Extracto
El cáncer de páncreas tiene una tasa de supervivencia a 5 años de menos del 4%. A pesar de los avances en la tecnología de diagnóstico, el cáncer de páncreas continúa a ser diagnosticados en una etapa avanzada e incurable. Se necesitan con urgencia biomarcadores precisos para el diagnóstico precoz y para predecir la respuesta al tratamiento. Dado que la alteración del metabolismo de la glucosa es una de las características de las células cancerosas, propusimos que tipo de piruvato quinasa M2 (M2PK) y las enzimas lactato deshidrogenasa A (LDHA) podrían representar nuevos marcadores de diagnóstico y posibles dianas terapéuticas en el cáncer de páncreas. En 266 secciones de tejido de páncreas normal, neoplasias quísticas del páncreas, neoplasia intraepitelial pancreáticos (PanIN) y el cáncer, se evaluó la expresión de PKM2, LDHA, Ki-67 y CD8 + por inmunohistoquímica y se correlacionaron estos marcadores con características clínico-patológicos y la supervivencia del paciente. PKM2 y expresión LDHA también se evaluó mediante Western blot en 10 líneas celulares de cáncer de páncreas humano. PKM2 expresión aumentó progresivamente desde quiste a través PanIN con el cáncer, mientras que LDHA se sobreexpresa en todo el proceso carcinogénico. Todas menos una línea celular mostraron alta expresión de ambas proteínas. Los pacientes con fuerte PKM2 y expresión LDHA tenían una supervivencia significativamente peor que aquellos con PKM2 débil y /o expresión LDHA (7,0 meses frente a 27,9 meses, respectivamente, p = 0,003, prueba de log rank). La expresión de ambos PKM2 y LDHA correlaciona directamente con Ki-67 expresión, e inversamente con CD8 + intratumoral recuento de células. PKM2 se sobreexpresa significativamente en los tumores pobremente diferenciados y ambos PKM2 y LDHA se sobreexpresa en tumores de mayor tamaño. El análisis multivariante mostró que la expresión combinada de PKM2 y LDHA era un marcador de mal pronóstico independiente de supervivencia. En conclusión, nuestros resultados demuestran un patrón de expresión alta de las dos principales enzimas glucolíticas durante la carcinogénesis pancreática, con una mayor expresión en tumores agresivos y un efecto negativo importante en la supervivencia
Visto:. Mohammad GH, Olde Damink SWM, Malago M , Dhar DK, Pereira SP (2016) piruvato quinasa M2 y lactato deshidrogenasa a se sobreexpresa en el cáncer pancreático y se correlacionan con mal resultado. PLoS ONE 11 (3): e0151635. doi: 10.1371 /journal.pone.0151635
Editor: Michael Muders, Hospital Universitario Carl Gustav Carus de Dresden, Alemania |
Recibido: 5 de Agosto, 2015; Aceptado: 2 Marzo de 2016; Publicado: 18 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Mohammad et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Investigación del cáncer de páncreas, la Fundación Jason Boas, NIH subvención P01 CA084203 y el Centro UCLH /UCL Integral Biomédica, que recibe una proporción de fondos del Departamento de Salud del Instituto Nacional para la Investigación de la Salud sistema de financiación (INDH) Biomédica Centros de Investigación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es uno de los cánceres gastrointestinales más comunes y la cuarta causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. La resección quirúrgica es el tratamiento más eficaz, pero los pacientes suelen ser diagnosticados en una etapa avanzada, cuando la resección quirúrgica no es posible, lo que resulta en una tasa de supervivencia a cinco años de menos del 4% [2]. Hay algunas otras terapias eficaces, con un solo agente paliativo o quimioterapia de combinación como la principal opción de tratamiento para los pacientes con enfermedad avanzada [3,4].
glucólisis aeróbica es una característica de las células cancerosas, con la producción de lactato incluso en presencia de grandes cantidades de oxígeno, un fenómeno conocido como el efecto Warburg [5-7]. Una ventaja importante de aumento de la glucólisis en las células tumorales es la producción de energía sin el consumo de oxígeno y glicolíticas intermedios, tales como aminoácidos, nucleótidos, fosfolípidos y triglicéridos, que se utilizan como macromoléculas para la síntesis de los elementos estructurales de nuevas células [5, 6,8,9].
piruvato quinasa (PK) es una enzima glicolítica estrechamente regulado que cataliza el último paso de la glucólisis y media la transferencia de fosfato a partir de fosfoenolpiruvato (PEP) a difosfato de adenosina (ADP) para producir piruvato y energía (ATP) [10-12]. PK tiene cuatro isoenzimas diferentes PKM1, PKM2, PKL y PKR, la expresión de que depende de la respuesta metabólica de las células. Tanto L y M genes codifican isoenzimas PK. El gen L codifica tanto L y isoenzimas R-PK, mientras que el gen M codifica tanto isoenzimas M2 (PKM2) [13-17] M1 y. Durante la tumorigénesis, la expresión de isoenzimas específicas de PK, por ejemplo PK-M1 en el cerebro y PK-L en el hígado, desaparece y expresión PKM2 predomina [18]. expresión PKM2 puede oscilar entre la isoforma tetramérica altamente activo y la isoforma dimérica casi inactivos, dependiendo de la demanda celular de energía o la fabricación de productos intermedios anabólicos para la proliferación celular. La isoforma tetramérica de PKM2 se expresa predominantemente en las células normales, mientras que su isoforma dimérica se encuentra normalmente en las células tumorales, de ahí el nombre de tumor PKM2 [11,14,19].
Otro componente de aguas abajo en la vía glicolítica es la lactato deshidrogenasa a (LDHA) enzima, que es una parte de la familia de las oxidorreductasas LDH 2-hidroxiácido. LDHs son enzimas tetraméricas homo y hetero compuesta por dos subunidades principales, A y B, lo que resulta en cinco isoenzimas que catalizan la conversión reversible de piruvato y lactato. LDHA (también conocido como LDH-5, LDH-M o A4) es codificada por el
LDH-un gen
y predomina en el músculo esquelético y el hígado, mientras que LDHB (también conocido como LDH-1, LDH-H o B4) es codificada por el
LDH-B Opiniones gen y se encuentra principalmente en el corazón y el cerebro [20-24]. LDH-C se compone principalmente de X-subunidades y se encuentra en los espermatozoides humanos [22,25]. LDHA cataliza la conversión de piruvato en lactato con la regeneración de NAD
+ para continuar con la producción de energía mediante la glucólisis [26-29]. El lactato producido por LDHA se utiliza como combustible alternativo por las células que son adyacentes a los vasos sanguíneos, y la glucosa se salva para que las células más distantes que son hipóxicas.
La sobreexpresión de PKM2 o LDHA se ha informado en los tejidos de un número de cánceres, incluyendo el colangiocarcinoma, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas y cáncer de páncreas. La sobreexpresión se asocia con la iniciación del tumor, la progresión y la resistencia a la quimioterapia [27,30-32]. En teoría, el perfil de expresión de estas enzimas también puede representar marcadores de diagnóstico o pronóstico útiles en el cáncer de páncreas [15,23,33].
Las células T CD8 + (linfocitos T citotóxicos) son un subconjunto importante de los linfocitos infiltrantes de tumores que juegan un papel clave en la respuesta inmune anti-tumor. estudios de inmunohistoquímica han demostrado un efecto anti-tumor de la infiltración de linfocitos CD8 +, con tasas de supervivencia mejoradas de pacientes con pancreático, de pulmón, de ovario, colorrectal, renal y tumores esofágicos [34-39], y una correlación directa entre el aumento del número de CD8 + tumor infiltrante linfocitos (TIL) y la apoptosis de las células tumorales [40,41].
el objetivo de nuestro estudio fue evaluar la expresión de PKM2 y LDHA en lesiones pre-neoplásicas pancreáticas (quistes y neoplasias intraepiteliales pancreáticas, PanIN) y cánceres y correlacionarlo con el resultado del paciente. Dado que PKM2 y LDHA están implicados en varias vías de señalización de proliferación celular [42], también se investigó si la expresión de estas enzimas glucolíticas correlacionados con el número de CD8 + TIL y los marcadores de la proliferación tumoral (Ki-67).
Materiales y Métodos
Los pacientes
Este estudio incluyó biopsia pancreática o especímenes de resección quirúrgica de 266 pacientes; 136 de la University College Hospital de Londres NHS Foundation Trust (UCLH) y otros 130 de un microarray de tejido disponible en el mercado (TMA) (AccuMaxArray, ISU ABXIS CO., LTD, EE.UU., e Insight Biotechnology Limited, Reino Unido). La cohorte UCLH consistía en 136 pacientes con adenocarcinoma confirmado ductal pancreático (PDAC) (n = 61), adenocarcinoma ampular (n = 11), lesiones quísticas pancreáticas (n = 49), pancreatitis crónica (n = 11) y el tejido pancreático normal ( n = 4). Estos pacientes habían sido tratados en UCLH entre enero de 2005 y enero de 2010. Una base de datos clínicos de los pacientes UCLH fue creado a través de la base de datos de CoPath la histología, que incluye los siguientes parámetros clínico: el género, la edad al momento del diagnóstico, tipo de muestra (biopsia o resección), tipo de tumor (ampular o ductal), el resultado (vivo o muerto), causa de la muerte, la duración del seguimiento si está vivo, la presencia o ausencia de enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico histológico, si la resección se llevó a cabo, la enfermedad residual ( R de estado), la recurrencia post-resección, tiempo de recurrencia post-resección (si lo hay), la etapa del cáncer, compromiso de los ganglios linfáticos, la presencia de invasión linfovascular o perineural, grado de diferenciación del tumor, y si los pacientes recibieron quimioterapia (Tabla 1). Todos los datos se obtuvieron de la fecha de diagnóstico histológico de la fecha de la muerte o el final de la recogida de datos el 1 de febrero de 2015. La aprobación del Comité de Ética se obtuvo del Comité Ético de Investigación 3 REC centro de Londres para realizar inmunohistoquímica en muestras de biopsia y la resección almacenados enlaces con una base de datos clínicos con la necesidad del consentimiento renunció (referencia REC 06 /Q0512 /106, fecha de la enmienda 30 julio de 2010). Todas las muestras de pacientes fueron anónimos y no identificable antes del análisis.
Tissue microarrays
Un segundo conjunto de validación de 130 muestras de tejido se obtuvo a partir de páncreas TMA disponibles en el mercado. Un total de 206 núcleos de tejido de 130 pacientes (83 varones, 47 mujeres, edad media 59, rango 32-80 años) estaban presentes en el TMA, que incluyó 63 casos de PDAC, por duplicado, 19 PanIN (10 PanIN-1, 7 PanIN-2 y 2 PanIN-3), 10 pancreatitis crónica y 38 núcleos de tejido pancreático normal. El diagnóstico histológico de todos los casos se verificó mediante hematoxilina y eosina. Los datos clínicos proporcionados con el TMA incluyen el tamaño del tumor y el estadio, grado de diferenciación del tumor, la afectación ganglionar, estado y tumorales sitios metastásicos.
La inmunohistoquímica
métodos de inmunohistoquímica estándar se utilizan para detectar la expresión de PKM2, LDHA, CD8 y Ki-67. Brevemente, las secciones embebidas en parafina se precalentaron en un horno durante 30 minutos a 60 ° C, y luego deparaffinised en xileno y hidratado a través de una serie de etanol graduada (70% -95%). Las secciones se someten a recuperación de antígeno mediada por calor con tampón de citrato (pH 4,0) en un autoclave. La actividad peroxidasa endógena fue inhibida por peróxido de hidrógeno al 3% durante 20 minutos, seguido de incubación con 2,5% de suero de caballo normal de bloqueo durante 20 minutos. Las secciones fueron incubadas con el anticuerpo primario durante una hora a temperatura ambiente para CD8 (CD8A anticuerpo policlonal de conejo, Abnova, Reino Unido, Cat#PAB11235, 1: 200) y Ki-67 (conejo policlonal para Ki-67, Abcam, UK, Cat#ab15580, 1: 300), y durante la noche a 4 ° C durante PKM2 (monoclonal de ratón anti-humano y de rata PKM2, ScheBo®Biotech, Giessen, Alemania, Cat#S-1, 1: 100) y LDHA (LDHA /LDHC (C28H7) conejo con anticuerpos monoclonales, Señalización celular, Reino Unido, Cat#3558, 1: 250) en PBS. Después de tres lavados con PBS que contenía 0,5% de Tween 20, las secciones se incubaron con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpo secundario durante 30 minutos. El anticuerpo primario se detectó utilizando el kit 3, 3'-diaminobencidina (DAB) o 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) sistema de detección. Las secciones se colocaron en hematoxilina durante 3 minutos, después se lavaron suavemente y se montaron.
inmunohistoquímica doble
Un kit de doble inmunotinción (imagen kit doble tinción, Invitrogen, Reino Unido) se utilizó para co-localización de PKM2 y CD8 o Ki-67. Brevemente, se usaron dos sistemas de detección diferentes de enzimas para la doble tinción secuencial con el uso inicial del sistema de peroxidasa de rábano picante seguido por el sistema de fosfato alcalino. Las secciones se incubaron con el anticuerpo primario anti-PKM2 y anticuerpo secundario HRP, y la visualización se desarrolló con el sistema de detección de DAB. Después de esta etapa, las secciones se lavaron con PBS, se incubaron con suero de bloqueo, seguido de anticuerpo primario (anti-CD8 o Ki-67) y de cabra anti-conejo IgG fosfatasa alcalina anticuerpo secundario. Color fue desarrollado por el rojo rápido con tinción de hematoxilina contador.
Evaluación de la tinción inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se evaluó utilizando un microscopio óptico conferencia (AXIO Alcance, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen, Alemania). La evaluación de los immunostained diapositivas se realizó de forma independiente por dos observadores ciegos, con información de antecedentes del paciente, y cualquier disparidad entre los observadores fue resuelto mediante el uso de un microscopio de conferencias. Una fórmula completa de puntuación se utilizó para la evaluación semi-cuantitativa de la expresión PKM2 como se describe anteriormente [43], con la intensidad de tinción anotó como: 1, la expresión débil; 2, una expresión moderada; o 3, expresión fuerte; la extensión de la tinción anotó como 1, & lt; 33% de las células tumorales positivas; 2, 33-67% de las células tumorales positivas o; 3, & gt; 67% de las células tumorales positivas. Las puntuaciones de intensidad y extensión se multiplican a continuación para obtener una única escala de puntuaciones de 1, 2, 3, 4, 6, y 9. Las puntuaciones de 1 a 3 se definieron como débil (o negativo) de la tinción, mientras que las puntuaciones 4, 6 y 9 fueron considerados tan fuerte (o positivo) tinción.
El número de CD8 + TIL y Ki-67 células tumorales positivas fueron también contadas independientemente por dos observadores. Inicialmente, toda la diapositiva se escaneó a bajo aumento (x40) para identificar la región con la mayor densidad de las células CD8 intratumoral o células tumorales Ki-67-positivas y luego cinco áreas al azar dentro de esa región fueron contados a gran aumento (x400). El número medio de CD8 + TIL se calculó y se expresó como número por campo de alta potencia (HPF). El índice de proliferación celular (PI) se expresó como un porcentaje del número de núcleos teñidos positivo para Ki-67 entre 1000 células tumorales utilizando una cuadrícula normalizada.
Los cultivos de células
Nueve de cáncer pancreático humano líneas celulares fueron comprados de RIKEN Centro de bio (RIKEN BRC, Tsukuba, Japón) y la línea celular BxPC-3 fue adquirido de PerknElmer (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, EE.UU.). PANC-1, PK-1, PK-59, PK-45h, PK45P, KLM-1, NOR-P1 y BxPC-3 se mantuvieron en RPMI-1640, MiaPaCa-2 en DMED y KP-4 en medio DMEM /F12 . Todos los medios se complementaron con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina /estreptomicina y glutamina 2 mM (Gibco, Life Technologies, UK). Las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada de 21% de O
2, 5% de CO
2 a 37 ° C y se recogieron con tripsina-EDTA.
Western Blot
PKM2 y LDHA expresión se evaluó en líneas celulares de cáncer pancreático por el Western Blot. En pocas palabras, después de la extracción de proteínas, la concentración de proteínas se midió por el ácido bicinconínico (BCA) de ensayo y 15μg de proteína se ejecuta en un gel pre-cast (NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 1,0 mm, 10 pozos gel, Invitrogen, EE.UU.) y se transfirieron a un tamaño de poro de la membrana 0.45μm fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Invitrogen, EE.UU.). La membrana se bloqueó con solución de 5% albúmina de suero bovino (BSA) y se incubó durante la noche a 4 ° C, ya sea con el ratón anti-PKM2 (DF-4, ScheBo®Biotech, Giessen, Alemania, 1: 1000) contra LDHA-anticuerpo o conejo (Cell Signaling, Reino Unido, 1: 1000), y después se incubaron con peroxidasa de rábano picante apropiada anticuerpos conjugados secundarios (Cell Signaling, Reino Unido, 1: 2000). La reacción antígeno anticuerpo se detectó por sustrato de quimioluminiscencia (Thermo Scientific, EE.UU.). actina de anticuerpos anti-β (Señalización Celular, Reino Unido) se utilizó como control de carga de proteínas.
El análisis estadístico
software de IBM SPSS estadístico (versión 22, SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU. ) se utilizó para el análisis y gráficos de datos. gráficos de Kaplan-Meier y log-rank test fueron utilizados para analizar la supervivencia y para identificar las diferencias entre los grupos. Una forma ANOVA con la prueba post-hoc de Bonferroni se utilizó para la comparación global de múltiples grupos, con la prueba de Mann-Whitney U-test para pruebas no paramétricas y la prueba de Chi cuadrado de las diferencias entre los datos categóricos. la correlación no paramétrica de análisis entre dos variables continuas se realizaron mediante el test de Spearman. Todos los resultados de las pruebas fueron de dos colas, con efectos resumidos utilizando intervalos de confianza del 95%. La significación estadística se estableció en p. & lt; 0,05
Resultados
Expresión de PKM2 y LDHA en el cáncer de páncreas
Tanto PKM2 y LDHA se sobreexpresa en células tumorales en comparación con el tejido normal de páncreas . Se observó un patrón de expresión variable del PKM2 en los tejidos tumorales, con relativamente mayor expresión en áreas pobremente diferenciados, en el avance de los márgenes de nódulos tumorales y en tumores invasivos (musculares y de los vasos sanguíneos) (Fig 1A, 1B, 1E y 1F). En general, la expresión PKM2 se asoció principalmente con tumores agresivos. Se observó expresión preferencial de PKM2 en las células proliferantes binucleadas en nódulos tumorales (Figura 1D). Expresión de PKM2 se observó en todos los compartimentos celulares, incluyendo la membrana celular, citoplasma y /o núcleo (Fig 1C y 1F). En contraste, la expresión LDHA fue generalmente alta en el tumor así como en los tejidos preneoplásicas y pancreatitis sin un patrón específico (Fig 2). expresión LDHA también se detectó en la membrana celular y /o citoplasma y de vez en cuando en el núcleo.
(A) área bien diferenciado de tumor que muestra la expresión PKM2 débil (flecha roja), con alta expresión en áreas pobremente diferenciados ( de color marrón, flecha amarilla) (ampliación x100). (B) Cultivo margen de nódulos tumorales con fuerte expresión de PKM2 (flecha roja) (ampliación x100). (C) la expresión membranosa de PKM2 (flecha roja) (ampliación x200). (D) la expresión heterogénea de PKM2 con expresión predominante en las células proliferantes (flecha roja) (ampliación x200). (E) la expresión tumoral fuertemente positivo de PKM2 en la invasión vascular (flecha roja) (ampliación x100). (F) la expresión tumoral fuertemente positivo de PKM2 con invasión al músculo (flecha roja) (ampliación x100).
(A) expresión membranosa de LDHA (ampliación x200). (B) citoplasmática y nuclear de la expresión (ampliación x200). (C) Expresión fuerte en quiste pancreático con la expresión suave en el tejido pancreático (ampliación x50) normal circundante. (D) La expresión nuclear LDHA en el cáncer pancreático (ampliación x100). (E) La fuerte expresión en la lesión PanIN (ampliación x100). . (F) tinción negativa en el páncreas (ampliación x100) normales
expresión similar de PKM2 y LDHA se observó en la cohorte UCLH y TMA muestras, con una puntuación de tinción de & gt; 3 en 64% y 73% de los tumores, respectivamente, para PKM2, y en 76% de los tumores para LDHA en ambas cohortes. El patrón de expresión en las líneas celulares de cáncer de páncreas fue similar para ambos PKM2 y LDHA, excepto en la línea celular KP4 en el que el nivel LDHA era más fuerte que el nivel PKM2 (figura 3). En ambas cohortes, muestras pancreatitis también altamente expresado LDHA en comparación con la expresión PKM2 (figura 4).
La inmunotinción de MiaPaCa-2 células con PKM2 (A) y LDHA (B) se muestra en el panel inferior. Fuerte tinción citoplásmica y nuclear se observó en las células en proliferación
PKM2 se expresa fuertemente por las muestras de tejido de cáncer de páncreas y fue significativamente mayor que en condiciones normales, pancreatitis, quiste pancreático y los tejidos PanIN (P & lt; 0,001).. La expresión de LDHA fue significativamente mayor en el cáncer de páncreas que en el páncreas normal (P & lt; 0,001)., Mientras que no hubo diferencias significativas en la expresión LDHA entre el cáncer de páncreas, PanIN, quistes pancreáticos y pancreatitis
se muestra en la Fig 4, se observó una mayor expresión progresivamente PKM2 a lo largo de la transición al cáncer de páncreas, con la expresión más baja de quistes pancreáticos (19%), intermedio en PanIN (37%) y más alta en el cáncer (68%). PKM2 expresión era aproximadamente cuatro veces más altos que en la pancreatitis (29%) en comparación con el tejido normal de páncreas. Aunque la expresión LDHA también fue significativamente mayor en los cánceres en comparación con tejido pancreático normal (p & lt; 0,0001, ANOVA), no hubo diferencias significativas entre pancreatitis crónica, quistes pancreáticos, PanIN y muestras de cáncer (67%, 59%, 73% y 76 %, respectivamente).
PKM2 y LDHA expresión en líneas celulares de cáncer de páncreas
Por Western Blot, la alta expresión de PKM2 y LDHA se detectó en 8 y 9 de las 10 líneas celulares de cáncer de páncreas (Fig 3). El nivel de expresión de PKM2 y LDHA correspondía en todas las líneas celulares, excepto en el KP4 en el que el nivel PKM2 fue más débil que el nivel LDHA. Por inmunohistoquímica, tanto PKM2 y LDHA tenían una fuerte expresión citoplasmática y nuclear (Figura 3).
Asociación con parámetros clínico
La correlación entre PKM2 y expresión LDHA con características clinicopatológicas se muestra en la Tabla 1. hubo una correlación inversa significativa entre la expresión PKM2 y la diferenciación del tumor en la cohorte UCLH, con un 83% de los tumores PKM2 positivos estar menos diferenciadas en comparación con el 64% de los tumores negativos PKM2 (p = 0,047, prueba de chi-cuadrado) (datos no mostrados) .
se encontró un número significativamente mayor de CD8 + TIL en los tumores con PKM2 débil o expresión LDHA en comparación con tumores que tenían una expresión fuerte (p = 0,0001, p = 0,005, respectivamente, Tabla 1). Además, se observó una asociación significativa entre la proliferación de células tumorales y la expresión de ambos PKM2 y LDHA; el número de núcleos tumorales que expresan Ki-67 fue más de 2 veces mayor en PKM2 y LDHA tumores que expresan comparación con los tumores negativos (PKM2: 27,8 ± 12,9 vs. 12,2 ± 14, p = 0,0001 y LDHA: 25,1 ± 12,3 vs. 14 ± 15,1, p = 0,004). Cuando la tinción de las puntuaciones, el recuento de CD8 + TIL y el número de 67 Ki-células positivas se consideraron como variables continuas, se observó una correlación inversa significativa entre las puntuaciones de tinción y recuento de células CD8 + (PKM2: p & lt; 0,001 y LDHA: p = 0,004, Spearman correlación de rango). Una correlación directa significativa se observó entre las puntuaciones de tinción y Ki-67 count (PKM2: p & lt; 0,001 y LDHA: p = 0,001, prueba de correlación de rangos de Spearman) (figuras 5 y 6). En la cohorte de TMA, la expresión de PKM2 y LDHA correlacionado con el tamaño del tumor. Se observó expresión PKM2 en el 54,5%, 77,8% y 90,9% de los tumores que fueron ≤ 2.5, 2.6-3.9 y ≥ 4 cm de tamaño, respectivamente. expresión LDHA positivo se encontró en 59,1%, 77,8% y 100% en tumores que eran ≤ 2.5, 2.6 a 3.9 y ≥ 4 cm de tamaño, respectivamente. No hubo diferencias significativas entre PKM2 o LDHA expresión y la localización del tumor, la afectación ganglionar, estadio T y el estado metastásico.
(A) tumores bien diferenciados con expresión PKM2 negativo tuvieron fuerte de la infiltración por CD8 + T-linfocitos positivos (ampliación x200). (B) tumores pobremente diferenciados fuertemente positivos para PKM2 tenían escasa infiltración por células CD8 + T-linfocitos positivos (ampliación x200). Hubo una correlación negativa significativa entre las células positivas CD8 + y ambos PKM2 (C) & amp; (D) y la tinción LDHA (E) & amp; (F).
(A) Los tumores con expresión PKM2 fuertemente positiva tenido la mayor parte de los núcleos teñidos para Ki-67 (x100 aumentos). (B) Los tumores débilmente positivo para PKM2 tenía escasa tinción Ki67 (ampliación x100). (C) & amp; (D) La correlación entre la tinción de PKM2 y Ki-67 células positivas. (E) & amp; (F) La correlación entre la tinción de LDHA y Ki-67 células positivas. Hubo una correlación significativa tanto para PKM2 y LDHA.
Correlación entre la expresión y PKM2 LDHA y la supervivencia del paciente
A continuación examinó si el perfil de expresión de PKM2 y LDHA predice la supervivencia. Los pacientes con tumores anotando & gt; 3 para PKM2 o expresión LDHA tenían una supervivencia significativamente peor en comparación con los que expresa débilmente PKM2 y /o LDHA. De las 72 muestras de cáncer de páncreas (UCLH cohortes), 46 (64%) fuertemente expresado PKM2 y estos pacientes tuvieron una supervivencia media de sólo el 8,9 meses frente a 28,9 meses en los 26 (36%) pacientes con expresión débil del tumor PKM2 (negativo) (p = 0,016, prueba de log-rank, la figura 7). Del mismo modo, 55 (76,4%) pacientes con tumor expresión LDHA positivos tenían una supervivencia media de 10,9 meses en comparación con los 34,5 meses de los 17 (23,6%) pacientes con expresión débil (negativo) LDHA del tumor (p = 0,029, prueba de log-rank, Fig 7). Por otra parte, cuando se combinó el perfil de expresión de PKM2 y LDHA, la supervivencia de los pacientes con expresión negativa para ambos o positivo para uno era cuatro veces más que los que tienen un estado positivo para ambos (27,9 meses frente a 7,0 meses, respectivamente, p = 0,003, test de rangos logarítmicos). Entre los varios factores predictivos de supervivencia por el análisis univariado (T-etapa; p = 0,006, la diferenciación del tumor; p = 0,003, estado metastásico; p = 0,000), mediante análisis de regresión de Cox sólo el /estado de la expresión LDHA y diferenciación tumoral estado PKM2 combinados se predictores independientes de supervivencia (p = 0,003, hazard ratio (HR) = 4,96 yp = 0,015, HR = 3,31, respectivamente) (Tabla S1 en la tabla).
Tanto PKM2 (a) y LDHA (B) tenían un impacto significativo sobre el pronóstico de supervivencia de los pacientes (p = 0,016, 0,029, log rank test, respectivamente) y la expresión combinada para ambos marcadores estratifica aún más los pacientes (C) (p = 0,003, prueba de log rank). Como era de esperar, los pacientes sometidos a resección quirúrgica tuvieron una mayor supervivencia que los pacientes no resecados.
Además, 27 de los 72 pacientes (UCLH cohorte) fueron sometidos a resección quirúrgica para PDAC (n = 16) o adenocarcinoma ampular ( n = 11). Los que fueron sometidos a resección quirúrgica tuvieron una supervivencia significativamente mayor que aquellos que no se sometieron a la cirugía (26,5 vs 7,0 meses, P & lt; 0,0001; prueba de log rank). Como era de esperar, los pacientes con adenocarcinoma ampular tuvieron un mejor pronóstico después de la cirugía que aquellos con PDAC, con 5 de 11 (45,5%) ampulares pacientes con carcinoma vivos al último contacto, en comparación con sólo 1 de cada 16 (6,3%) pacientes con PDAC (P & lt ; 0,0001; log rank test)
Discusión
Hay una creciente evidencia de que las células cancerosas se han elevado consumo de glucosa con un aumento concomitante en la producción de lactato a través de procesos mediados por la enzima catalítica secuenciales [44,45]. . PKM2 y LDHA son dos enzimas glucolíticas cruciales que facilitan estos procesos para conferir las células cancerosas con una ventaja de crecimiento sobre las células normales. Hasta la fecha, PKM2 suero ha sido identificado como un marcador de diagnóstico y de pronóstico con sensibilidad y especificidad comparable al suero CA19-9 marcador en el cáncer de páncreas [46-48]. Sin embargo, hay datos limitados sobre el patrón de expresión y el impacto pronóstico de PKM2 y LDHA en el cáncer de páncreas [32,49,50]. A lo mejor de nuestro conocimiento, nuestro estudio es el primero en evaluar el impacto pronóstico de PKM2 combinado y expresión LDHA en la iniciación y progresión del cáncer de páncreas. Un estudio reciente demostró la sobreexpresión y la fosforilación de ambas de estas enzimas en el cáncer de tiroides en comparación con bocio benigno [51]. Nuestros resultados coinciden con sus resultados que muestra la sobreexpresión significativa de PKM2 y LDHA en los cánceres de páncreas en comparación con el tejido normal de páncreas.
La iniciación paso a paso y el desarrollo de cáncer de páncreas a menudo comienza con la pancreatitis, la metaplasia ductal, la formación de quistes o PanIN lesiones, que conducen al cáncer de páncreas. Curiosamente, nuestros resultados demuestran la sobreexpresión de LDHA en una etapa muy temprana a lo largo de la vía de carcinogénesis de pancreatitis través de quiste /PanIN para cáncer con la más alta expresión en los tumores más agresivos. En contraste, la expresión PKM2 aumenta progresivamente a lo largo de la transición a cáncer de páncreas y fue más bajo en los quistes, intermedio en las lesiones PanIN y la más alta en los cánceres. Aunque el mecanismo exacto de este patrón de expresión diferencial queda por esclarecer, es posible que las lesiones pre-neoplásicas adquieren el fenotipo glucolítico través LDHA sobreexpresión y luego LDHA sí mismo u otros oncogenes inducen la sobreexpresión PKM2 en etapas posteriores cuando las tasas de proliferación de células tumorales son más altos . De hecho, se ha demostrado recientemente que el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) induce transactivación β-catenina y la expresión de c-myc, upregulating LDHA, que a su vez induce la regulación positiva de la expresión PKM2 por la alternancia de corte y empalme del gen de M1 a tipo M2 [52]. Estos hallazgos podrían explicar en parte la sobreexpresión consistente de LDHA durante todo el proceso tumorigénico y la sobre-expresión progresiva de PKM2 lo largo de la vía de carcinogénesis. La expresión y la actividad enzimática de LDHA y PKM2 también puede ser modulada por la fosforilación de tirosina en varios residuos (Y10 y Y105, respectivamente) por el oncogénica de tirosina quinasa del factor de crecimiento de fibroblastos receptor-1 [53]. El patrón de expresión diferencial sugiere que PKM2 (o una combinación de PKM2 y LDHA) sería una mejor opción para discriminar cáncer de lesiones pre-neoplásicas en comparación con LDHA solo, excepto en pancreatitis donde ambos marcadores son altamente expresado.
El tratamiento del cáncer de páncreas es muy difícil debido a un diagnóstico tardío, y la falta de marcadores de pronóstico adecuados y terapias eficaces. Nuestros resultados demuestran que tanto PKM2 o LDHA son importantes marcadores de pronóstico en el cáncer de páncreas y la combinación proporciona una mejor estratificación de resultado. Estos resultados están en línea con las publicaciones anteriores que muestran un efecto pronóstico significativo de LDHA o PKM2 en otros tipos de tumores, incluyendo el carcinoma de células escamosas, colangiocarcinoma y el cáncer gástrico [43,54,55]. Los mecanismos exactos asociados con la sobreexpresión de PKM2 y LDHA que conducen a mal pronóstico siguen sin estar claros. Muy recientemente, Rajeshkumar et al (2015) encontró que el inhibidor de molécula pequeña LDHA FX11 puede impedir el crecimiento del tumor, reducir la proliferación de células tumorales e inducir la apoptosis en un modelo de xenoinjerto de ratón derivado del paciente de cáncer de páncreas con TP53 mutante, mientras que los tumores que albergan de tipo salvaje TP53 eran completamente resistentes a la FX11 [56].
el cáncer de páncreas es uno de los tipos de tumores más agresivos, con una supervivencia general muy pobre. Los resultados de nuestro estudio muestran claramente la regulación de ambos PKM2 y LDHA en el cáncer de páncreas e implicar a la alta expresión de estas dos enzimas glucolíticas en el desarrollo y progresión del cáncer de páncreas mediante una mayor proliferación, migración, invasión y la angiogénesis.