Extracto
El aumento de expresión del receptor de la angiotensina II tipo 2 (AT2R) induce la apoptosis en las numerosas líneas de células tumorales, ya sea con la regla II-dependiente o independiente de la angiotensina II-angiotensina, pero su mecanismo molecular sigue siendo poco entendido. En este caso, se utilizó el análisis de matriz de PCR para determinar los perfiles de expresión de genes y microARN en líneas celulares de cáncer de próstata humanas transducidas con adenovirus recombinante AT2R. Nuestros resultados demuestran que AT2R más de expresión conduce a la sobre regulación de 6 genes relacionados con la apoptosis (TRAIL-R2, BAG3, BNIPI, HRK, Gadd45a, TP53BP2), 2 genes de citoquinas (IL6 y IL8) y 1 micro ARN, y la baja regulación de 1 TNFSF10 gen relacionado con la apoptosis y 2 genes de citoquinas (BMP6, BMP-7) en las células DU145 transducidas. HRK fue identificado como un gen en marcha regulada en células PC-3 AT2R transducidas por tiempo real RT-PCR. A continuación, se utilizó siRNAs para silenciar los genes regulados para determinar mejor su papel en la apoptosis mediada por la sobreexpresión AT2R. Los resultados mostraron regulación a la baja de Gadd45a redujo el efecto apoptótico de ~ 30% en las células DU145, regulación a la baja de HRK reduce apoptosis AT2R mediada por más de 50% en las células PC-3, mientras que la regulación por disminución de TRAIL-R2 mejorada AT2R mediada por apoptosis más de 4 veces en células DU145. También se encontró que los efectos sobre la apoptosis mediada por AT2R causados por la regulación a la baja de Gadd45a, TRAIL-R2 y HRK fueron independientes de la activación de p38 MAPK, p44 /42 MAPK y p53. Tomados en conjunto, nuestros resultados demostraron que TRAIL-R2, y Gadd45a HRK pueden ser nuevos genes diana para su posterior estudio del mecanismo de la apoptosis mediada por AT2R en células de cáncer de próstata
Visto:. Pei N, Jie M, Luo J, Wan R, Zhang Y, Chen X, et al. (2014) perfiles de expresión génica asociados con la angiotensina tipo II inducida por receptor 2 apoptosis en células de cáncer de próstata humano. PLoS ONE 9 (3): e92253. doi: 10.1371 /journal.pone.0092253
Editor: Gangjian Qin, Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 6 de diciembre de 2013; Aceptado: 19 Febrero 2014; Publicado: 21 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Pei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China subvención 81072113 (HL), Nacional 863 de alta técnica de Proyectos de Desarrollo de China, de Grant 2012AA02A403 (HL), Laboratorio Estatal de patógenos y Bioseguridad Programa SKLPBS1103 (HL), así como por los premios 2011A091000022, 2010B060500001 , 2011B060300028 y 2011B060300014 al WG por parte del gobierno chino. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer
próstata es la forma más común de cáncer en los hombres de América del Norte y es la segunda causa principal de morbilidad y mortalidad por cáncer en los EE.UU. [1], aunque su pronóstico ha mejorado debido a los avances en las técnicas diagnósticas y quirúrgicas . Hasta la fecha, varios tipos de terapias para pacientes con cáncer refractario a las hormonas se han estudiado, pero ninguna terapia eficaz ha sido reportado. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas estrategias de tratamiento para el cáncer de próstata.
La angiotensina II (Ang II) es el efector clave en el sistema renina-angiotensina. Ang II tiene dos receptores de Ang II: tipo 1 y tipo 2 receptores (AT2R) [2]. AT2R, la segunda isoforma principal receptor, se expresa principalmente en el mesénquima del feto y en una medida limitada en tejidos adultos [3]. Está bien establecido que el aumento de expresión de AT2R induce la apoptosis en varias líneas celulares, tales como feocromocitoma, fibroblastos, células musculares lisas y células endoteliales a través de ya sea la regla II-dependiente o Ang II-independiente Ang [4] - [11]. Nuestros estudios previos revelaron que AT2R sobre la expresión inducida de manera significativa la apoptosis en células de cáncer de próstata [12]. Un estudio reciente indica que la administración intratraqueal de una terapia basada en nanopartículas con el gen AT2R atenúa el crecimiento del cáncer de pulmón, y el efecto es mejor que TRAIL [13]. A pesar del éxito en la delimitación de la función fisiológica, las acciones moleculares y celulares de la apoptosis AT2R-mediata permanecen sin definir. A continuación, se utilizó en tiempo real serie de análisis de PCR para perfilar un gran número de genes y microARN implicados en la apoptosis inducida AT2R en líneas celulares de cáncer de próstata.
En este informe, entre los genes que pueden estar relacionados en la vía de la apoptosis, hay 7 gen relacionado con la apoptosis, 4 y 1 citoquinas expresiones de microARN que se cambiaron en AT2R sobre las células del cáncer de próstata expresado en comparación con el control. AT2R la apoptosis inducida en células DU145 fue mayor cuando TRAIL-R2 fue derribado. Sin embargo, los efectos apoptóticos mediados por AT2R se redujeron en células DU145 cuando Gadd45a fue silenciado. Curiosamente, cuando HRK fue silenciado, la apoptosis inducida por AT2R se redujo en células PC-3. Nuestro estudio también indica que los efectos sobre la apoptosis mediada por AT2R causadas por la baja regulación de TRAIL-R2 y HRK fueron independientes de la activación de p38 MAPK, p44 /42 MAPK y p53. Nuestro estudio debe contribuir a la identificación de factores de detección AT2R implicados en la ruta apoptótica en células de cáncer de próstata, y nos ayudan a entender la apoptosis AT2R impulsada mejor proporcionando los genes diana putativos para estudios posteriores.
Materiales y Métodos
Cell Culture
líneas celulares de cáncer humano de próstata (PC-3 y DU145 células) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). las células PC-3 se cultivaron en medio F-12 y las células DU145 se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% FBS bajo 5,0% de CO
2. Sera y los medios de comunicación se compraron de Invitrogen y la American Type Culture Collection
adenovirus recombinante Construcción y Preparación
vectores adenovirales recombinantes se construyeron, preparados, y se titularon como se describe anteriormente [14]:. Un vector adenoviral que contiene la mayor verde gen de la proteína fluorescente controlado por un promotor de citomegalovirus (Ad-CMV-EGFP) y el ADN de un vector adenoviral que contiene AT2R genómico (G-AT2R) con intrones 1 y 2 y la región de codificación y gen de la proteína verde fluorescente controlado por citomegalovirus promotores (Ad-G-AT2R-EGFP).
Tratamiento de la célula
Para la transducción viral, las células de cáncer de próstata (4 × 10
5) fueron sembradas en seis pocillos de cultivo de tejidos-Corning platos. En el día siguiente, las células fueron transducidas con Ad-G-AT2R-EGFP o el control de vectores de Ad-CMV-EGFP y se observaron cambios en la morfología celular usando un microscopio de fluorescencia Olympus BX41. Se utilizaron células transducidas 24 a 48 h más tarde, dependiendo del protocolo específico
.
Para los estudios de la ARN interferente pequeño (siRNA), DU145 y PC-3 células fueron transfectadas con cualquiera de TRAIL-R2, GADD45A, TP53BP2, HRK o siRNA de control utilizando Lipofectamine reactivo (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Todos los siRNAs fueron adquiridos de Qiagen. Estos tratamientos fueron seguidos de 24 h más tarde por transducción con Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /célula) y, a continuación, 48 horas más tarde, el número de células apoptóticas o genes relacionados con la apoptosis /proteínas se examinaron.
Aislamiento de ARN y en tiempo real RT-PCR
ARN total fue aislado de las células DU145 y PC3 tratadas utilizando RNeasy Mini-Kit (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. ARN aislado se sometió a tratamiento con DNasa I (OMEGA Biotek, Norcross, EE.UU.) para eliminar el ADN genómico. La concentración de ARN se determinó mediante un espectrofotómetro ND-1000 (Nanodrop, Rockland, DE, EE.UU.), y la pureza de ARN se confirmó por 260/280 valor de densidad óptica de 1,8 a 2,0. Las muestras de ARN fueron evaluados para el estado de degradación mediante electroforesis en gel de agarosa. El ARN aislado se convierte en cDNA con (Takara, Dalian, China) regentes oligo dT y la transcriptasa reversa PrimeScript. Fluorescent PCR cuantitativa se realizó con la condición de termo-ciclo: 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 5 segundos a 95 ° C y 34s a 60 ° C. Las muestras se analizaron con el sistema de PCR en tiempo real ABI 7500 (Applied Biosystems) y se sometieron a △△ comparativo método C
T mediante el uso de GAPDH humano como patrón interno. En tiempo real productos de PCR (8 mu l) se cargaron en gel de agarosa al 2,5% que contenía bromuro de etidio.
apoptótica de Gene Análisis de Expresión Utilizando Real-Time PCR matriz
Síntesis de la primera línea de cDNA se realizó con RT
2 kit de primera cadena (C-03) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante (SABiosciences, Frederick, MD, EE.UU.) .El muestras de cDNA se investigan luego respecto a la expresión de 84 genes clave implicados en la apoptosis medio de la apoptosis humano RT
2 Profiler matriz de PCR (HAP-012A; Superarray, Frederick, MD, EE.UU.) en un 7500 sistema de PCR en tiempo real ABI (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.), de acuerdo con el fabricante de protocolos. Para obtener datos estadísticamente, se analizaron muestras de control y experimentales en cada uno de los dos intervalos de tiempo, por triplicado. Las expresiones de los genes diana se midieron con respecto a la media del ciclo umbral (C
T) valores de cinco genes diferentes (calibrador B2M, GAPDH, HPRT1, Rpl13a y ACTB). Los resultados se expresaron como las veces el cambio relativo de la expresión de genes en el grupo realizado AT2R comparación con el grupo control. Los genes con los cambios veces en relación mayor que ± 2 fueron considerados como la altura o hacia abajo-regulada en la expresión. 0,05 se consideraron para mostrar significación estadística para el estudio
Análisis de citoquinas humanas Utilizando Real-Time PCR y la matriz en tiempo real RT-PCR
El; genes que arrojó un valor de p & lt. cDNA muestras también fueron seleccionados para la expresión de 84 citoquinas centrado de la vía, y por medio de RT
2 Profiler PCR matriz humana citoquinas Común (HAP-021A; Superarray, Frederick, MD, EE.UU.) en un tiempo real ABI 7500 PCR sistema (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.), de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los experimentos se realizaron una vez entre las células transducidas-AT2R-Ad G-EGFP y células-EGFP-inducida Ad-CMV para detectar citoquinas en general.
Real-time RT-PCR se utilizó para validar el perfil de expresión. Los genes fueron seleccionados en base a sus posibles funciones fisiológicas y del grado en el que fueron regulados por la sobreexpresión de AT2R. Los cebadores de oligonucleótidos y sondas Taqman específicas para Bcl-2, IL6 y IL8 se obtuvieron de Applied Biosystems. Aislamiento de RNA total se realizó como se ha descrito anteriormente. RNA purificado (25 ng) se utilizó para hacer RT-PCR en un sistema de detección de Applied Biosystems Prism 7000 de secuencia, con el uso de un solo paso RT-PCR Master Mix reactivos. La expresión del gen de mantenimiento GAPDH se utilizó para normalizar la expresión de ARNm. La cuantificación y el análisis de la expresión génica se determinó utilizando el ciclo umbral comparativo método (C
T) como se describe en Applied Biosystems User Bulletin#2. Los cebadores usados para detectar los niveles de otras citoquinas se muestran en la Tabla 1 y PCR en tiempo real se realizó utilizando SYBR Premezcla Ex Taq (Takara) regentes como se describe anteriormente.
Análisis microARN humano Utilizando Real-Time matriz PCR y en tiempo real RT-PCR
Para cuantificar la expresión de los genes miARN, el ARN total fue extraído de células-G-AT2R-EGFP transducidas con Ad e inducida por Ad-CMV-EGFP con RNeasy Mini Kit (Invitrogen ). El RNA total aislado se transcribe de forma inversa usando el kit OneStep PrimeScript miRNA cDNA Synthesis (Takara, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de cDNA fueron seleccionados para la expresión centrado vía 88-miRNAs miScript miARN PCR matriz de cáncer PathwayFinder Humano (MIHS-102Z; Frederick, MD, EE.UU.). 7500 en una sistema de PCR en tiempo real ABI se analizaron
microRNAs aún más sobre la base de su posible papel en el cáncer y la expresión que se regula de manera significativa en el sistema de matriz miARN PCR. Se eligió este límite para reducir el número de genes a un número más viable y centrarse en aquellos genes cuya expresión se cambió sustancialmente. Utilizando estos criterios, hemos sido capaces de reducir nuestro enfoque a 14 miRNAs siguientes: hsa-miR-let7c; hsa-miR-let7e; hsa-miR-21; hsa-miR-125; hsa-miR-126; hsa-miR-146; hsa-miR-150; hsa-miR-182; hsa-miR-183; HSA-mir-193; hsa-miR-767; hsa-miR-149; hsa-miR-100; HSA-miR-32. expresión relativa se calculó por el método de ciclo umbral comparativo (C
T), utilizando la expresión de U6 ARN nuclear pequeño como el de referencia. El Uni-MIR qPCR cartilla fue incluido en el kit. La cantidad de miARN se controló con SYBR Premezcla Ex Taq II (Perfect Tiempo Real) (Takara, Japón). Las condiciones de PCR fueron 30 segundos a 95 ° C, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 30 años.
La apoptosis Evaluación
El número de células fluorescentes verdes que exhiben morfología apoptótica similar inducida por la apoptosis mediada AT2R después de la transfección de siRNAs se evaluó contando las células a partir de 10 campos al azar por pocillo. Conteos fueron realizados por un individuo que fue cegado en cuanto al tratamiento.
Análisis de Western Blot
inmunotransferencias Western se realizaron como se describe anteriormente [15]. Los anticuerpos primarios y sus fuentes fueron los siguientes. P38 MAPK anti-total, el p53 anti-total, el p44 anti-totales /42 MAPK, p44 anti-fosforilada /42 (pp44 /42) MAPK, p53 y anti-fosforilada (pp53) eran de Señalización Celular Tecnología. p38 anti-fosforilada (pp38) MAPK era de Millipore. Anti-β-actina y los anticuerpos secundarios de rábano picante IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa y anti-IgG de conejo fueron de Sigma-Aldrich. Anti-IgG de cabra era de Santa Cruz Biotechnology.
Análisis estadístico
Para todos los experimentos, la transducción viral se llevó a cabo en pocillos por triplicado y se repitieron al menos tres veces. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (SD) de 3 a 5 experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó con el software SPSS 13.0. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t cuando se compararon sólo 2 grupos, y por ANOVA cuando se compararon los grupos de 3 o más. P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
mediada por adenovirus Expresión de AT2R en células de cáncer de próstata
En nuestro estudio, las células DU145 infectadas con Ad-G. AT2R-EGFP (100 IFU /célula, 2 días) mostró un gran número de células apoptóticas en comparación con el vector de control (Fig. 1A, B, C, D), consistente con nuestro informe anterior [12]. A continuación, PCR en tiempo real se utilizó para determinar la expresión relativa de AT2R. Nuestros resultados mostraron que AT2R se sobreexpresa significativamente en DU145-transducidas Ad G AT2R-EGFP-o
células DU145 células PC-3 de una manera dependiente de la dosis (Tabla 2 y la Fig. 1E, F). Eran transducidas con Ad-G-AT2R-EGFP (B y D) y Ad-CMV-EGFP (a y C) (100 IFU /célula) durante 2 días, y la morfología celular se examina bajo un microscopio de fluorescencia. Las barras de escala, 50 micras. ARN total fue extraído a partir de células DU145 transducidas y AT2Rs se detectaron por el tiempo real de RT-PCR. Etidio geles con bromuro de manchado muestran AT2R (E) y transcripciones GAPDH (F) en las células transducidas. M, DL 2000 ADN Maker (Takara); 1, 3, 5, 7, 9: transducidas con 10, 20, 50, 100, 200 IFU /célula por separado de Ad-G-AT2R-EGFP; 2, 4, 6, 8, 10:. Transducidas con 10, 20, 50, 100, 200 IFU /célula por separado de Ad-CMV-EGFP
TRAIL-R2 y Gadd45a Contribute a AT2R la apoptosis inducida en células DU145
se realizó el análisis de matriz
PCR para determinar los efectos moleculares de la expresión AT2R en las células DU145. De los 84 genes representados en la apoptosis humano RT
2 perfiles de matriz de perfiles de PCR, los niveles de expresión de 6 genes (TRAIL-R2, BAG3, BNIPI, HRK, Gadd45a, TP53BP2) fueron reguladas y un gen (TNFSF10) se había reducido regulado en las células DU145 transducidas con Ad-G-AT2R-EGFP (Tabla 3, Fig. 2). Estos genes expresados diferencialmente se pueden asignar a los genes que codifican el factor de necrosis tumoral (TNF) familia de ligandos (TNFSF10), la familia de receptores TNF (TNFRSF10B), la familia Bcl-2 (BAG3, BNIP1, HRK), así como la proteína p53 tumor de unión la proteína 2 (TP53BP2) y detención del crecimiento y daño del ADN-inducible, alfa (Gadd45a). Curiosamente, Bcl-2 no fue regulada de manera significativa en el análisis conjunto de PCR. PCR en tiempo real se utilizó más a la validez de su expresión. Nuestros resultados mostraron que no hubo ningún cambio significativo en la Bcl-2 expresión en células DU145 transducidas con Ad-G-AT2R-EGFP en comparación con células transducidas Ad CMV-EGFP (Fig. 3).
células tratadas con Ad-CMV-EGFP (200ifu /célula) se utilizó como control.
células DU145 fueron transducidas ya sea con Ad-G-AT2R-EGFP (AT2R) o Ad-CMV-EGFP (EGFP ) para 2d en 200 IFU /célula. Estos tratamientos fueron seguidos por el aislamiento de ARN total y entonces el análisis RT-PCR en tiempo real usando cebadores de oligonucleótidos específicos y sondas Taqman. Todos los datos se normalizaron contra los niveles de expresión de GAPDH ARNm dentro de la misma muestra. Columnas, con una media de tres experimentos independientes.
tecnología de interferencia de siRNA se utilizó para determinar el papel de cuatro genes regulados, incluyendo TRAIL-R2, Gadd45a, TP53BP2 y HRK, en AT2R apoptosis inducida en células DU145 transducidas. La transfección de estos siRNAs en células DU145 disminuyó su expresión mRNA (Fig. 4A). El tratamiento de células DU145 con la Gadd45a siRNA redujo el efecto apoptótico en alrededor de 30%, mientras que TP53BP2 siRNA y HRK siRNA no causaron diferencias significativas en la apoptosis mediada por AT2R comparación con los controles. Curiosamente, el tratamiento de las células DU145 con el TRAIL-2 siRNA aumentó significativamente la apoptosis inducida por AT2R más de 4 veces en comparación con las células transfectadas de control siRNA (Fig. 4B). Por otra parte, el aumento de la apoptosis no era debido al efecto directo de TRAIL-R2 siRNA, ya que TRAIL-R2 siRNA solo no causó resultados de apoptosis (datos no se muestran).
células DU145 se transfectaron con TRAIL-R2, Gadd45a, TP53BP2 o HRK siRNA (20 nmol /L) o ARNsi de control (20 nmol /L), seguido de la transducción con Ad-G-AT2R-EGFP (100 IFU /célula) durante 2 d. (A) siRNAs mediada por disminución de la expresión de ARNm en las células DU145 transducidas; (B) células fluorescentes verdes que muestran la morfología apoptótica, que se contará a partir de 10 campos por así .. Las columnas, con una media de tres experimentos; bares, SE. *, P & lt;.
0,05
En conjunto, estos datos indican que la apoptosis inducida por la sobreexpresión AT2R depende en parte de Gadd45a en las células DU145. TRAIL-R2 puede ser un regulador negativo de la apoptosis AT2R inducida en células DU145.
HRK contribuye a AT2R la apoptosis inducida en células PC-3
Teniendo en cuenta los genes upregulated producidos por la sobreexpresión de AT2R en las células DU145, el próximo explorado los efectos de AT2R sobreexpresión de los genes en las células PC-3 por tiempo real de RT-PCR. Hemos demostrado que los niveles de expresión de HRK (un gen pro-apoptótica) se incrementaron en las células PC-3 en una forma dependiente de la dosis y alcanzaron un nivel muy alto en 100ifu /célula (Fig. 5A).
a, expresión HRK mRNA en células PC3 transducidas con las dosis indicadas. B y C, las células PC3 se trataron con 20 nmol /L HRK siRNA o control de siRNA y Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /célula) como se describe en Materiales y Métodos seguido 48 horas más tarde por tiempo real RT-PCR análisis (B) de cualquiera de HRK mRNA o la evaluación de células con morfología apoptótica similar a (C). Columnas, con una media de tres experimentos independientes en cada caso; bares, SE. *, P & lt; 0,05 frente a células control
Para explorar el papel de la apoptosis en HRK AT2R inducida en células PC3, HRK siRNA se transduce en células PC-3 para reducir la expresión HRK (fig. . 5B). El resultado mostró regulación a la baja de HRK en células PC-3 redujo significativamente la apoptosis inducida por AT2R ~ 45% (Fig. 5C).
La participación de Gadd45a, TRAIL-R2 y HRK en AT2R la apoptosis inducida por Independiente de p38 MAPK, p44 /42 MAPK y p53
además, investigó la vía de señalización corriente abajo causada por AT2R sobre-expresión de la apoptosis celular. Nuestro estudio anterior demostró que el aumento de expresión de AT2R inducir apoptosis a través de la activación de la vía de p38 MAPK [14]. Sin embargo, en este estudio, la activación de p38 MAPK, p53 y p44 /42MAPK no se observó en la baja regulación de Gadd45a y TRAIL-R2 apoptosis mediada AT2R inducida en células DU145 (Fig. 6A, 6B, 6C). Resultados similares se observaron también en células PC3 (Fig. 7A, 7B, 7C). Estos indican que la participación de Gadd45a, TRAIL-R2 y HRK en la apoptosis mediada por AT2R era independiente en la activación de p38 MAPK, p53 y p44 /42 MAPK.
DU145 células fueron transfectadas con siRNA TRAIL-R2
(carril 1), Francia Gadd45a
siRNA (carril 2)
, TP53BP2 siRNA
(carril 3)
, HRK siRNA
(carril 4)
, el control
siRNA (carril 5)
o simulacro de
(carril 6)
seguido 24 horas más tarde por transducción con Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /célula). Después de 2 días de incubación, se recogieron las células y se sometieron a análisis de Western blot (representativos de tres experimentos diferentes). niveles (A) de expresión de p44 totales /42, pp44 /42 y bandas de proteína beta-actina. niveles (B) de expresión de p38 totales, pp38 y bandas de proteína beta-actina. (C) los niveles de expresión de p53 totales, bandas de proteína pp53 y la beta-actina.
PC-3 células fueron transfectadas con siRNA HRK
(carril 1)
, control de
siRNA (Lane2)
o simulacro de
(carril 3)
seguido 24 horas más tarde por transducción con Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /célula). Después de 2 días de incubación, se recogieron las células y se sometieron a análisis de Western blot (representativos de tres experimentos diferentes). (A) los niveles de expresión de p44 totales /42, pp44 /42 andβ-actina de las bandas de proteínas. niveles (B) de expresión de p38 total, el PP38 bandas de proteínas andβ-actina. (C) los niveles de expresión de p53 totales, bandas de proteína pp53 y la beta-actina.
Las citoquinas y microARNs expresión de validación
Arriba y citoquinas y microRNAs las reguladas fueron seleccionadas por Real- matriz PCR en tiempo en las células DU145 transducidas (figura 8A, 9A). Real-time RT-PCR se utilizó para validar la expresión de citoquinas y Perfiles de microARN producido por AT2R sobreexpresión en células DU145. Los genes y microARN fueron elegidos en base a sus cambios de expresión, que se obtuvieron de gama análisis de PCR, y las posibles funciones fisiológicas sobre la apoptosis y la proliferación. Los niveles de mRNA de IL8 y IL6 se aumentaron más de 2 veces y 40%, respectivamente, en las células DU145 transducidas con Ad-G-AT2R-EGFP en comparación con las células transducidas con Ad-CMV-EGFP (Fig 8B & amp;. C), mientras que BMP6 ( Fig. 8D), BMP7 (Fig. 8E) se redujo en un 50% y 45%, respectivamente, y la expresión de BMP1, BMP4, BMP8B, TGFB1, TGFB2 y TGFB3 (Fig.8F, 8G, 8H, 8J) fueron no cambió significativamente . Con respecto a los microARN, el resultado indicó que el microARN 150 se incrementó más de 5 veces en las células DU145 transducidas con Ad-G-AT2R-EGFP en comparación con las células transducidas con Ad-CMV-EGFP, mientras que otros microARN no cambiaron significativamente (Fig. 9B). Estos resultados fueron consistentes con nuestra gama de datos miScript miARN PCR.
DU145 células fueron transducidas ya sea con Ad-G-AT2R-EGFP (AT2R) o Ad-CMV-EGFP (EGFP) durante 2 da 200 IFU /celda. Otros grupos de células fueron transducidas simulacro. A. Arriba y citocinas reguladas por fueron seleccionadas por matriz en tiempo real PCR en las células DU145. En tiempo real el análisis RT-PCR de cualquiera de IL8 (B), IL6 (C), BMP6 (D), BMP7 (E), BMP1 (F), BMP4 (G), BMP8B (H), TGFB1 (J), TGFB2 (J) y TGFB3 (J). Todos los datos se normalizaron contra los niveles de expresión de GAPDH ARNm dentro de la misma muestra. Columnas, con una media de tres experimentos separados; bares, SE. *, P & lt; 0.05.
DU145 células fueron transducidas ya sea con Ad-G-AT2R-EGFP (AT2R) o Ad-CMV-EGFP (EGFP) durante 2 da 200 IFU /célula. Estos tratamientos fueron seguidos por el aislamiento de mRNA y luego en tiempo real el análisis RT-PCR de microRNA seleccionado. Todos los datos se normalizaron contra la expresión niveles U6 dentro de la misma muestra. Columnas, con una media de tres experimentos separados; bares, SE. *, P & lt; 0,05 frente-CMV-EGFP transducidas Ad. A. Arriba y abajo-microARN regulados fueron seleccionadas por matriz en tiempo real PCR en las células DU145. B. Validación de la expresión de microARN mediante PCR en tiempo real.
Discusión
A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio que evalúa claramente gen relacionado con la apoptosis, las citocinas expresión de genes y microARN perfiles asociados a la apoptosis inducida por AT2R en células de cáncer de próstata. También es el primer estudio que informe sobre los efectos directos selectivos de Gadd45a, TRAIL-R2 y HRK en la apoptosis inducida por la sobre-expresión de AT2R en DU145 o las células PC-3. Estos resultados proporcionan información importante hacia una mejor comprensión del mecanismo molecular de la apoptosis mediada por AT2R en células de cáncer de próstata.
En este estudio, se observó que forzada sobre-expresión de AT2R dio lugar a cambios significativos en un gran número de genes y microARN expresiones por medio de análisis de matriz de PCR. A continuación, hemos demostrado que TRAIL-R2 y Gadd45a están implicados en la apoptosis inducida por AT2R en las células DU145 y HRK jugaron un papel importante en la apoptosis mediada por AT2R en células PC-3. Por último, TRAIL-R2, y Gadd45a HRK implicaciones en la apoptosis inducida por AT2R fueron independientes de la activación de p38 MAPK, p44 /42 MAPK y p53 en líneas celulares de cáncer de próstata.
Gadd45a fue hasta reguladas en AT2R-sobreexpresa células DU145 en nuestro presente estudio. Gadd45a, un gen daño-inducible p53-regulado y ADN, es un miembro de la familia Gadd45 de genes que se sabe que los sensores de tensión, que modula la respuesta celular a una variedad de condiciones de estrés, incluyendo el estrés genotóxico y oncogénico [16] - [ ,,,0],19]. Otros estudios han demostrado que Gadd45a inhibe la angiogénesis tumoral mediante el bloqueo de la vía de mTOR /STAT3 [20]. Gadd45a es un objetivo transcripcional de p53 supresor de tumores y BRCA1, cuya pérdida de las funciones clave de juego función en el desarrollo del cáncer [21]. Por otra parte, Zerbini L, et al [22] han indicado que Jund, Gadd45a y GADD45G como dianas terapéuticas en Caner próstata. De acuerdo con este estudio, nuestros datos muestran que la apoptosis mediada por AT2R era parcialmente dependiente de Gadd45a en las células DU145.
Los datos presentados aquí indican que TRAIL-R2 está implicado en la apoptosis mediada por AT2R de las células DU145. Un gran número de pruebas mostró que TRAIL, un ligando inductor de la apoptosis, desencadena la apoptosis en varias líneas celulares de cáncer sin toxicidad para las células normales [23]. TRAIL tiene al menos cuatro receptores de la superficie celular, y que induce la apoptosis a través de dos receptores estrechamente relacionados, TRAIL-R1 y TRAIL-R2 [24]. TRAIL-R1 y TRAIL-R2 inducen la apoptosis dependiente de FADD y activan la ruta de NF-kappaB [25]. Unidos a la membrana de TRAIL /sus receptores se expresan constitutivamente a niveles altos en carcinomas primarios y metastásicos en casi todos los pacientes [26]. Nuestro estudio presentado aquí demostró que TNFSF10 (TRAIL) se había reducido regulado, mientras que TRAIL-R2 fue hasta reguladas en las células DU145 AT2R-sobreexpresado. Curiosamente, regulación a la baja de TRAIL-R2 mejora de forma significativa el efecto de apoptosis inducida por AT2R sobreexpresión. Nuestros datos también mostraron que la apoptosis fue indetectable cuando TRAIL-R2 fue derribado solamente. Por lo tanto, nuestros experimentos sugieren que TRAIL y TRAIL-R2 pueden ser reguladores negativos de la apoptosis AT2R mediada por células DU145, y el tratamiento combinado con sobreexpresión AT2R y regulación a la baja de TRAIL-R2 pueden ser prometedora como una nueva terapia génica contra el cáncer de próstata humano.
Algunas células tumorales son resistentes a la citotoxicidad inducida por TRAIL, aunque TRAIL se ha informado de inducir la apoptosis de una variedad de tipos de células tumorales [27], [28]. La falta de sufrir apoptosis se ha implicado en la resistencia de las células cancerosas a la vigilancia TRAIL y por lo tanto en el desarrollo tumoral. Los determinantes moleculares de la apoptosis inducida por TRAIL no se han examinado exhaustivamente en las células de cáncer de próstata humano. células LNCaP y DU145 de cáncer de próstata son resistentes a la apoptosis inducida por TRAIL, TRAIL y fue menos activo contra los compara con PC-3 células de cáncer de próstata [29], [30]. La sensibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL podría ser correlacionada con las expresiones relativas de TRAIL-R1 y TRAIL-R2 frente DcR1 y DcR2 o los niveles intracelulares de la llama-1 [31], [32]. Sin embargo, en comparación con las células LNCaP, que tienen la menor sensibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL, muy sensibles las células PC-3 muestran los niveles de proteína similares o inferiores de TRAIL-R1 y TRAIL-R2 y mayores niveles de DcR2 [30]. También se encontró que la expresión de TRAIL-R1 y TRAIL-R2 en la línea celular MCF10A TRAIL-sensible no era diferente de líneas celulares resistentes, por ejemplo, 184B5 [33]. Esto hace que sea poco probable que la sensibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL está completamente controlado por las cantidades relativas de TRAIL-R1 y TRAIL-R2. Se sugiere que otros factores u otros mecanismos pueden ser reguladores importantes de la sensibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL en estas células cancerosas. Probablemente, en este estudio TRAIL-R2 regulando negativamente la apoptosis mediada por AT2R en las células DU145 nos ayudará a explorar los mecanismos de la sensibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL en células diferentes.
Una observación muy reciente que TRAIL-R2, pensamiento a sólo actúan cuando son estimuladas por TRAIL en la superficie celular, cumple una función distinta en el núcleo donde se promueve la proliferación celular de una manera TRAIL-independiente sugiere una función específica, la proliferación asociada de nuclear TRAIL-R2 [34]. Nuclear TRAIL-R2 inhibe la maduración de la microARN let-7 en líneas celulares de cáncer de páncreas y aumenta su proliferación. muestras tumorales pancreáticas han aumentado los niveles de TRAIL-R2 nuclear, que se correlacionan con un peor pronóstico de los pacientes [34]. Estos resultados indican que en el núcleo, los receptores de muerte pueden funcionar como promotores tumorales y podrían ser dianas terapéuticas, y el hombre nos ayudan a estudiar más a fondo la relación entre AT2R y TRAIL-R2.
Varios estudios han demostrado que HRK (pro miembro -apoptotic BH3-only Bcl-2 familia, Harakiri) es un gen pro-apoptótica en varias células [35] - [41]. HRK inactivación se asocia con un índice apoptótico baja en glioblastomas secundarios [42]. En el presente estudio, mostramos que HRK fue hasta reguladas en DU145 AT2R-sobreexpresa y células PC-3, y cuando HRK fue silenciada, la apoptosis mediada por AT2R se redujeron significativamente en PC-3, pero no las células DU145. Estos datos indican que la apoptosis inducida por AT2R sobre-expresión es al menos parcialmente dependiente de HRK en células PC-3. También se demostró que los niveles de expresión de HRK se incrementaron en células PC-3, respectivamente, de una manera dependiente de la dosis. En conjunto, nuestros resultados indican que la apoptosis inducida por la sobreexpresión de AT2R puede depender de la vía de pro-apoptótica HRK en las células PC-3. Sin embargo, hay algunas preguntas que deben ser respondidas, como, no se puso de manifiesto el mecanismo de la apoptosis vía de AT2R a HRK y si es o no el HRK podría desencadena la apoptosis en otras células de cáncer de próstata.
Nuestros experimentos anteriores indican que AT2R inducida por apoptosis es ligando (Ang II) independiente, mediado por p38 MAPK y la caspasa-3, y se produce a través de una vía de señalización de la muerte celular extrínseca [12].