfectadas y de siRNA transfectadas las células NCI-H460 en diferentes puntos temporales. GAPDH se utilizó como control de carga para el análisis densitométrico. Gráfico representa el cambio veces en la expresión de proteínas en comparación con las células NCI-H460 transfectadas. Los datos se expresan como la media ± S.D. de 3 experimentos independientes. * Indica que el valor de p & lt; 0,05 en comparación con las células no transfectadas.
Dado que la IL-4 se conoce para fosforilar STAT6, hemos querido buscar el papel de la IL-4 en la síntesis de colesterol. En las células NCI-H460, hubo 1,48 veces (valor de p = 0,01) el cambio en el nivel de pSTAT6 (forma fosforilada de STAT6) proteína después de tratamiento con IL-4, 0,48 veces (valor de p = 0,01) el cambio después de la transfección de STAT6 de siRNA y 0,69 veces (valor p = 0,05) el cambio cuando las células transfectadas con siRNA STAT6 fueron tratados con IL-4 (Fig. 3b). En correspondencia con esto, había 0,8 veces (valor de p = 0,05) el cambio en los niveles de colesterol después de tratamiento con IL-4, 1,5 veces (valor de p = 0,01) el cambio después de la transfección de STAT6 de siRNA y 1,32 veces (valor de p = 0,03) el cambio cuando las células transfectadas con siRNA STAT6 fueron tratados con IL-4 (Fig. 3d). Resultados similares se observaron también en la línea celular A549 (Fig. 3d).
A continuación buscó los genes expresados diferencialmente asociados con la biosíntesis del colesterol /homeostasis obtenido a partir de los datos de microarrays. En concordancia con los datos de la matriz Illumina, se confirmaron los niveles de transcripción de estos genes que se upregulated por PCR en tiempo real. Observamos 1,27 veces (valor p = 0,03) aumento en los niveles HMGCR, que es la enzima reguladora clave de la vía de biosíntesis del colesterol. También observamos 1,94 veces (valor de p = 0,03) aumento de HMGCS1, 2,7 veces mayor en IDI1, 4,2 veces (valor de p = 0,04) el aumento de CYP27B1
(citocromo P450, la familia 27, subfamilia B, polipéptido 1)
, y 3,0 veces de incremento en INSIG1
(insulina inducida gen 1)
niveles en 48 h después de la transfección de las células NCI-H460 con STAT6 siRNA específico en comparación con las células NCI-H460 no transfectadas (Fig. 3C).
aumento similar en los niveles de transcripción de estos genes también se observaron en otra línea celular de cáncer de pulmón, A549 (Fig. 3c) donde observamos 1,6 veces (valor de p = 0,03) en los niveles HMGCR, 1,4 veces mayor en HMGCS1, 1,56 veces mayor en IDI1, 2,4 veces mayor en CYP27B1, y 1,25 veces de incremento en los niveles de INSIG1 a 48 h después de la transfección de las células A549 con STAT6 siRNA específico en comparación con las células A549 no transfectadas. Esto implica que los efectos de silenciamiento STAT6 son generales y no se limita a cualquier línea celular de cáncer de pulmón en particular.
Los niveles de proteína de HMGCR, HMGCS1 y IDI1 también se examinaron en no transfectadas y transfectadas siRNA células NCI-H460 a las 48 h y 72 h después de la transfección. Había 2.9, 3.5 (valor de p = 0,048) y 4,3 veces de incremento en los niveles de HMGCS1, 0.94, 1.8 y 2.4 (valor de p = 0,03) veces de aumento en los niveles de HMGCR, 1.6, 2.4 y 2.5 (valor de p = 0,024) aumento de plegar 4b. Como se muestra en la Fig.