Extracto
Antecedentes
La acumulación de pruebas que apoya el crecimiento del tumor y la recidiva del cáncer son impulsadas por las células madre del cáncer. Nuestro trabajo previo ha demostrado la existencia de CD90
+ células madre del cáncer de hígado (células madre cancerosas) en el carcinoma hepatocelular (HCC). Sin embargo, las características de estas células son aún poco conocidos. En este estudio, hemos empleado un más sensible ARN-secuenciación (RNA-Seq) para comparar el perfil de expresión génica de CD90
+ células ordenados por el tumor (CD90
+ células madre cancerosas) con los tejidos hepáticos no tumorales paralelas (CD90
+ NTSCS) y elucidar el papel de los genes diana putativos en hepatocarcinogénesis.
Metodología /Principales conclusiones
CD90
+ células fueron ordenados respectivamente a partir del tumor y la humana no tumoral adyacente los tejidos del hígado utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia. Los ARN amplificados de CD90
+ células a partir de 3 pacientes con HCC se sometieron a análisis de ARN-Seq. Un perfil de expresión génica diferencial se estableció entre CD90
+ células madre cancerosas y CD90
+ NTSCS, y validado por cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) en el mismo conjunto de ARN amplificados, y confirmó además en una cohorte independiente de 12 pacientes con HCC. Quinientos genes fueron expresados diferencialmente (119 hasta reguladas y 381 genes regulados)
+ NTSCS entre CD90
+ células madre cancerosas y CD90. Gene ontología análisis indicó que los genes sobreexpresados en CD90
+ células madre cancerosas estaban asociados con la inflamación, resistencia a los medicamentos y el metabolismo de los lípidos. Entre los genes expresados diferencialmente, glipicano-3 (GPC3), un miembro de la familia glipicano, se elevó notablemente en CD90
+ células madre cancerosas en comparación con CD90
+ NTSCS. La inmunohistoquímica demostró que GPC3 fue altamente expresado en cuarenta y dos tejidos tumorales de hígado humano, pero ausente en los tejidos del hígado no tumorales adyacentes. La citometría de flujo indicó que GPC3 fue altamente expresado en el hígado CD90
+ células madre cancerosas y las células cancerosas maduras en líneas celulares de cáncer de hígado y los tejidos tumorales de hígado humano. Por otra parte, la expresión de GPC3 se correlacionó positivamente con el número de CD90
+ células madre cancerosas en los tejidos tumorales del hígado.
Conclusiones /Importancia
Los genes identificados, como GPC3 que se expresan claramente en el hígado CD90
+ células madre cancerosas, puede ser prometedor para la terapia de genes candidatos HCC sin inducir daños a las células madre hepáticas normales
Visto:. DWY Ho, Yang ZF, Yi K, Lam CT, Ng MNP, Yu WC, et al. (2012) perfiles de expresión génica del cáncer de hígado Células Madre de ARN de secuenciación. PLoS ONE 7 (5): e37159. doi: 10.1371 /journal.pone.0037159
Editor: G. Dean Tang, la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de septiembre de 2011; Aceptado: April 15, 2012; Publicado: 14 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Ho et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Li Ka Shing Fondo de la señora de la Universidad de Hong Kong, Hong Kong, china. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: Algunos autores son empleados por compañías comerciales. Zhen Fan Yang es empleado por AstraZeneca Global R & amp; D; Kang Yi, Zhixiang Yan, Cuelgue Liu y Zhang Yong son empleados de BGI-Shenzhen. Esto no altera la adherencia a todos los autores PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El carcinoma hepatocelular (HCC) es el quinto cáncer más común en el mundo con una alta mortalidad tasa [1]. La mayoría de los pacientes con HCC presentes en una fase avanzada, que es refractario a la quimioterapia y la radioterapia [2], [3]. Por otra parte, la tasa de recurrencia de esta enfermedad es muy alta después de tratamiento curativo [4]. La comprensión del mecanismo de la carcinogénesis es fundamental para la gestión de HCC [5].
Las líneas de evidencia han revelado la existencia y la importancia de las células madre del cáncer (CSC) en la carcinogénesis en las últimas décadas. CSC se considera que es la raíz de los cánceres, y son responsables para el crecimiento tumoral y la diferenciación de poblaciones de células heterogéneas dentro de los tumores [6]. Además, se han demostrado para ser quimiorresistente [7] y radioresistant [8]. En nuestro estudio anterior, utilizando el CD90 marcador de superficie (Thy-1, expresado por las células madre /progenitoras hepáticas), células madre cancerosas hepáticas fueron identificados en las líneas de HCC celulares, muestras de tumor y muestras de sangre periférica de pacientes con HCC y éstos CD90
+ células madre cancerosas se muestra la capacidad tumorigénicos [9].
Dado que las capacidades de tumorigenicidad, la diferenciación, la auto-renovación y la quimio-resistencia del hígado CD90
+ células madre cancerosas se rigen por su composición genética distintiva y una serie de cambios en la expresión génica en biológica procesos, la elucidación de su perfil molecular es importante en la comprensión de las características de estas células. Sin embargo, la amplia perfiles de expresión génica de células madre cancerosas del hígado queda por determinar.
En las últimas décadas, los microarrays de ADNc se ha utilizado ampliamente para identificar los perfiles de expresión génica diferencial en muchos tipos de cáncer para la detección, el pronóstico y las clasificaciones de tumores [10] - [13]. Sin embargo, el cDNA microarray sufre de limitaciones intrínsecas, como la baja sensibilidad, bajos rangos dinámicos [14], y los artefactos de hibridación [15]. De hecho, la mayoría de los genes en los procesos biológicos, tales como los que codifican factores de transcripción y transductores de señal, por lo general expresan en niveles bajos [16]. Por lo tanto, el cDNA microarrays no puede ser una herramienta ideal para delinear las vías moleculares. En este estudio, se utilizó la secuenciación de ARN de próxima generación (RNA-Seq), aprovechando su excelente sensibilidad y la capacidad de detectar las variantes de empalme, para secuenciar todo el transcriptomes de hígado CD90
+ células madre cancerosas y CD90
+ no Las células madre -tumorous (NTSCS) de tres pacientes con CHC. La expresión diferencial de genes se examinó entre estos dos grupos de CD90
+ células y los resultados fueron validados por la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (QRT-PCR). Resultados concordantes se indicaron entre las plataformas de RNA-Seq y QRT-PCR, y se detectaron una mayoría de las transcripciones a bajos niveles de expresión de RNA-Seq. Además, las isoformas más estructurales se encontraron en el hígado CD90
+ células madre cancerosas que CD90
+ NTSCS. Además, ontología de genes (GO) el análisis indicó que los genes regulados se asociaron con el metabolismo de fármacos, metabolismo de los lípidos y la inflamación que puede explicar la resistencia a fármacos, la proliferación celular y la progresión del tumor. Entre los genes regulados identificados, Glipicano-3 (GPC3), un miembro de la familia del glipicano proteoglicanos heparán sulfato, se sobre-expresa en CD90
+ células madre cancerosas. Por tinción inmunohistoquímica, GPC3 se detectó en la mayoría de los tejidos tumorales de hígado, pero ausente en los tejidos no tumorales adyacentes. Curiosamente, el nivel de expresión de GPC3 se correlacionó positivamente con el número de CD90
+ células madre cancerosas en los tejidos tumorales hepáticas. La investigación adicional mediante citometría de flujo indicó que GPC3 se expresó notablemente en CD90
+ células madre cancerosas en muestras de tumores de hígado humano. En base a los resultados actuales, independientemente de los roles ambiguos de GPC3 sobre las células madre del cáncer de hígado, GPC3 podría ser un gen diana prometedora para el CHC inmunoterapia debido a su especificidad en las células madre del cáncer de hígado, y su ausencia en las células madre hepáticas normales.
Materiales y Métodos
los pacientes y recogida de muestras
Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado por escrito, y se analizaron los datos y las muestras de forma anónima. El presente estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Hong Kong. Un total de 15 pacientes fueron reclutados para RNA-Sequencing y validación en este estudio (Tabla 1). La edad media de estos pacientes fue de 57. Hubo 14 hombres y 1 mujer. Trece de estos pacientes fueron positivos para la hepatitis B antígeno de superficie de suero y 1 para el anticuerpo de la hepatitis C. Ochenta y siete por ciento de estos pacientes se presentan en estadio III o IV con un tamaño medio del tumor de 9,3 cm del tumor-nódulo-metástasis (TNM). Los tres pacientes con HCC cuyas muestras fueron estudiadas por la RNA-Seq eran hombres, con edades de 55 a 61. Todos eran portadores del virus de la hepatitis B. Dos tenían cáncer de estadio TNM III y uno tenía el estadio TNM del cáncer II. El diagnóstico histopatológico fue hecha de acuerdo a la histología del tumor especímenes examinados por patólogos experimentados.
tejidos tumorales y no tumorales del hígado paralelas fueron cosechadas en el momento de la operación. Se realizó el procedimiento de aislamiento de células de los tejidos del hígado como se ha descrito previamente con algunas modificaciones [9]. En resumen, después de la digestión con 100 unidades /ml de colagenasa tipo IV (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) durante 30 minutos a 37 ° C, los tejidos se picada y la suspensión de células se pasaron a través de una malla de nylon de 100 micras para eliminar restos de tejido. Los glóbulos rojos (RBC) se lisaron entonces por tampón de lisis de glóbulos rojos y la suspensión de células se lavó de nuevo, finalmente, pasa a través de una malla de nylon de 40 micras. Las células se resuspendieron con tampón y HetaSep (Cell Technology, Vancouver, BC, Canadá Stem) se añadió luego a la suspensión de células para la eliminación de restos que puedan quedar. Después de la eliminación de células muertas, las células fueron finalmente se resuspendieron en tampón de tinción (2% de BSA, EDTA 2 mM en PBS), se contaron y se sometieron a análisis de citometría de flujo y clasificación de células. Las células también se clasificaron en portaobjetos de vidrio, a contratinción con DAPI y se examina bajo el microscopio de fluorescencia.
Las líneas celulares
líneas celulares
PLC y MHCC97L [9] se mantuvieron como cultivo en monocapa en DMEM de alta glucosa con 10 % de suero fetal bovino y 1% de penicilina /estreptomicina (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en el aire.
clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para CD90
+ células
Las células aisladas a partir de tejidos tumorales y no tumorales se marcaron con anticuerpos anti-CD45 humanos APC-conjugados PE conjugado con CD90 anti-humano y (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.). Posteriormente, CD45
-CD90
+ células fueron aisladas utilizando un clasificador celular BD FACSAria II (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, EE.UU.). Una alícuota de CD90 se comprobaron
+ células de la pureza. Las células aisladas se trataron adicionalmente con ARN ™ reactivo más seguro estabilización de ARN (SABiosciences, Frederick, MA, EE.UU.) y los sedimentos celulares se almacenaron a -80 ° C para su posterior aislamiento de ARN.
análisis de citometría de flujo de células HCC líneas y tejidos de tumores de hígado humano para GPC3 y CD90
Inicialmente células viables PLC y MHCC97L y células viables a partir de tejidos tumorales del hígado humano después de la digestión se clasificaron utilizando Sytox azul (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante, a continuación, las células se fijos y permeabilized con el kit de fijación /permeabilización (BD Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.). Después del lavado, las células se tiñeron con un conjugado con PE anti-CD90 (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.) y un anticuerpo anti-GPC3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) marcado con Alexa Fluor Zenon® ® 488 IgG1 de ratón Labeling Kit (Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.). Después de la incubación y el lavado, se detectaron las células teñidas y contados por un BD FACSAria II (Becton Dickinson Sistemas Immunocytometry, San Jose, CA). isotipos apropiados se utilizaron como controles.
aislamiento de ARN y la amplificación del ARN
Total de los ARN celulares se extrajeron de la CD45 aislado
-CD90
sedimento celular utilizando un ARN RNAqueous-Micro + kit de aislamiento (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). Las muestras de ARN (ng ~ 50) se amplificaron después con un kit de MessageAmp II ARNa amplificación (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, un ADNc de doble hebra fue sintetizado por transcripción inversa a partir de ARN con un cebador T7 promotor. Después de la purificación, el ADNc de doble cadena actuó como plantilla para la transcripción in vitro para generar múltiples copias de ARN amplificado (ARNa). Después de la amplificación de ARN, el ARNa se sometió a una segunda ronda de amplificación con la misma metodología que la primera amplificación, excepto utilizando un cebador diferente proporcionado por el fabricante. Un control Hela ARN también se llevó a cabo en paralelo con las muestras de ARN durante el procedimiento de amplificación. Después de la terminación de la amplificación, se analizó por el Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) se midió la concentración de ARNa utilizando Nanodrop ND-1000 y la calidad del ARNa.
preparación de la biblioteca de ARN y secuenciación
preparación de ARN-biblioteca se realizó de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. En resumen, se purificaron los poli-A que contiene ARNa, seguido por la fragmentación de ARN en trozos pequeños. Los fragmentos de ARN escindidos se sintetizaron en un solo capítulo cDNA utilizando transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen) y aleatorios hexa-cebadores (IDT, Coralville, Iowa, EE.UU.), seguido de la síntesis de la segunda hebra con ADN polimerasa I (Invitrogen) y E. coli RNasa H (Invitrogen). Después de síntesis de la hebra segunda, con la reparación final y A-tailing, los fragmentos de cDNA de doble cadena sintetizados se sometieron a purificación, a continuación, se ligó a adaptadores de Illumina utilizando kit de ligación Quick TM (NEB) y ADN ligasa. Las bibliotecas de ADNc de adaptador modificada de ADNc resultante se fraccionaron en gel de agarosa, los fragmentos de 200 pb se escindieron y se amplificaron por 15 ciclos de reacción en cadena de la polimerasa. Después de la purificación, la calidad de las bibliotecas de ADNc se comprobó por Bioanalyzer 2100 (Agilent). La concentración de bibliotecas de cDNA se midió y se diluyó a 10 nM en tampón Tris-HCl antes de agruparse generación. la formación de agrupaciones, la hibridación del cebador y las reacciones de secuenciación se realizaron secuencialmente de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. En el presente estudio, se utilizó la secuenciación par de fin de Illumina Genome Analyzer II (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.) con 76 ciclos. Un carril de celda de flujo se utilizó para cada muestra. fragmentos de secuencias cortas primas fueron aceptados si pasaban los parámetros de filtrado de calidad utilizados en la etapa de Illumina GA Pipeline GERALD.
Leer la expresión de genes y mapeo
de alta calidad lee fueron alineados a la referencia del genoma humano (NCBI Build 36.1) utilizando el software NextGENe® (SoftGenetics, State College, PA, EE.UU.). El emparejado lecturas fueron alineados con el ARNm Refseq humano (NCBI). Lee más corto de 20 puntos básicos y los que tienen el nivel de calidad inferior al 14 fueron excluidos. Las secuencias alineadas con la transcripción individuo se contaron digitalmente. Los niveles de expresión para cada gen se normalizaron a lecturas por kilobase de modelo exón por millón asignada lee (RPKM) para facilitar la comparación de las transcripciones entre las muestras. el sombrero de copa del software se utilizó para identificar variantes de empalme de cada muestra [17].
RNA-Seq minería de datos y la definición de los genes mis-regulados en todos los pacientes
Una gran base de datos que contiene todas las transcripciones de genes identificados por RNA-Seq para las muestras de CD90
+ células de tumor emparejados y tejidos no tumorales de 3 pacientes estaban reunidos. Una media logarítmica
2 veces el cambio [RPKM de CD90
+ células madre cancerosas /RPKM de CD90
+ NTSCS] de cada gen se calculó a través de los 3 pacientes. La tasa de falso descubrimiento (FDR, es decir, una probabilidad de aceptar erróneamente una diferencia entre estos dos grupos CD90 probado
+ células) de cada gen se determinó según el método de Storey [18]. Los genes fueron considerados como diferencialmente expresados cuando sus FDRs eran de menos de 0,05. Además, los genes se clasificaron como hasta reguladas cuando su media logarítmica
2 veces el cambio relación era más grande que 1 o las reguladas cuando su registro
2 veces el cambio relación era menor que -1.
Fluidigm chips de microfluidos para QRT-PCR
para validar la fiabilidad de los datos de RNA-Seq, inicialmente se realizó qRT-PCR usando los mismos materiales de ARN amplificados como una validación interna, seguido de la original de RNA, no amplificado a partir de una cohorte de pacientes HCC independiente como una validación prospectiva. Sistema de PCR en tiempo real BioMark® 48,48 matriz dinámica (Fluidigm, South San Francisco, CA, EE.UU.) se utilizó para realizar la QRT-PCR de acuerdo con los protocolos del fabricante.
EvaGreen y ensayos TaqMan se realizaron de acuerdo con el los protocolos del fabricante. Los cebadores de genes seleccionados fueron diseñados utilizando Primer 3 de software (Tabla S1). TaqMan Universal Master Mix, TaqMan PreAmp Master Mix y sondas fueron adquiridos de Applied Biosystems (ABI, Foster City, CA, EE.UU.). Las muestras se analizaron al menos por duplicado. El nivel de expresión génica se normalizó restando el ciclo umbral (Ct) de un gen de control abundantemente expresado desde el Ct para cada gen de interés seleccionada. Valores relativos de expresión de genes expresados como factor de cambio fueron posteriormente determinaron utilizando el
-ΔΔCT método 2. GAPDH se utilizó como gen de control de referencia y el CD90
+ NTSCS se tomaron como las muestras de referencia. Los datos fueron analizados usando la versión BioMark Real-Time PCR Análisis de software 2 (Fluidigm).
La cuantificación de la expresión génica de GPC3 se realizó mediante la matriz de Fluidigm digital. El ensayo se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante y se analizaron los datos mediante el uso de software BioMark Análisis PCR Digital (Fluidigm). Células
cuantificación de CD90
+ en muestras de tumores de hígado humano por citometría de flujo
tumor y los tejidos hepáticos no tumorales paralelas se obtuvieron de otros cuarenta y dos pacientes de HCC en el momento de la hepatectomía. Una porción de cada tejidos resecados fue fijado en formalina al 10% y embebidos en parafina. La parte restante se sometió a los mismos procedimientos de FACS para CD90
+ células como se describió anteriormente y se analizaron el número de CD90
+ células y se cuantificaron por BD citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems).
tinción inmunohistoquímica de GPC3 en muestras de tumores de hígado humano
Los tejidos embebidos se cortaron en secciones gruesas 5-m para la tinción inmunohistoquímica de GPC3. Las secciones se desparafinaron inicialmente en xileno y se rehidratan a través de etanol al agua. Las secciones se trataron a continuación con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol durante 20 minutos para abolir la actividad peroxidasa endógena. Para la recuperación de antígenos, las secciones se calentaron en 10 mM de tampón de citrato (pH 6,0) con olla de presión durante 5 minutos a 120 ° C. Las secciones se cubrieron posteriormente con una dilución 1:1000 de anticuerpo monoclonal de ratón anti-GPC3 en PBS (Santa Cruz Biotechnology, California, EE.UU.) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar con TBS-Tween 20, las secciones se incubaron con Envision peroxidasa de rábano picante-Polymer (DakoCytomation, Carpenteria, CA, EE.UU.), que se utilizó como anticuerpo secundario durante 30 minutos a temperatura ambiente. La señal de color para GPC3 de cada sección fue desarrollado por la adición de 3, 3 tetrahidrocloruro diaminobencideno (DakoCytomation), seguido de 2 minutos de incubación. Finalmente las secciones se lavaron con agua destilada y contratinción para núcleos con 10% hematoxilina y deshidratados. El análisis de inmunohistoquímica se llevó a cabo por investigadores independientes. La expresión GPC3 se evaluó utilizando un sistema de "puntuación H", que se obtuvo por la siguiente fórmula:.
3X porcentaje de fuerte tinción + 2X porcentaje de tinción moderada + porcentaje de tinción débil [19]
pequeños ARN de interferencia (siRNA) transfección in vitro
a-GPC3 siRNA específico y un control de siRNA revueltos (SSC) fueron adquiridos de Ambion (Austin, TX). CD90
+ GPC3
+ células fueron ordenados a partir de células PLC para ensayos funcionales posteriores, como las células PLC expresan CD90 relativamente alta y GPC3. knockdown GPC3 se consiguió mediante la transfección de siRNA oligo en las células clasificadas utilizando el transfección inversa con el reactivo Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante en una concentración final de 20 nM siRNA. Estas células transfectadas son anotados en adelante como PLC CD90
+ GPC3
+ (GPC3-). En paralelo, PLC CD90
+ GPC3
+ células fueron transfectadas con el control de siRNA revueltos a una concentración final de 20 nM, que están anotados en adelante como PLC CD90
+ GPC3
+
( SSC).
Ensayo de proliferación celular
PLC CD90
+ GPC3
+ (GPC3-) y CD90
+ GPC3
+
(SSC) las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 4000 células /pocillo en DMEM /10% de FBS. En los puntos de tiempo indicados, se añadieron 10 ul de reactivo WST-1 (Roche Applied Science, Madison, WI, EE.UU.) en cada 100 ul medio pocillo que contiene. La placa se incubó durante 2 horas, seguido de 1 minuto de agitación. El crecimiento celular se evaluó midiendo la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) el día 1, 2, 3 y 4. Cada muestra se realizó por triplicado y se expresan como media ± desviación estándar. se realizaron al menos dos experimentos independientes.
Vástago de colonias de células ensayo de formación de
Clonigénicas capacidad de las células madre del cáncer se evaluó mediante un ensayo de formación de colonias de células madre. El CD90
+ se aislaron GPC3
+ células a partir de células PLC, seguido de la transfección con siRNA y GPC3 revueltos siRNA control, respectivamente. El CD90
+ GPC3
+ (GPC3-) y CD90
+ GPC3
+
(SSC) se sembraron en medio de agar semisólido usando StemTAG TM-96 también se derivan de colonias de células kit de ensayo de formación (Cell Biolabs, Inc. de San Diego, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, 50 ul de Base Agar Matrix capa se dispensó en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se solidificó a 4 ° C. Setenta y cinco ul de la suspensión de células en suspensión /matriz de agar que contiene 5.000 células se dispensó en cada pocillo. Después de la solidificación, se añadió 50 ul de medio de cultivo con factores de crecimiento en cada pocillo y se incubaron las células durante 8 días en el incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO
2. La capacidad de formación de colonias fue examinada bajo un microscopio, y los resultados se determinó entonces mediante la cuantificación de la actividad de la fosfatasa alcalina después de la lisis celular.
El análisis estadístico
se expresaron Las variables continuas como media ± SD o mediana . Las comparaciones de las veces el cambio de los genes y variantes de empalme entre dos grupos se realizaron mediante la prueba t de Student. La correlación entre los genes medidos entre el ARN-Seq y QRT-PCR se mide mediante el coeficiente de correlación de Spearman. Todos los análisis se realizaron con el software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.). Un
valor de p inferior a 0,05
fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Aislamiento de CD90
+ células de las muestras de tumor y no tumorales
Tanto CD90 anti-humano y los anticuerpos anti-CD45 humanos fueron utilizados en los procedimientos de aislamiento. Como CD90 también fue expresada por algunos linfocitos, una combinación de CD45
-CD90
+ se utilizó para definir nonlymphatic CD90
+ células en los tejidos del hígado del paciente (Figura S1). El clasificador celular BD ordenadas CD90
+ células con una pureza media del 86,6%. Un número medio de 3,4 x 10
4 CD90
+ células madre cancerosas de los tejidos tumorales y 8,9 × 10
3 se obtuvieron células de CD90
+ NTSCS de tejidos no tumorales. El número de CD90
+ CSC fue significativamente superior a la de CD90
+ NTSCS (
P
= 0,0008). Los CD90
+ células clasificadas se ve confirmado por tinción de inmunofluorescencia antes de la extracción de RNA.
La extracción de RNA y la amplificación
El rendimiento de ARN a partir de la ordenada CD90
+ células variaron de 12 ng a 200 ng (de 10
3 a 10
4 células). Debido a la cantidad insuficiente de ARN para la RNA-Seq, dos rondas de amplificación del ARN se realizaron según los procedimientos del fabricante. Después de la amplificación, se obtuvo un promedio de 114 g de ARN amplificado (ARNa). Los tamaños estaban en el rango de 200-2000 nucleótidos, y la mayoría son alrededor de 500, que está en concordancia con las especificaciones de los tamaños de Arna indicadas por el fabricante, lo que indica que las muestras Arna estaban en buena calidad.
en cuanto a la polarización de la amplificación de ARN en la tecnología de RNA-Seq, no hay datos de comparación nunca se ha encontrado en la literatura todavía. Sin embargo, se ha demostrado que una o dos rondas de amplificación de ARN generan datos de microarrays reproducibles sin pérdida significativa de la detección de genes [20]. Además, un estudio mostró que el 75% más genes se detectaron mediante secuenciación de mRNA en comparación con microarrays de ADNc después de la amplificación en una única célula [21]. Por lo tanto, hemos creído que el ARNa producido también podría ser utilizado para la RNA-Seq.
secuenciación por síntesis de ARN amplificado aislada de CD90
+ células madre cancerosas y CD90
+ NTSCS de Illumina Genoma Analizador II
Los ARN amplificados después de la construcción de una biblioteca de cDNA se sometieron a RNA-Seq en Illumina Genome Analyzer II (secuenciación par-end). Al finalizar, 14,9 millones a 20,5 millones de larga secuencia de 75 pb lecturas por muestra se generaron, y que correspondía a una media de 1,30 Gb de datos de secuencias en bruto. Alineación de mRNA secuencia de referencia (NCBI) fue 39,4 ± 7% con una mayor porción de lecturas alineado con el genoma de referencia humana (70,3 ± 8%) (Tabla 2), lo que sugiere que las secuencias no alineadas a RefSeq era probablemente debido a la anotación incompleta de isoformas de ARNm de Homo sapiens [22], [23]. Otras causas pueden atribuirse a su origen fuera de la referencia del genoma humano o de baja calidad secuencia [24]. Sin embargo, el número medio de transcripciones detectado CD90
+ células madre cancerosas y CD90
+ NTSCS eran 31.407 ± 2.202 y 31.444 ± 479, respectivamente, lo que corresponde a cerca del 74% de las entradas transcripciones RefSeq humanos. Debido a que no hubo diferencias significativas en el número de transcripciones se encontró entre los dos tipos de CD90
+ células, la comparación de genes se considera válida (
P
= 0,7).
Alternativa RNA precursor mensajero (pre-mRNA) de empalme juega un papel importante en la generación de la diversidad funcional del genoma. La acumulación de pruebas ha puesto de manifiesto que el empalme aberrante contribuye a la neoplasia, la progresión del cáncer y la metástasis [25] - [27]. incluyendo eventos de splicing 'o 5' sitio de empalme alternativo 3, primer exón alternativo, alternativa último exón, intrón retención, y la omisión de exón se compararon entre CD90
+ células madre cancerosas y CD90
+ NTSCS (Tabla 3). Los números medios de splicing alternativo de CD90 fueron encontrados
+ células madre cancerosas para ser 383, mientras que los de CD90
+ NTSCS eran 245 (
P Hotel & lt; 0,05). Más variantes estructurales fueron encontrados en CD90
+ células madre cancerosas en comparación con CD90
+ NTSCS, lo que indica que la diversidad más regulador y funcional de transcriptomes se produjo en células madre cancerosas del hígado.
La distribución de las transcripciones de CD90
+ CSC y CD90
+ NTSCS mostraron patrones similares (Figura 1). Hemos observado que el 80% de las transcripciones tenía menos de 10 RPKM en CD90
+ células madre cancerosas o CD90
+ NTSCS, pero sólo el 0,1% de las transcripciones expresadas tenido más de 1.000 RPKM. Esto implicaba que la mayoría de las transcripciones se expresaron a niveles bajos y no puede ser fácilmente identificado por el cDNA microarray. Un patrón de distribución de transcripción similar se encontró en el estudio de los perfiles de expresión génica en glioblastoma utilizando la tecnología de secuenciación de nueva generación [28]. Esto demuestra una vez más la alta sensibilidad de RNA-Seq en la detección de transcripciones expresadas humilde de células del cáncer [29]
Y-eje, número de lecturas.; El eje X, contenedores de los niveles de expresión (en contenedores de & lt; 5 RPKM, 5-10 RPKM, 11-100 RPKM, 100-1000 RPKM y & gt; 1000 RPKM). La mayoría de los transcritos se expresaron en niveles bajos (& lt; 5 RPKM). RPKM, lee por kilobase por millón de lecturas.
El análisis de los perfiles de expresión génica de CD90
+ células madre cancerosas y CD90
+ NTSCS
Tras la eliminación de los genes duplicados después la alineación de las transcripciones a la secuencia de referencia de ARN humano, se analizaron los perfiles de expresión génica de 24.609 genes. Quinientos genes fueron expresados diferencialmente, entre los cuales 119 fueron de genes regulados, y 381 se redujeron reguladas.
En los estudios previos y actuales, se utilizó el anticuerpo CD90 anti-humano para aislar CD90
+ CSC y CD90
+ NTSCS partir de tejidos tumorales de pacientes debido a CD90 es un marcador de superficie de células madre hepáticas (células ovales) [30]. Estos dos grupos de células exhiben propiedades de células madre similares, tal como se refleja a partir de los genes implicados en la pluripotencia y la diferenciación (Tabla 4) que expresa en niveles similares, lo que sugiere su origen a partir de las células madre hepáticas.
Housekeeping genes se expresaron en niveles comparables en CD90
+ células madre cancerosas y CD90
+ NTSCS, lo que indica que los cambios en la expresión de otros genes podrían compararse razonablemente entre estos dos grupos (Tabla 4).
características representativas de los genes expresados diferencialmente en CD90
+ células madre cancerosas y CD90
+ NTSCS se resumen (Tabla 5, hasta reguladas y en la Tabla 6, las reguladas). Los genes regulados se asociaron con las funciones biológicas, incluyendo el transporte de fármacos (ABCC5), el metabolismo de los lípidos (APOE, APOC1), la angiogénesis (COL15A1, Plau, PLVAP), la proliferación celular (ESM-1, FGL1, GPC3, IGFBP5), el transporte ( MAPA), la respuesta inflamatoria aguda (APOA2, ORM1), la producción de citoquinas (FABP4), el ciclo celular (PLK2), la transducción de señales (RAP2A), y la activación de la vía MAPK /ERK (CXCR4). reguladas por los genes estaban involucrados en varios procesos biológicos, incluyendo el desarrollo de órganos (ADAMTS1, ALDH1A2), la respuesta a la hipoxia (ANGPTL4, EDN1, SOCS3, VEGFA), unión de nucleótidos (ATP2A3, RAN, RPLP2), la actividad de elongación de la traducción (EEF1D), y quimiotaxis (IL8, CXCL1).
la validación de los datos de RNA-Seq por QRT-PCR
Para verificar los datos de RNA-Seq, los originales seis muestras de ARN amplificados utilizado para el ARN-Seq se pusieron a prueba una vez más por QRT-PCR en un panel de 47 genes expresados diferenciales. genes seleccionados incluyen 28 genes regulados y 19 genes regulados hacia abajo. Registro de cambios
2 veces de genes de QRT-PCR se comparó con la de RNA-Seq. Estas dos plataformas de análisis de expresión génica mostraron resultados concordantes (Spearman de correlación de rangos = 0,88,
P Hotel & lt; 0,001; Figura 2). Además, la pendiente de la recta de regresión fue de 0,73, lo que sugiere que el ARN-Seq tenía una gama dinámica similar de detección como la de QRT-PCR, y por lo tanto nuestro método RNA-Seq podría medir con fiabilidad las diferencias de expresión génica, en particular para los expresados humilde los genes en el CD90
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+ NTSCS
la correlación entre los datos de RNA-Seq de 47 genes seleccionados QRT-PCR y los genes.: 28 hasta los genes regulados y 19 de las reguladas en 3 pares de muestras de ARN amplificado. Spearman coeficiente de correlación de rangos = 0,88 (
P Hotel & lt; 0,001). Y pendiente = 0,73
Confirmación de los datos de RNA-Seq por QRT-PCR utilizando muestras de una cohorte de pacientes independientes
para eliminar el sesgo potencial como resultado de pre-amplificación y para validar los resultados de RNA-Seq, QRT-PCR de 27 genes regulados y 15 genes regulados se realizó en 12 pares de muestras de ARN preparadas de CD90
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+ NTSCS derivan de un lote independiente de tejidos tumorales y no tumorales paralelas, respectivamente.