Extracto
Antecedentes
La patogénesis y los factores para determinar la progresión de la esteatosis alcohólica y no alcohólica de esteatohepatitis con riesgo de progresión a cirrosis hepática y cáncer, son poco conocidos. En el presente estudio, que tuvo como objetivo identificar las firmas moleculares potenciales para la discriminación de la esteatohepatitis desde la esteatosis.
Se aplicó
Metodología y Resultados
análisis de microarrays de expresión génica global
para desentrañar los genes expresados diferencialmente entre esteatohepatitis en comparación con esteatosis y control de muestras. Para la anotación funcional, así como la identificación de los procesos biológicos relevantes de la enfermedad de los genes expresados diferencialmente la ontología de genes se utilizó (GO) base de datos. genes candidatos seleccionados (n = 46) fueron validados en 87 muestras de hígado humano a partir de dos cohortes de la muestra cuantitativa por PCR en tiempo real (QRT-PCR). El análisis reveló que GO genes regulados en la esteatohepatitis eran principalmente involucrados en los procesos metabólicos. Los genes regulados por la esteatohepatitis en muestras estaban asociados con la progresión y la proliferación del cáncer. En las muestras de resección hepática quirúrgicas, y 39 genes en biopsias hepáticas percutáneas, 30 genes fueron significativamente hasta reguladas en la esteatohepatitis. Además, la investigación inmunohistoquímica de tejido de hígado humano reveló un aumento significativo de la expresión de proteínas en AKR1B10 esteatohepatitis.
Conclusiones
El desarrollo de la esteatohepatitis se caracteriza por cambios moleculares distintas. Los ejemplos más notables en este sentido fueron
KRT23
y
AKR1B10
, que nos pareció ser altamente expresados diferencialmente en comparación con esteatohepatitis y esteatosis hepática normal. Proponemos que
KRT23
y
AKR1B10
pueden servir como biomarcadores potenciales futuras de la esteatohepatitis, así como marcadores de progresión a carcinoma hepatocelular
Visto:. Starmann J, M Fälth, Spindelböck W, Lanz KL, Lackner C, Zatloukal K, et al. (2012) perfiles de expresión génica revela una relacionada con el cáncer hepático Molecular firmas en la esteatohepatitis pero no en la esteatosis. PLoS ONE 7 (10): e46584. doi: 10.1371 /journal.pone.0046584
Editor: Ala-Kin Syn, Instituto de Hepatología Londres, Reino Unido
Recibido: 5 de Abril, 2012; Aceptado: 2 Septiembre 2012; Publicado: 10 Octubre 2012
Copyright: © Starmann et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la financiación de la Austria Wirtschaftsservice GmbH (AWS) y el austríaco Nationalstiftung a través del marco del programa de investigación IMGuS (Instituto de Medicina y la investigación del Genoma y Biología de Sistemas, Viena). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia. Austria Wirtschaftsservice GmbH es un organismo de financiación pública no comercial organizada como una GmbH sin ánimo de lucro. No era ni participar en cualquier decisión sobre la dirección de la investigación financiada ni en el diseño del estudio; recolección, análisis e interpretación de datos; la escritura del documento; y la decisión de presentar para su publicación. La financiación a través de Austria GmbH Wirtschaftsservice no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
enfermedades del hígado graso comprenden un espectro de gravedad, desde la esteatosis simple sobre esteatohepatitis a cirrosis y cáncer hepatocelular (HCC) [1], [2]. Hay dos causas principales de enfermedad del hígado graso, el alcohol y los trastornos metabólicos saber, asociada al síndrome como la obesidad y la diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Debido a su alta prevalencia y posibilidades de efectos hepáticos graves como la cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular en una fracción sustancial de los individuos afectados, la enfermedad de hígado graso se ha convertido en un problema importante de salud pública. Hasta un 30% de la población en general se ve afectada por la enfermedad de hígado graso no alcohólica (EHNA), alcanzando hasta el 70% entre los pacientes diabéticos [3], [4]. La prevalencia de la esteatosis y esteatohepatitis en pacientes obesos sometidos a cirugía bariátrica es tan alta como 76% y 37%, respectivamente [3], [5]. Esteatohepatitis desarrolla en aproximadamente el 20% de los alcohólicos y hasta 50% de la diabetes tipo 2 que también son obesos (IMC & gt; 30). Esto coloca a la enfermedad del hígado graso como la enfermedad hepática más común de la
st contable siglo 21 para la mayoría de la cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular en los países occidentales. Se espera que su prevalencia aumente aún más a la luz de la actual epidemia de la diabetes y la obesidad [1], [2].
Mientras que la esteatosis simple tiene un curso relativamente benigno y es principalmente reversible, esteatohepatitis lleva un mal pronóstico y puede conducir a daño hepático grave con progresson a cirrosis y carcinoma hepatocelular. marcadores no invasivos convencionales, tales como las transaminasas séricas correlacionan mal con el riesgo de desarrollo, así como la progresión de la enfermedad hepática, y pruebas de función hepática rutinarias disponibles en la actualidad pueden ser incluso nada especial en una proporción significativa de pacientes con esteatohepatitis [6]. Por lo tanto en la práctica clínica estándar actual, los marcadores séricos y de imagen no invasivas no permiten la distinción de hígado graso relativamente benigno de la esteatohepatitis progresiva. Esta situación se traduce en falta de diagnóstico y tratamiento insuficiente de estos trastornos. El desarrollo de estrategias diagnósticas, pronósticas y terapéuticas eficaces se ha visto obstaculizado considerablemente por el hecho de que nuestra comprensión de la patogénesis molecular de la esteatohepatitis es todavía incompleta. Varios estudios demostraron que las diferentes formas de la esteatohepatitis (alcohólica - ASH, no alcohólica - EHNA) no pueden ser morfológicamente distinguen, lo que sugiere un mecanismo patogénico común a pesar de las diferentes etiologías de la enfermedad [7]. Un importante problema sin resolver es la marcada diferencia en el riesgo individual de desarrollar esteatohepatitis y para progresar a cirrosis (por ejemplo, sólo el 20% de los bebedores pesados o 50% del tipo II obesos diabéticos desarrollan esteatohepatitis, hispanos y caucásicos son más susceptibles que los afro estadounidenses [8], [9]). Sin embargo, los factores responsables de la progresión de la enfermedad en todo el espectro de la enfermedad del hígado graso, son poco conocidos. ¿Por qué algunos pacientes están protegidos contra el desarrollo de la esteatohepatitis o esteatosis simple, mientras que otros no lo son, todavía no está claro [10]. En la actualidad se discute si incluso esteatosis y esteatohepatitis representan dos estadios de la enfermedad consecutivos; Como alternativa, los individuos pueden
a priori
ser predeterminada para desarrollar ya sea una esteatosis bastante benigno o esteatohepatitis pronóstico desfavorable [4].
En el presente estudio, hemos realizado la expresión génica basada en el análisis de microarrays de perfiles esteatosis y esteatohepatitis y los comparó con muestras de hígado humano normal. Nos centramos en el análisis de los cambios de la transcripción de genes relevantes en la esteatohepatitis pero no en la esteatosis hepática normal y para identificar posibles firmas como base para el desarrollo de biomarcadores en la discriminación de la esteatohepatitis como una entidad patológica pronóstico más relevante. En particular, el objetivo fue investigar los cambios moleculares entre esteatohepatitis y la esteatosis, en lugar de diferenciar entre la etiología de la enfermedad de NALFD. En general, se validó la expresión de 46 genes diana en las muestras de hígado humano a partir de dos cohortes. Demostramos una firma molecular hasta ahora desconocido para los cambios relacionados con el cáncer en la esteatohepatitis pero no en la esteatosis. Varios genes se expresaron muy significativamente en comparación con esteatohepatitis esteatosis y el hígado normal. La proteína asociada de un gen (
AKR1B10
) se expresó en el tejido esteatohepatitis. La firma genética reportado en este estudio puede servir como una herramienta valiosa para distinguir entre la esteatosis y esteatohepatitis, así como para el desarrollo futuro de biomarcadores de diagnóstico y pronóstico. Por otra parte, los resultados ofrecen importantes conocimientos sobre la patogénesis de la enfermedad, que también puede ser relevante para el diseño de futuras estrategias terapéuticas.
Métodos
muestras de tejido de pacientes
El detallada datos clínicos, bioquímicos e histológicos de los pacientes estudiados se presentan en la tabla 1, 2 y 3. el estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Graz (número EK: 20-119 ex 08/09). Los diagnósticos de todas las muestras utilizadas fueron validados histológicamente por un patólogo certificado por la junta (C. L.) antes del análisis molecular. Para el análisis histológico, hematoxilina y eosina (H & amp; E) y azul chromotrope anilina (CAB) se utilizaron secciones teñidas. Un diagnóstico histológico de esteatosis se hizo si más de 5% de la superficie del parénquima fue ocupada por esteatosis usando H rutina & amp; E de la mancha, mientras que el diagnóstico de la esteatohepatitis (SH) se basó en la presencia de globo hepatocelular en combinación con grados variables de esteatosis y /o la inflamación [11], [12]. Etapa de la fibrosis hepática se evaluó de acuerdo con el sistema de puntuación de la EHNA Red de Investigación Clínica para el hígado graso no alcohólico [13].
Ochenta y siete muestras de dos cohortes independientes de muestras de hígado humano con hepatopatía alcohólica y la enfermedad del hígado graso no alcohólico se utilizaron para este estudio (tabla 4). La primera cohorte ( 'Biobanco cohorte', n = 58) consistía en muestras no neoplásicas de tejido hepático (controles, es decir, hígado normal, n = 18; esteatosis, n = 30; esteatohepatitis, n = 10, de estos 8/2 cirrótico /no cirrótico) obtenidos de pacientes que se sometieron a una resección hepática debido a CHC (n = 7), otras lesiones hepáticas malignas (n = 33, 20/33) el cáncer de colon o tumores hepáticos benignos (n = 7) (tabla 1 y 2 ). Ocho pacientes de los que se obtuvieron muestras de esteatosis habían recibido una quimioterapia con platino-(7/8 FOLFOX) tres meses antes de la resección. Aunque la esteatosis puede ser un efecto secundario del tratamiento con FOLFOX, no había ninguna indicación de que estos casos estaban relacionados con la quimioterapia. Además, se incluyeron muestras de tejido de los hígados de donantes explantados no utilizados para el trasplante (n = 11).
La segunda cohorte ( «grupo de edad Biopsia ', n = 29) abarcó muestras de biopsia hepática percutánea incluyendo esteatosis (n = 13), esteatohepatitis (n = 11, de estos, 5/6 cirrótico /no cirrótico) y la hepatitis C crónica (CHC, n = 5, todo el genotipo 1) como controles de la enfermedad con ausencia de esteatosis. En la cohorte de biopsia, muestras de CHC se utilizaron como controles ya que los pacientes con tejido normal del hígado no se someten a biopsia hepática percutánea (tabla 3). El consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes antes de su uso de una alícuota del tejido de la biopsia hepática para el análisis molecular.
extracción de RNA y de control de calidad
El ARN total fue aislado de las muestras usando TRI Reagent® (Centro de Investigación Molecular, Cincinnati, OH, EE.UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se analizó la calidad del ARN mediante electroforesis capilar se (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Böblingen, Alemania). Sólo las muestras con RIN (ARN número integridad) de 5.0 o más alto se sometieron a análisis de genes gama de expresión.
Illumina experimentos de microarrays y análisis de datos
génica global de expresión proyecciones se realizaron utilizando sólo las muestras del Biobanco ( esteatohepatitis n = 8 (6/2 cirrótico /no cirrótico), esteatosis n = 14 y controles n = 10). Para el análisis de la expresión génica, se utilizó toda la expresión del genoma de microarrays chips de expresión Sentrix® humano-6 v3 talón (Illumina®, San Diego, CA, EE.UU.) que abarcan 49577 características. Los experimentos se llevaron a cabo en el Centro de Genómica y Proteómica de DKFZ Heidelberg utilizando 300 ng /l de ARN y protocolos recomendados por el proveedor.
Los datos en bruto se log2-transformado y cuantil normalizado. Análisis de Componentes Principales (PCA) se realizó para investigar la estructura interna de datos de una manera que mejor explicaron la variación en los datos e identificar posibles valores atípicos. Se utilizó el R-paquete "limma" para identificar genes expresados diferencialmente [14]. Con "limma", un modelo lineal está equipado para cada gen y una prueba t se utiliza para identificar genes diferenciales expresado. P-valores fueron ajustados para múltiples pruebas utilizando el procedimiento Benjamini-Hochberg (BH). Además, se requiere un factor de cambio de al menos 30% para designar un gen expresado diferencialmente. datos resultantes se importó en el software de análisis Ingenuity Pathway (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA, EE.UU.) para identificar exceso o vías insuficientemente representados, así como biomarcadores potenciales.
Los datos mencionados en esta publicación han sido depositado en el NCBI gene Expression Omnibus [15] y son accesibles a través de GEO serie número de acceso GSE33814 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=nrmdhyayykcgavo&acc=GSE33814).
Quantitative PCR en tiempo real
análisis de la expresión génica cuantitativa se realizó con 87 muestras de tejido hepático humano (muestras del Biobanco: 10 esteatohepatitis, 8/2 cirrótico /no cirrótico; 30 esteatosis y 18 controles; muestras de biopsia: 11 esteatohepatitis, 5/6 cirrótico /no cirrótico; 13 esteatosis; 5 controles de la enfermedad de los pacientes con hepatitis C crónica) usando PCR en tiempo real (PCR System LightCycler®480 en tiempo real, Roche Ciencias Aplicadas, Mannheim, Alemania). Aplicamos gen cebador específico y sonda TaqMan® de expresión génica ensayos (Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania) y se realizó la cuantificación relativa de todos los genes.
HPRT1
se utilizó como gen de mantenimiento de la casa para normalizar los datos. El valor Cp se extrajo del software Lightcycler®480 1.5.0 y el nivel de expresión se calculó con la 2
-ΔCp método [16], [17].
La inmunohistoquímica
para el análisis inmunohistoquímico 3 micras de espesor secciones de parafina de tejido hepático de la hepatitis C crónica, hígado graso no alcohólico esteatosis asociada (HGNA) y esteatohepatitis se dewaxed y rehidratada siguiendo los procedimientos estándar. Para la recuperación de antígeno secciones eran calentados en Target Retrieval Solution, pH 9,0 (Dako REAL ™ S2367; Dako, Glostrup, Dinamarca), durante 40 min a 160 W, seguido de enfriamiento durante 20 min a RT. A continuación, las secciones se lavaron en agua y PBS. El bloqueo se llevó a cabo con Dako REAL ™ El bloqueo de solución durante 10 min antes de la incubación con anticuerpos contra la AKR1B10 de la aldosa reductasa (Novus Biologicals, Littleton, CO, EE.UU.) diluido en Dako 1:500 REAL ™ Antibody Diluent durante 60 min a RT. La unión de los anticuerpos se detectó con el Dako EnVision REAL ™ ™ sistema de detección de peroxidasa /DAB
+, Conejo /ratón conduce a un producto de reacción de color marrón rojizo.
AKR1B10 expresión de la proteína detectada en el citoplasma de los hepatocitos se evaluó semicuantitativamente como se indica a continuación. La intensidad de la inmunotinción se clasificó como leve a moderada (puntuación A) o marcada (puntuación B), y la cantidad de hepatocitos positivos fue estimado mediante la aplicación de calificaciones numéricas que se define como:
Partitura A o B 0 : - AKR1B10 inmunotinción en los hepatocitos no se detecta
Partitura a o B 1: - AKR1B10 hepatocitos positivos comprenden menos del 10% del parénquima hepático
ScoreA o B: 2 - AKR1B10 hepatocitos positivos comprenden entre 10 -30% de parénquima hepático
partitura A o B 3: - AKR1B10 hepatocitos positivos comprenden más del 30% del parénquima hepático
la puntuación AKR1B10 fue entonces resulta de la suma de las puntuaciones A y B y representa una estimación de la cantidad y la intensidad de la expresión de proteínas AKR1B10 inmunohistoquímicamente detectable en el parénquima hepático (tabla 5).
resultados
patrón de expresión génica separa claramente la esteatohepatitis desde la esteatosis y controles
para la detección de cambios en la expresión génica hepática que distinguen esteatohepatitis desde la esteatosis, muestras de hígado de pacientes con enfermedad de hígado graso no alcohólico y tanto alcohólica obtenida mediante cirugía (Biobanco) se sometieron a análisis basado en el chip de la expresión de genes Illumina grano. Un total de 32 muestras del Biobanco fueron investigados (tabla 1). Para el análisis de los datos de microarrays, casos ASH y Nash se agruparon en un grupo "esteatohepatitis". Es importante destacar que el objetivo fue investigar los cambios moleculares entre esteatohepatitis y la esteatosis solamente, no entre sus etiologías. Esto parece apropiado, ya que las dos enfermedades , ASH, así como NASH, se caracterizan por un espectro mucho solapamiento de cambios morfológicos [18]. la expresión génica datos se analizaron posteriormente por dos procedimientos de análisis de datos, que consiste en (i) la identificación de genes expresados diferencialmente utilizando limma y (ii) la selección . de los 1000 genes con la mayor variación en el conjunto de datos en las comparaciones por pares, se identificaron 4963 y 2543 genes como significativamente (FDR & lt; 0,05). expresados diferencialmente entre la esteatohepatitis y controles, y esteatohepatitis y la esteatosis, respectivamente, los dos comparaciones, compartieron 1931 genes expresados diferencialmente. las diferencias entre los perfiles de expresión génica de las muestras normales y esteatosis son pequeñas. La varianza dentro de los grupos es alta y debido a eso, la potencia de la prueba estadística no es suficiente para identificar genes expresados diferencialmente de manera significativa entre los dos grupos. El número de genes expresados diferencialmente indica que la esteatohepatitis, en comparación con el tejido normal del hígado, se caracteriza por cambios moleculares más profunda que la esteatosis.
La agrupación jerárquica se utiliza para visualizar los 1931 genes comunes en un mapa de calor (figura 1A ). Con dos excepciones, las muestras de esteatosis y de control agrupados juntos mientras que las muestras esteatohepatitis agrupados en una rama separada. En particular, la combinación de la EHNA y la ceniza no afectó a la agrupación jerárquica. Los genes comunes se dividieron en dos ramas, los genes en la esteatohepatitis el regulado en comparación con esteatosis y los controles (Figura 1 A, grupo 1) o hasta reguladas en la esteatohepatitis en comparación con esteatosis y los controles (Figura 1 A, grupo 2).
A. los genes expresados diferencialmente comunes fueron utilizados para el agrupamiento supervisado. B. agrupamiento no supervisado se realizó con los 1000 genes más variables en los tres grupos de muestras de hígado (esteatohepatitis, rojo; esteatosis, naranja, controles, verde).
Los 1000 genes con la más alta varianza eran utilizado para un agrupamiento no supervisado y una visualización de los resultados en un mapa de calor (figura 1B). Una vez más, con una excepción, las muestras esteatohepatitis agrupadas en una rama separados de muestras de esteatosis y controles. Los genes altamente variantes se dividían en dos clases, que se caracteriza por arriba y abajo de la regulación en la esteatohepatitis en comparación con las muestras restantes. Tomados en conjunto, los dos tipos de análisis arrojaron diferenciales firmas de expresión génica, que claramente separados esteatohepatitis partir de muestras de esteatosis y de control.
Gene ontología [19] El análisis se realizó para el grupo 1 y grupo 2 (tabla 6 y 7, respectivamente ) para identificar los procesos biológicos relevantes de la enfermedad de los genes expresados diferencialmente. En particular, el grupo 1 (aumentada en los controles y la esteatosis) se caracterizó por el metabolismo solamente (reducción de la oxidación, procesos metabólicos, y la biosíntesis). Por el contrario, varias clases de GO en el grupo 2 (upregulated en esteatohepatitis) pertenecían a los procesos moleculares, que son característicos para las enfermedades malignas y la progresión del tumor (de adhesión celular, matriz extracelular, movimiento celular, la señalización de integrina). Este hallazgo sugiere que la esteatohepatitis se acompaña de completamente diferentes programas de expresión génica en comparación con esteatosis y controles. En particular, los programas regulados positivamente en la esteatohepatitis son característicos de enfermedades malignas.
validación de QRT-PCR de datos de microarrays
Un total de 87 muestras de hígado humano fueron utilizados para PCR basado validación de los datos de la matriz (tabla 8 y 9). Para seleccionar de manera óptima genes candidatos para la validación, se emplearon tres estrategias. En primer lugar, se identificaron 265 genes comunes entre los 1931 genes expresados diferencialmente y los 1000 genes con la mayor variación. Este grupo de genes comunes fue analizado por el software basado en web (sistemas de Ingenuity®) IPA®. IPA-Biomarker® se aplicó para identificar biomarcadores candidatos relevantes que podrían ser útiles para distinguir entre la esteatohepatitis y la esteatosis. Se detectaron un total de 126 genes después de la filtración. De este grupo, se seleccionaron 13 genes para una validación adicional, debido a su importante factor de cambio en el análisis de microarrays. En segundo lugar, GO términos de los dos grupos definidos se analizaron sistemáticamente para objetivos potenciales y se eligieron tres genes. En tercer lugar, 17 genes expresados diferencialmente fueron identificados por un valor de p significativo y doble cambio de los datos de microarrays. Además, cinco genes se utilizaron como controles positivos y, además, ocho genes fueron seleccionados debido a la función conocida en el nivel de proteína en la esteatohepatitis (tabla 8). Dentro del proceso de selección de candidatos aplicables, nos hemos centrado principalmente en genes relacionados con el metabolismo, el estrés oxidativo, la inflamación, y su relevancia en la enfermedad de hígado graso. En resumen, se seleccionaron 46 genes para su posterior validación de QRT-PCR.
HPRT1
se utilizó como gen de mantenimiento. La Figura 2 resume los cambios veces de la expresión de los genes seleccionados. Las tasas de verificación de la expresión diferencial de genes eran altas: los cambios - como se determina por QRT-PCR - de la expresión diferencial de genes en 39 muestras del Biobanco esteatohepatitis fueron significativas. Sólo tres genes no fueron desregulados significativamente. En las biopsias, 30 genes fueron significativas, y doce genes no fueron desregulados significativamente. Las razones de la tasa más baja de verificación en las biopsias pueden ser que la mayoría de las muestras analizadas Biobanco ya había sido utilizado para todo el experimento genoma de microarrays (sin cohorte muestra independiente). Cuatro genes (
DCDC2
,
eEF1A2
,
GSTM1
y
STMN2
) podrían no ser medidos de forma fiable en ninguna de las muestras.
La expresión de genes diana seleccionados se determinó en muestras quirúrgicamente recolectados (a) y en muestras de hígado obtenidas por biopsia (B). El cambio veces se calculó mediante la comparación de los tres grupos de muestras de hígado uno contra el otro.
Los genes
ACSL4
,
ATF3
,
CAT
,
GSTM5
y
NR0B2
se ha descrito anteriormente en la enfermedad de hígado graso [20], [21] y sirvieron como controles positivos para la validación cuantitativa de genes candidatos en el estudio presente. El importantes sobre regulación de estos genes de control positivo fue validado en una o ambas de las cohortes analizadas (tabla 8 y 9).
El principal hallazgo apoya la idea de una alteración notable de los programas moleculares en la esteatohepatitis cuando en comparación con muestras de esteatosis y de control. Los genes desregulados Lo más sorprendente en este sentido fueron
AKR1B10
y
KRT23 gratis (figura 3) ya que nuestros datos mostraron una sobreexpresión altamente significativa de ambos genes en la esteatohepatitis.
HPRT1
fue elegido para normalizar la expresión génica en las muestras analizadas. La media de los niveles de expresión normalizados se dan en log2.
El análisis inmunohistoquímico de la expresión AKR1B10 en la esteatosis, esteatohepatitis y la hepatitis crónica C
débil a moderada o marcados citoplasmática y nuclear veces reactividad con anticuerpos contra AKR1B10 se detectó en los hepatocitos de casi todas las muestras de tejido hepático de pacientes con esteatosis y esteatohepatitis de ambos, etiología alcohólicas y no alcohólicas, así como controles de hepatitis C crónica (figura 4 a-F, tabla 5). AKR1B10 expresión en los casos con esteatohepatitis según la evaluación de la puntuación AKR1B10 inmunohistoquímico fue significativamente mayor en comparación con la expresión AKR1B10 en los casos esteatosis y la hepatitis C crónica (p = 0,003 y 0,006, respectivamente). Sin embargo, la expresión AKR1B10 en los tejidos del hígado con esteatosis o hepatitis C crónica no fue diferente (p = 0,351) (Tabla 5). expresión AKR1B10 también fue detectado en el epitelio de algunos de los conductos biliares de tamaño grande o mediano (datos no mostrados).
Sólo áreas representativas se muestran. (A) Caso de la hepatitis C crónica con un espacio porta inflamada con infiltrado linfocitario y la hepatitis de interfase leve (vena central marcada por asterisco, H & amp; E sección teñida). (B) sección consecutiva de la zona que se muestra en (A). Sólo un grupo de unos hepatocitos centrilobulares exhibe inmunotinción AKR1B10 citoplasmática y nuclear (vena central marcada por asterisco). (C) Caso del hígado graso con marcada esteatosis macro y mediovacuolar predominantemente de los hepatocitos centrilobulares y medianas zonales (vena central marcada por asterisco; H & amp; E manchadas sección). (D) sección consecutiva de la zona que se muestra en (C) de los hepatocitos con cambios grasos muestran la tinción de la llanta de citoplasma no ocupada por la grasa con AKR1B10 anticuerpos (vena central marcada por asterisco). Caso (E) de la esteatohepatitis en un hígado cirrótico con nódulo parénquima abuting un tabique fibroso con reacción ductular suave. Muchos hepatocitos muestran cambios grasos y algunos de ellos se caracterizan por un citoplasma ampliada, ligeramente manchado (hepatocitos se infló) e inclusiones citoplasmáticas eosinofílicas irregulares (cuerpos de Mallory-Denk, BMD; insertado con mayor proyección de aumento abombada hepatocitos contienen BMD; H & amp; sección E manchadas ). (F) sección consecutiva de la zona que se muestra en (E). Muchos de los (hepatocitos insertado con mayores demostraciones de aumento disparado con MDB) de tamaño normal, así como los hepatocitos se disparó muestran inmunotinción citoplasmática moderada con anticuerpos AKR1B10 mientras que los BMD no teñirse.
Discusión
El presente estudio revela la expresión de genes firmas esteatohepatitis profundamente distintiva de la esteatosis hepática y normal. En particular, el tejido normal y la esteatosis agrupan más estrechamente entre sí en comparación con las muestras esteatohepatitis. Desde la agrupación jerárquica demostró claramente los perfiles de expresión comunes para muestras con EHNA y cenizas, no se hizo ninguna otra distinción entre las diferentes etiologías. Por otra parte, ambas etiologías se manifiestan con un espectro amplio solapamiento de las características clave histológicas (por ejemplo centrilobulillar características basadas de esteatosis, inflamación e hinchamiento hepatocelular, así como la fibrosis pericellular) [7], [18].
Los datos de expresión génica sugiere que la esteatohepatitis exhibe perfiles moleculares que son característicos para los procesos pertinentes en los tumores malignos y por lo tanto pueden reflejar un estado premaligno de enfermedad hepática ya en la etapa precirrhotic (tabla 7). De hecho, el aumento de la evidencia apoya el hecho de que la esteatohepatitis pueden progresar a HCC ya en la etapa precirrhotic [22]. La obesidad y la diabetes no sólo se establecen los factores de riesgo para el desarrollo de la esteatohepatitis y cirrosis, pero también se han implicado en la formación de HCC. Otros de los principales factores de riesgo para el CHC en la esteatohepatitis se hacen avanzar la edad y la fibrosis del tejido. Los mecanismos que subyacen a la progresión de la esteatohepatitis en HCC aún no están claros y objetivos para el tratamiento de la esteatohepatitis y el CHC faltan. Sin embargo, las vías implicadas en la inflamación y la resistencia a la insulina esteatohepatitis promoción de señalización, puede contribuir a su potencial carcinogénico.
La expresión génica de los 46 genes seleccionados fue validado por QRT-PCR para las dos cohortes muestra analizada. Aunque las muestras analizadas fueron recogidos por diferentes enfoques, y para las muestras de biopsia se utilizaron muestras de la hepatitis C crónica como controles (ya que la biopsia hepática percutánea no se realiza en individuos con enfermedad hepática normal), se han encontrado muchos genes desregulados significativamente en los tres grupos de prueba de muestras de hígado en ambas cohortes de muestras independientes (tabla 1-3). A pesar de la diferencia en el porcentaje de casos con cirrosis entre las dos cohortes (80% en las muestras quirúrgicas, y el 45% en biopsias),
AKR1B10
, así como
KRT23
fueron significativamente alto expresado en tanto cohortes de muestra. Esto indica mecanismos patogénicos comunes en la esteatohepatitis alcohólica tanto y no alcohólicas. Entre los genes expresados diferencialmente,
AKR1B10
y
KRT23
fueron los más destacados. AKR1B10 pertenece a las reductasas de aldosa y fue descrito por primera vez en humanos HCC [23], [24]. Es una enzima monomérica reducción de aldehídos y cetonas a los alcoholes correspondientes. La proteína se expresa en el cáncer de cuello uterino y cáncer de pulmón de células no pequeñas, donde se le considera como un potencial biomarcador de diagnóstico [25], [26], [27]. Varios hallazgos también apoyan la hipótesis de que
AKR1B10
puede ser un marcador útil para la diferenciación y la proliferación de hígado, colon, pulmón y cáncer de mama [28], [29], [30]. Además, la proteína AKR1B10 juega un papel en la destoxificación de aldehídos tóxicos. Los radicales libres generados por especies reactivas del oxígeno se oxidan los ácidos grasos de la membrana lipídica que resulta en la producción de aldehídos reactivos, que se reducen rápidamente por AKR1B10 células, protegiendo así de toxification [31], [32]. Lipotoxicidad de ácidos grasos y metabolitos intermedios de lípidos puede ser un evento clave en la progresión de la enfermedad de hígado graso mediante la inducción de la muerte hepatocelular. En el presente estudio, se presenta la sobreexpresión significativa de
AKR1B10 Hoteles en esteatohepatitis que podría ser causada por el aumento de la necesidad de inactivar los componentes tóxicos en los hepatocitos. Esto sugiere que
AKR1B10
puede ser un marcador molecular que acompaña a la progresión de la esteatohepatitis a HCC.
Los genes implicados en la partición de lípidos manteniendo ácidos grasos potencialmente lipotóxico almacenados en triglicéridos neutros (TG) puede contrarrestar /proteger de la lipotoxicidad como un factor potencialmente importante en la progresión de NAFLD a esteatohepatitis [33]. Cabe destacar que algunos de los genes que se encontraron para ser desregulado incluye enzimas que participan en la homeostasis del FA como DGAT2 (responsables de la FA esterificación de los TG) y PNPLA3 (adiponutrin), recientemente identificado como un factor determinante para la patogénesis y progresión de la alcohólica y la no enfermedad alcohólica del hígado graso [34], [35].
Además, se describe la sobreexpresión altamente significativa de
KRT23 Hoteles en comparación con esteatohepatitis y esteatosis hepática normal.
KRT23
se ha detectado en diferentes tipos de cáncer. En el cáncer de colon microsatélites estables,
KRT23
expresión es altamente incrementado, y esto puede tener una función protectora contrarrestar la proliferación y supervivencia de las células [36]. Otro estudio identificó KRT23 como un antígeno asociado a HCC en sueros de pacientes [37].
KRT23
todavía no se ha descrito que se expresa en el hígado o enfermedad del hígado. El papel de KRT23 en condiciones fisiológicas y en la esteatohepatitis es desconocida. Sin embargo, las mutaciones de otros miembros de la familia multigénica de queratina, es decir, las queratinas 8 y 18, se han encontrado para ser asociado con la enfermedad de hígado humano crónica. Por otra parte, las alteraciones de los niveles de expresión de queratinas 8 y 18 condujeron a la formación de cuerpos de Mallory-Denk, una importante característica morfológica de la esteatohepatitis [38], [39].