Extracto
Antecedentes y objetivos
activación de EGFR y la expresión PKM2 son instrumentales en la tumorigénesis. la activación del EGFR regula las funciones PKM2 de una manera dependiente de compartimento subcelular y promueve la transcripción de genes y el crecimiento tumoral. Además, PKM2 está regulada positivamente en las vías de EGFR inducida por tumores malignos en glioma. Sin embargo, encontramos que PKM2 también podría regular la actividad de la vía de señalización /EGFR EGF en células de cáncer gástrico. El objetivo fue definir los mecanismos biológicos para PKM2 en la regulación del motilidad celular y la invasión.
Métodos
Hemos empleado transfección estable con ARN de horquilla corta para silenciar la expresión de manera estable en el PKM2 BGC823, SGC7901 y líneas celulares de cáncer gástrico AGS. Los efectos de PKM2 in vitro se determinaron mediante la evaluación de la migración celular y la invasión. Se utilizó el análisis inmunohistoquímico para explorar la relación entre PKM2 y otras proteínas.
Resultados
Nuestros resultados indican que la caída de PKM2 disminuyó la actividad de E-cadherina y mejoró la vía de señalización EGF /EGFR en las líneas de células gástricas y BGC823 SGC7901 que fueron positivos para la expresión de e-cadherina. Sin embargo, en la línea celular de carcinoma gástrico indiferenciado AGS, que carece de la expresión de E-cadherina, PKM2 promueve la migración celular y la invasión. Los análisis inmunohistoquímicos mostraron que los niveles de expresión de E-cadherina, ERK1 /2 fosforilación, y la expresión citoplasmática PKM2 se correlacionaron entre sí
Conclusión:.
PKM2 puede desempeñar diferentes funciones en gástrica diferente diferenciada tipos de células cancerosas, y este hallazgo sería consistente con la investigación clínica anterior. Los resultados de nuestro estudio revelan un vínculo importante entre PKM2 y E-cadherina en la motilidad celular de cáncer gástrico estimulada por EGFR y la invasión
Visto:. Wang LY, Liu YP, Chen LG, Chen YL, Tan L, Liu JJ, et al. (2013) El piruvato quinasa M2 desempeña un doble papel en la regulación de la señalización /EGFR EGF a través de Modalidad E-cadherina-dependiente en células de cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (6): e67542. doi: 10.1371 /journal.pone.0067542
Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 7 Febrero, 2013; Aceptado: 20-may de 2013; Publicado: 28 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30971362, 81072013 & amp; 91.229.201), Fondos de investigación Fundamental para las universidades centrales en China (Nº 2010111082) y la Fundación para el Ministerio de Salud del Estado clave Departamento clínico. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
piruvato quinasa (PK) media la etapa limitante de la velocidad final del la glucólisis por catalizar la desfosforilación de fosfoenolpiruvato (PEP) en piruvato para producir una molécula de ATP. Las células de mamíferos tienen cuatro isoenzimas de piruvato quinasa (M1, M2, L y R), que se expresan selectivamente en diferentes tipos de células y tejidos [1]. En los mamíferos, la isoforma M1 (PKM1) se expresa en la mayoría de los tejidos adultos. La isoforma M2 (PKM2), una variante de corte y empalme alternativo de M1, se expresa durante el desarrollo embrionario [2]. Los estudios han encontrado que las células cancerosas expresan exclusivamente PKM2 [3], [4]. PKM2 ha demostrado ser esencial para la glucólisis aeróbica en los tumores (efecto Warburg). A través de los años, los avances significativos se han hecho en la comprensión de la función y regulación de PKM2 como una piruvato quinasa y la proteína quinasa en las células cancerosas [5]. Un estudio reciente confirmó que el PKM2 inducida por el factor de crecimiento epidérmico (EGF) se transloca en el núcleo de células de glioblastoma, interactúa con β-catenina y conduce a la expresión cyclinD1, que promueve la proliferación celular y la tumorigénesis [6]. Estos resultados revelan un nuevo papel para PKM2 como un coactivador transcripcional. Sin embargo, existen algunas controversias con respecto a la especificidad y el potencial de PKM2 como un objetivo anti-cáncer en la terapia del cáncer. Un hallazgo reciente reveló que la expresión PKM2 está fuertemente correlacionada con la diferenciación de cáncer gástrico. tipos diferenciados de los cánceres expresan mayor cantidad de proteínas PKM2 de hacer las indiferenciadas. PKM2 era un factor pronóstico adverso en el cáncer gástrico de células en anillo de sello [7]. El papel biológico de PKM2 en diferentes fases de diferenciación y en el desarrollo de cáncer gástrico tiene que ser estudiada posteriormente
.
Estudios anteriores con respecto a PKM2 se han centrado en el metabolismo del tumor y el crecimiento tumoral. Ha habido sólo unos pocos informes sobre la metástasis tumoral. E-cadherina juega un papel crítico en el mantenimiento de la integridad epitelial, y la pérdida de E-cadherina afecta el repertorio adhesivo de una célula [8]. Estudios previos [9] in vitro han demostrado que la pérdida de E-cadherina en líneas celulares de carcinoma humano se asocia con pobre diferenciación y una morfología fibroblastoid. La activación dependiente de EGF del EGFR se ha informado de que se inhibió de una manera E-cadherina adhesión dependiente, que inhibe la activación dependiente de ligando de diversos receptores tirosina quinasas [10]. Nuestra investigación demostró que la caída de PKM2 disminuyó la actividad de E-cadherina y mejora de la vía EGF /EGFR señalización en las líneas celulares BGC823 y SGC7901 que fueron positivos para la expresión de E-cadherina. Sin embargo, en la línea celular de carcinoma gástrico indiferenciado AGS, que carece de la expresión de E-cadherina, PKM2 promueve la migración celular y la invasión. El objetivo de este estudio fue determinar la función y el mecanismo de PKM2 en relación con la motilidad celular en líneas celulares diferenciadas de manera diferente.
Materiales y Métodos
Cultivo celular, transfección y Condiciones
las líneas celulares de cáncer gástrico humano BGC823 (pobremente diferenciado, según el proveedor) y SGC7901 (moderadamente diferenciado) se cultivaron en medio RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.). La línea de células AGS (indiferenciado) se cultivó en medio F12K. Todas las células se cultivaron en medio que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco, Detroit, MI, EE.UU.) y 100 IU /ml de penicilina-estreptomicina a 37 ° C en un 5% CO
2 atmósfera humidificada. La línea celular de cáncer gástrico humano AGS se ordenó desde la American Type Culture Collection (ATCC, EE.UU.), y las líneas celulares de cáncer gástrico humano SGC7901 y BGC823 se obtuvieron de Centro de China para la Colección de Cultivos Tipo (Shanghai, China). células SGC7901, BGC823 y AGS se transfectaron con el siPKM2 (pcPUR + U6-siPKM2) o la PU6 plásmido (pcPUR + U6-siRenilla) utilizando Fugene HD (Roche, Indianapolis, IN). Puromicina (0,1 mg /ml) se utilizó para la detección de clones transfectados de manera estable. La expresión de la proteína PKM2 se examinó con el análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo contra PKM2 para validar la capacidad de las construcciones para inhibir la expresión del gen diana; Estos experimentos se repitieron tres veces. Los cultivos de células se hicieron en reposo por su cultivo hasta la confluencia, y el medio se reemplazó con medio fresco que contenía 0,5% de suero durante 1 día. EGF con una concentración de 100 ng /ml final se utilizó para la estimulación celular. EGF se obtuvo de Señalización Celular Tecnología.
Derribo estable de PKM2 y sobreexpresión de la PKM2
Un plásmido que contiene una secuencia de ARN de interferencia que dirige el gen PKM2 en BGC823, las células AGS SGC7901 y fue construido. El oligo sentido para la secuencia siPKM2 fue 5'-CACCGCGGCAAGATTTATGTGGAACGTGTGCTGTCCGTTCCACGTAGATCTTGCTGCTTTTT-3 'y el oligonucleótido antisentido fue 5'-GCATAAAAAGCAGCAAGATCTACGTGGAACGGACAGCACACGTTCCACATAAATCTTGCCGC-3'. El BGC-823, SGC-7901 y las células AGS se transfectaron con pcPUR + U6-siPKM2 o pcPUR + U6-siRenilla (control) y se seleccionaron como clones resistentes a la puromicina. Se realizó análisis de transferencia de Western para confirmar la supresión PKM2. Un plásmido que contiene la secuencia PKM2 cDNA se obtuvo de Invitrogen. El BGC-823, SGC-7901 y las células AGS fueron transfectadas con pcDNA6.0-PKM2 o pcDNA6.0-mock (control) y seleccionado como clones resistentes a blasticidina. Western blot se realizó para confirmar la expresión PKM2.
extracción de proteínas y Western blot
Las células se resuspendieron en tampón de lisis que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa, y las proteínas extraídas se separaron usando 8-10% en geles de SDS-PAGE. ß-tubulina se utilizó como control de carga. Los anticuerpos contra cadherina E y P-E-cadherina se obtuvieron de Epitomics. El fosfo-EGFR (Tyr1068),,, fosfato ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) anticuerpos fosfo-PLCγ1 (Tyr783) fosfo-AKT (Ser473) fosfo-Gab1 (Tyr627), fosfo-c-CBL (Tyr700), y se obtuvieron de Cell Signaling Technology.
la extracción de RNA, transcripción reversa y PCR en tiempo real
el ARN total fue extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, CA, EE.UU.). Las muestras se trataron a continuación con DNasa durante 15 minutos a temperatura ambiente, y el ARN se purificó adicionalmente usando un kit de ARN de limpieza (Qiagen, CA, EE.UU.). La reacción de transcripción inversa (RT) para la primera hebra de síntesis de ADNc se realizó utilizando la transcriptasa inversa (Bio-Rad) con 2 g de ARN total. Quantitative análisis RT-PCR se realizó con el ABI 7500 (Applied Biosystems), y los niveles de expresión génica para cada muestra individual se normalizaron a GAPDH. Se determinó la expresión media génica relativa y las diferencias se calcularon utilizando el método 2 de la electroforesis en gel de agarosa
-ΔΔCt. Las secuencias de los cebadores de RT-PCR fueron las siguientes: sentido 5'-TGTGGGAATCCGACGAATG-3 'y antisentido 5' GTCATATGGTGGAGCTGTGGG-3 'para la N-cadherina; sentido 5'-CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3 'y 5' antisentido AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3 'para E-cadherina; sentido 5'-TGTATGGGGAACTGCTGACA-3 'y antisentido 5' GCGTTCATCCTCATCGAAGT-3 'para MMP7; sentido 5'-CGACAGTCAGCCGCATCTT-3 'y antisentido 5'-CCCCATGGTGTCTGAGCG-3' para GAPDH.
Ensayo de proliferación celular
La proliferación celular se midió usando el Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kamimashiki gun, Kumamoto, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron en cuatro placas de 96 pocillos a una densidad de 2 x 10
3 células /pocillo. Una placa fue sacado a la misma hora todos los días después de que las células se habían adherido a los pocillos. La absorbancia se midió con un lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Transwell invasión y la herida ensayos curativos
El transwell ensayos de invasión se realizaron con insertos de 8,0 micras de poro en un 24 pocillos Transwell plato. La membrana basal se hidrató con 500 l de medio RPMI 1640 libre de suero o F12K 30 min antes de su uso. Para el ensayo de invasión, se añadieron las líneas celulares de cáncer gástrico a la cámara superior de un transwell con 0,5 mg /ml de colágeno tipo l (BD Bioscience, San Jose, CA) presenta el revestimiento filtros. RPMI 1640 o medio F12K con suero bovino fetal al 10% y 1% de cada antibiótico se añadió a la cámara inferior. El BGC y 7901 células se incubaron durante 36 horas. Las células se incubaron durante 24 horas AGS. Las células invasoras se cuantificaron después de la tinción violeta de genciana. Cada experimento se realizó por triplicado, y los datos se expresaron como valores medios. El ensayo de cicatrización de heridas se realizó en placas de 6 pocillos. Las células tumorales en un medio que contenía FBS al 10% fueron sembradas en placas de 6 pocillos (Corning, CA). Los cultivos de células se hicieron en reposo por su cultivo hasta la confluencia, y el medio se reemplazó con medio fresco que contenía 0,5% de suero durante 1 día. Las heridas en la monocapa se hicieron con puntas de pipeta estériles. Entonces EGF con una concentración de 100 ng /ml final se utilizó para la estimulación celular. Después, las células se lavaron con PBS y se actualizan con medio que contiene 10% de FBS. Las fotografías fueron tomadas a 0 y 24 h. Todos los experimentos se realizaron por triplicado
Declaración de Ética
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética (n: 20081012). En el Hospital Zhongshan afiliado a la Universidad de Xiamen, Xiamen, provincia de Fujian, China, y obtuvimos declaraciones de consentimiento por escrito de todos los participantes involucrados en este estudio.
Preparación de muestras de tejido
muestras de tejido tumoral se obtuvieron de 15 pacientes con cáncer gástrico diferentes que fueron sometidos a resección curativa en el hospital Zhongshan, Universidad de Xiamen, Xiamen, china. Se recogió una serie independiente de los correspondientes tejidos no cancerosos adyacentes de 15 de los mismos pacientes al mismo tiempo. Todas las muestras de tejido se recogieron y se dividen en dos partes inmediatamente después de la resección del tumor. Una parte se recogió en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 ° C hasta que el ARN y la proteína de extracción. La otra parte se fijó en formaldehído al 4% y embebidos en parafina para el análisis histológico (hematoxilina eosina y tinción IHC). Todas las muestras fueron confirmados por diagnóstico patológico (el diagnóstico histopatológico se basó en criterios de la OMS). Todos los casos experimentales se agruparon acuerdo-ción a la Unión Internacional contra el Nodo-metástasis tumoral-sistema de Cáncer (TNM) (revisada en 2002).
La inmunohistoquímica
secciones de parafina de cuatro micras de espesor o bien fueron teñidas con hematoxilina y eosina (H & amp; e) o se analizaron para PKM2, p-ERK1 /2 y e-cadherina expresión por inmunohistoquímica. La inmunohistoquímica se realizó de acuerdo con los procedimientos que fueron recomendados por el fabricante. Las reacciones se visualizaron utilizando diaminobenzidina como sustrato cromogénico. Las secciones se counterstained utilizando hematoxilina y luego se aclararon y montaron. Se detectó la densidad media (IOD /área) en diferentes áreas positivas de los 15 especímenes de cáncer gástrico humano utilizando Image-Pro Plus software.
Análisis estadísticos
Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS versión 13. 0 (SPSS, Inc.) de software. Las muestras independientes y la prueba t de análisis de correlación se utilizaron para comparar los datos. Todos los valores se expresan como las medias ± SD. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a
P
. & lt; 0,05
Resultados
El agotamiento de PKM2 Promovido migración celular y la invasión en BGC823 y SGC7901 células con EGF estimulación
la expresión de la proteína PKM2 en las líneas celulares de cáncer gástrico BGC823, SGC7901 y AGS se evaluó mediante análisis de transferencia Western. Estas líneas celulares mostraron un alto nivel de expresión PKM2. Entonces, las líneas celulares de cáncer gástrico estables con una expresión alterada PKM2 se establecieron utilizando la interferencia de ARN (PKM2 knockdown) en las células BGC823, SGC7901 y AGS. Como se muestra en la Fig. 1A, se establecieron las líneas celulares BGC823, SGC7901 y AGS con PKM2 desmontables. Hemos observado que la proliferación se redujo en las células BGC823 y AGS después PKM2 se agotó (Fig. 1B). Estos resultados están de acuerdo con estudios previos.
células (A) BGC823, SGC7901 y AGS fueron transfectadas establemente con shRNA dirigido contra PKM2. La caída específica de PKM2 fue supervisado por inmunotransferencia (parte inferior). Las células transfectadas de manera estable con pcPUR + U6-siPKM2 se conocen como siPK, y las transfectadas con pcPUR + U6-siRenilla se conocen como pU6. (B) La proliferación de las células transfectadas de manera estable. El número de células se determinó con el ensayo de CCK-8, y se muestra el número relativo de células. (C, D) Una herida en forma de cruz se ha creado en la monocapa, y el BGC823 y SGC7901 células transfectadas de forma estable se cultivaron durante 24 horas adicionales con EGF (100 ng /ml). se muestran imágenes representativas de la región heridos. Los resultados del ensayo de migración también se muestran como gráficos (* p & lt; 0,05). (E, F) El potencial invasión de la BGC823 y SGC7901 células estables se evaluó mediante el ensayo de cámara transwell BD con 100 ng /ml de EGF en la cámara inferior durante 36 horas. Las células que migraron a la parte inferior del filtro se tiñeron, se fotografiaron y se contaron. Los datos se expresan como la media ± SD de tres experimentos independientes (* p & lt; 0,05).
Para examinar el efecto de PKM2 sobre la migración celular y la invasión, se empleó bien establecida la cicatrización de heridas y transwell ensayos para caracterizar la respuesta de la motilidad celular en el BGC823 y SGC7901 células. Una capa confluente de células se incubó primero durante la noche en medio, una herida cero se introdujo, se añadió medio que contiene la dosis más adecuada de EGF (100 ng /ml) para estimular la migración, y se observó el porcentaje de sellado de la herida después de 24 h ( Figura S1). Las células invasoras se cuantificaron 36 h después de EGF (100 ng /ml) se añadió a la cámara inferior. Los resultados indican que el tratamiento de BGC823-sipk y células SGC7901-sipk con EGF después de una herida de cero y en la transwell aumentó significativamente la tasa de cicatrización de la herida (Fig. 1 C, D) y la invasión (Fig. 1 E, F) en comparación con la de las células control.
el agotamiento de PKM2 disminución de la expresión de e-cadherina y mejorado las actividades de la EGF /EGFR señalización corriente abajo Caminos PLC-γ1 y ERK1 /2
Para investigar la mecanismo de los cambios en la migración celular y la invasión después de la caída de PKM2, se analizó la expresión de los miembros de la Ca
2 + -dependiente de moléculas de adhesión celular familia y metaloproteinasas. Se encontró que los niveles de expresión de la proteína E-cadherina se redujo en BGC823 y SGC7901 células cuando la expresión PKM2 se redujo (Fig. 2A).
(A) E-cadherina, fosfo-cadherina E y N-cadherina expresión niveles se analizaron por análisis de inmunotransferencia en BGC823 y SGC7901 células estables. (B) E-cadherina y N-cadherina niveles de expresión fueron analizados por cuantitativa en tiempo real PCR en BGC823 y SGC7901 células estables. (C) BGC823 y SGC7901 células estables fueron expuestas a EGF (100 ng /ml) a diferentes tiempos. Se muestran las transferencias Western de lisados celulares. El fosfo-EGFR (Tyr1068), se muestran los niveles de proteína fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) fosfo-PLCγ1 (Tyr783), fosfo-AKT (Ser473), y como se indica. (D) MMP7 los niveles de expresión fueron analizados por cuantitativa en tiempo real PCR en BGC823 y SGC7901 células estables. Las barras de error representan la media ± desviación estándar de tres experimentos (* p & lt; 0,05).
El nivel de E-cadherina ARNm y la fosforilación de la E-cadherina se determinaron en BGC823 y SGC7901 células con depleción PKM2 para evaluar si la diferencia observada en la expresión de E-cadherina se produjo antes o después de la traducción. Hemos observado la baja regulación de la E-cadherina ARNm y aumento de la fosforilación, lo que induce la endocitosis de la E-cadherina, en las células PKM2-empobrecido (Fig. 2A, B). También se encontró que el nivel de expresión de la proteína N-cadherina se incrementó en las líneas celulares BGC823 y SGC7901 cuando PKM2 se agotó (Fig. 2A).
La migración celular y la invasión están regulados en gran medida por la actividad de EGFR. Para analizar si el EGFR está implicado en la migración y la invasión de BGC823 y SGC7901 células, estas células se trataron con EGF, que se une al EGFR y activa las vías de señalización corriente abajo. El tratamiento EGF resultó en la fosforilación del EGFR y la posterior activación de la PLCγ1, AKT y Erk1 /2 vías (Fig. 2C). Se encontró que el PLC γ1 tenía un mayor nivel de actividad en las células PKM2 empobrecido que en las células de la ONU-agotado después de ya sea un (24 h) de incubación corto o largo con EGF. Sin embargo, no hubo una diferencia marcada en la actividad AKT entre las células PKM2 empobrecido y agotadas las células-un. PLCγ es un regulador clave de la migración celular aguas abajo de RTK de señalización [11]. La fosforilación de la tirosina en el residuo de 783 de PLCγ1 es crítica para su activación [12]. activación PLCγ1 mejora la motilidad celular, y se observó este efecto en los ensayos de cero herida y transwell, como se observa en la Fig. 1C.
A continuación se investigó el efecto de un ligando de EGFR sobre la expresión de MMPs utilizando RT-PCR en BGC823-sipk y células SGC7901-sipk en comparación con sus respectivas células de control. El tratamiento con el ligando de EGFR, EGF, aumentó la expresión de MMPs en el nivel de la transcripción en BGC823 y SGC7901 células. Sin embargo, no hubo diferencias obvias en los niveles de expresión de MMP2 y MMP9 entre las células PKM2-agotado y sus células de control (datos no mostrados). MMP7 expresión fue hasta reguladas en las células PKM2-empobrecido con tratamiento con EGF (Fig. 2D). Las vías ERK /MAPK juegan un papel crítico en la expresión MMP7 inducida por ligandos de EGFR. Por otra parte, se observó un aumento evidente en la actividad de ERK1 /2 después de 0 horas y las 24 h de tratamiento con EGF en las células PKM2-agotado.
El agotamiento de PKM2 atenuada la motilidad de las células AGS y los cambios funcionales después de rescatar PKM2 en líneas celulares de cáncer gástrico
la expresión de la proteína e-cadherina en las líneas celulares de cáncer gástrico BGC823, SGC7901 y AGS se evaluó con el análisis de Western blot. Las líneas celulares BGC823 y SGC7901 expresan E-cadherina. En contraste, las células AGS carecen de la expresión de E-cadherina (Fig. 3A).
(A) E-cadherina niveles de expresión se detectaron mediante análisis de inmunotransferencia de células BGC823, SGC7901 y AGS. (B) Una herida en forma de cruz se ha creado en la monocapa, y las células estables AGS se cultivaron durante 24 h adicionales con EGF (100 ng /ml). se muestran imágenes representativas de la región heridos. Los resultados del ensayo de migración también se muestran como gráficos (* p & lt; 0,05). (C) El potencial de invasión de las células estables AGS se evaluó usando el ensayo de cámara transwell BD con 100 EGF ng /ml en la cámara inferior durante 24 horas. Las células que migraron a la parte inferior del filtro se tiñeron, se fotografiaron y se contaron. (D) La expresión de p-EGFR, E-cadherina en la PKM2 rescatar experimentos con el método transfectadas de forma estable mediante el uso de sobre-expresión plásmido vector pcDNA6.0 células de forma simulada y pcDNA6.0-PKM2 en BGC823 y AGS, que desmontables estable PKM2. (E) Los cambios funcionales de la migración celular y la invasión después de PKM2 rescate. Los datos se expresan como la media ± SD de tres experimentos independientes (* p & lt; 0,05).
Para examinar el efecto de PKM2 caída en la migración celular y la invasión de células AGS, hemos empleado bien establecidos cicatrización de heridas y ensayos transwell para caracterizar la motilidad celular. Una capa confluente de células se incubó primero durante la noche en medio, un rasguño herida se introdujo, se añadió medio que contenía EGF (100 ng /ml) para estimular la migración, y se observó el porcentaje de sellado de la herida después de 24 h. Las células invasoras en el ensayo transwell se cuantificaron 24 h después de EGF (100 ng /ml) se añadió a la cámara inferior. Para nuestra sorpresa, hemos encontrado que el tratamiento de células AGS-sipk con EGF después de la herida y de cero en el transwell se redujo significativamente la tasa de sellado de la herida y la invasión en comparación con la de las células de control (Fig. 3B, C). Hubo diferencias notables entre el BGC823 /SGC7901 y las células AGS.
Para ilustrar aún más el papel de PKM2 en la motilidad celular, hicimos el PKM2 rescatar experimentos. Nos Tomados de forma estable método transfectadas mediante el uso de un exceso de expresión vector plásmido pcDNA6.0-maqueta y pcDNA6.0-PKM2 para hacer frente a BGC823 y AGS células que desmontables estable PKM2. La expresión de p-EGFR, E-cadherina se muestra en los experimentos PKM2 rescate (Fig. 3D). Hemos observado que cuando la expresión PKM2 recuperó, la fosforilación de EGFR se ha reducido significativamente en BGC823 células y el aumento en las células AGS. Por otra parte, la motilidad celular de células BGC823 se disminuyó y se redujo células AGS después PKM2 rescate (fig. 3E). Para aclarar el mecanismo de estas diferencias, a continuación, analizamos la actividad de la vía de señalización del EGF /EGFR.
PKM2 Enhanced las actividades de las vías de señalización aguas abajo EGF /EGFR en células AGS y se correlacionó con la actividad de ERK en Gástrico las muestras del cáncer
para analizar si el EGFR puede estar implicado en la migración y la invasión de las células AGS, estas células fueron tratadas con EGF, que se une al EGFR y activa las vías de señalización corriente abajo. tratamiento EGF resultó en la fosforilación del EGFR y la posterior activación de las vías aguas abajo de EGFR, incluyendo el PLCγ1 y ERK1 /2 vías (Fig. 4A). Se encontró que las actividades de PLCγ1 y ERK1 /2 fueron mayores en las células donde PKM2 no se había agotado que en las células PKM2-agotado después de ya sea un (24 h) de incubación corto o largo con EGF. Este resultado es el contrario de lo que se observó con el BGC823 y SGC7901 células; en células AGS, PKM2 entró en juego como un estímulo y promueve la migración celular y la invasión. A continuación se investigó la expresión de MMP7 usando RT-PCR en las células AGS-sipk y las células de control. El tratamiento con EGF expresión mejorada MMP7 a nivel de la transcripción en células AGS-PU6 pero no en células AGS-sipk (Fig. 4B). La actividad de ERK1 /2 era obviamente mayor en las células AGS-PU6 comparación con las células AGS-sipk después de 0 h y 24 h de tratamiento con EGF (Fig. 4A).
(A) AGS células estables fueron expuestos a EGF (100 ng /ml) a diferentes tiempos. Se realizaron transferencias Western de lisados celulares. El fosfo-EGFR (Tyr1068), fosfo-PLCγ1 (Tyr783), se muestran los niveles de proteína fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) fosfo-Gab1 (Tyr627), fósforo-c-CBL (Tyr700), y como se indica. (B) MMP7 los niveles de expresión fueron analizados por cuantitativa en tiempo real PCR en células estables AGS. Los datos se expresan como la media ± SD de tres experimentos independientes (* P & lt; 0,05). (C) IHC tinción con los anticuerpos indicados se realizó en 15 muestras de cáncer gástrico humano. fotos representativas del tumor, las cuales fueron tomadas en la misma parte de la misma pieza de tejido, se muestran. (D) El análisis de correlación entre PKM2, E-cadherina y P-ERK1 /2 se completó utilizando el software Image-Pro Plus. Se detectó la densidad media (IOD /área) en diferentes áreas positivas de 15 muestras de cáncer gástrico humano. Se determinó el análisis de correlación entre PKM2 y E-cadherina en un área positiva E-cadherina. Se determinó el análisis de correlación entre PKM2 y p-ERK1 /2 en un área negativa E-cadherina.
A continuación realizó inmunohistoquímica (IHC) analiza para examinar la expresión de E-cadherina, localización PKM2 y ERK1 /2 fosforilación en secciones en serie de 15 especímenes de cáncer gástrico humano usando anticuerpos con especificidades validados. La Figura 4C muestra que los niveles de expresión de E-cadherina, ERK1 /2 fosforilación, y la expresión citoplasmática PKM2 fueron correlacionados entre sí. Además, se observó un alto nivel de ERK1 /2 fosforilación en el núcleo de las células cancerosas sin expresión de E-cadherina. En las zonas de ERK1 /2 fosforilación, también encontramos niveles más altos de expresión PKM2. Sin embargo, no hemos encontrado la fosforilación de ERK1 /2 en las zonas positivas para la expresión de E-cadherina (Fig. 4C). Se realizó un análisis de correlación entre PKM2, E-cadherina y P-ERK1 /2 utilizando Image-Pro Plus software (Fig. 4D). La densidad media (IOD /área) fue grabado en diferentes áreas positivas de 15 muestras de cáncer gástrico humano. Se encontró una correlación significativa entre PKM2 y E-cadherina en las zonas E-cadherina-positivo. Por otra parte, hubo una correlación significativa entre PKM2 y p-ERK1 /2 en las zonas E-cadherina-negativo.
Discusión
La fase invasiva y metastásica de la progresión del cáncer se correlaciona con mal pronóstico clínico y representa el más formidable barrera para el éxito del tratamiento. la motilidad celular y la invasión son las características definitorias de los tumores malignos, los cuales permiten a las células tumorales para migrar hacia los tejidos adyacentes o por la limitación de las membranas basales y matrices extracelulares. Se requiere la motilidad celular para los procesos fisiológicos de la reparación de heridas y la organogénesis y para el proceso patológico de la invasión tumoral [13]. las células tumorales invasoras se caracterizan por la motilidad celular mal regulada en respuesta a señales extracelulares a partir de factores de crecimiento y citoquinas. tumores humanos expresan altos niveles de factores de crecimiento y sus receptores, y muchos tipos de células malignas parecen exhibir crecimiento autocrine- o paracrina estimulada. Entre los sistemas de receptores de factores de crecimiento más bien estudiadas es la familia de receptores de EGF [14]. Las señales procedentes del medio extracelular dictan la motilidad celular. Muchos factores de crecimiento, incluyendo los ligandos que actúan a través del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), mejorar la motilidad de las células [15]. Se requieren al menos dos vías de señalización intracelular distintos para la motilidad celular mediada por EGFR: las vías que utilizan PLC γ y la vía de la MAP quinasa. Se ha propuesto la actividad γ PLC para mejorar la motilidad celular mediante la movilización de proteínas de actina modificadores de una localización asociada a la membrana inactiva a una citoesqueleto sub-membrana locale activo [16]. Las MAP quinasas Erk transmiten señales al núcleo, así como señales que regulan las conexiones célula-matriz.
Las cadherinas comprenden una gran familia de moléculas de adhesión célula-célula, que incluyen la clásica, los desmosomas, y cadherinas atípicas. E-cadherina, que se expresa principalmente en las células epiteliales, es una proteína de adhesión que está codificada por el gen y las funciones CDH1 en múltiples procesos, incluyendo el desarrollo, la integridad del tejido, la migración celular, la morfología, y la polaridad [17], [18], [19]. E-cadherina también es un supresor de tumores cuya expresión se reduce o silenciado frecuentemente, y su re-expresión puede inducir la reversión morfológica [20], [21]. La activación dependiente de EGF del EGFR se ha informado de que se inhibió de una manera E-cadherina adhesión dependiente, que inhibe la activación dependiente de ligando de diversos receptores tirosina quinasas. N-cadherina, como un promotor de la invasión, es frecuentemente upregulated. La expresión de N-cadherina en células epiteliales induce cambios en la morfología a un fenotipo fibroblástico, haciendo que las células más móviles e invasivo. Estudios recientes indican que las células cancerosas tienen regulada-up N-cadherina, además de la pérdida de E-cadherina. Este cambio en la expresión de cadherina se llama el "interruptor de cadherina".
Se ha observado una baja regulación de la E-cadherina ARNm y aumento de la fosforilación, lo que induce la endocitosis de la E-cadherina, en las células PKM2-agotado. También se encontró que el nivel de expresión de la proteína N-cadherina se incrementó en la línea celular BGC823 cuando PKM2 se agotó. La caída de PKM2 promueve la migración celular y la invasión en BGC823 y SGC7901 células con la estimulación de EGF. Un aumento de la actividad de la EGFR es el factor crítico en la determinación de la motilidad celular y la invasividad de las células y BGC823 SGC7901. La hipótesis de que la baja regulación de la expresión de E-cadherina aumentó la fosforilación del EGFR y activa las vías de señalización corriente abajo, que incluyen PLCγ1 y ERK1 /2. activación γ PLC aumenta la motilidad celular, y ERK1 /2 actividad juega un papel crítico en la expresión de MMP7.
metaloproteinasas de matriz (MMPs) han sido implicados en la invasión del cáncer y la metástasis debido a su matriz extracelular (ECM) la actividad -proteolytic [22].