Extracto
La inactivación del gen supresor tumoral p53 se observa con frecuencia en el cáncer de próstata humana y se asocia con la resistencia terapéutica. Hemos demostrado anteriormente que los polifenoles del té verde (GTP) inducen la apoptosis en células de cáncer de próstata independientemente del estado de p53. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a estas observaciones siendo difícil de alcanzar. Aquí hemos investigado los mecanismos de apoptosis inducida por GTP en células LNCaP de cáncer de próstata humano establemente transfectadas con ARN de horquilla corta-contra p53 (LNCaPshp53) y el control de vectores (LNCaPshV). tratamiento GTP induce la estabilización de p53 y la activación de objetivos de abajo p21 /WAF1 y Bax de una manera dependiente de la dosis específicamente en las células LNCaPshV. Sin embargo, inducida por GTP upregulation FAS a través de la activación de la quinasa c-jun-N-terminal dio como resultado la fosforilación de FADD, la activación de la caspasa-8 y el truncamiento de BID, lo que lleva a la apoptosis tanto en las células LNCaPshV y LNCaPshp53. En paralelo, el tratamiento de las células con GTP resultó en la inhibición de la vía de supervivencia, mediada por Akt desactivación y pérdida de la fosforilación de BAD más prominente en las células LNCaPshp53. Estas rutas distintas de la muerte celular convergieron a una vía común, lo que lleva a la pérdida de potencial de membrana mitocondrial, la liberación del citocromo cy la activación de las caspasas terminales, lo que resulta en PARP-división. apoptosis GTP inducida fue atenuada con el inhibidor de JNK, SP600125 en ambas líneas celulares; mientras que inhibidor de PI3K-Akt, LY294002 resultó en un aumento de la muerte celular en las células LNCaPshp53 prominente, estableciendo el papel de dos vías distintas de la apoptosis mediada por GTP. Además, la exposición GTP resultó en la inhibición de la clase I de proteínas HDAC, la acumulación de acetilado histona-H3 en la cromatina celular total, lo que resulta en un aumento de la accesibilidad de los factores de transcripción para unirse con las secuencias promotoras de p21 /WAF1 y Bax, independientemente del estado de p53 de células, en consonancia con los efectos provocados por un inhibidor de HDAC, tricostatina A. Estos resultados demuestran que el GTP induce la muerte celular de cáncer de próstata mediante dos mecanismos distintos independientemente del estado de p53, identificando así los mecanismos moleculares específicos bien definidos que pueden ser objetivo de quimiopreventivo y /o estrategias terapéuticas
Visto: K Gupta., Thakur VS, Bhaskaran N, Nawab A, Babcook MA, Jackson MW, et al. Los polifenoles (2012) Té verde Inducen dependiente de p53 y p53-independiente de la apoptosis en células de cáncer de próstata a través de dos mecanismos distintos. PLoS ONE 7 (12): e52572. doi: 10.1371 /journal.pone.0052572
Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Agosto, 2012; Aceptado: 19 Noviembre 2012; Publicado: December 20, 2012
Derechos de Autor © 2012 Gupta et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación trabajo es apoyado por Estados Unidos Salud Pública Subvenciones para Servicio RO1 CA115491, CA108512 SR1, SR1 AT002709 y R21 CA109424 y los fondos de dotación a la SG. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores se agradecen al Dr. Mark W Jackson, quien cumple una cooperación autor de este manuscrito y es un editor académico de la PLOS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Con limitadas opciones de tratamiento disponibles para el cáncer de próstata, los pacientes con recaídas son tratados con anti -androgens. Sin embargo, la respuesta clínica inicial suele ir seguida de la aparición de cáncer hormono-refractario y, finalmente, resistente a la quimioterapia [1]. Está bien establecido que las células cancerosas pueden adquirir quimiorresistencia a través de una variedad de mecanismos, la mayoría de ellos lo que implica un programa de apoptosis alterada [2]. Estudios recientes han demostrado que el estado de p53 podría ser un determinante crítico para la quimio-sensibilidad en tumores humanos [3], [4]. Más de 50% de los cánceres humanos, incluyendo el cáncer de próstata, pérdida de exposiciones de las funciones de p53 normal y /o defectos en la vía de señalización de p53, así como mutaciones de sentido erróneo o supresiones; estas alteraciones moleculares están asociados con la resistencia a la muerte celular [4], [5]. La ineficacia relativa de los regímenes quimioterapéuticos actuales justifica una búsqueda continua de agentes seguros y eficaces que podrían mejorar el tratamiento y /o inhibir el desarrollo de la resistencia a la quimioterapia.
La proteína p53, un supresor tumoral, funciones en la transcripción de los genes que inhiben el crecimiento implicados en la apoptosis, la detención del ciclo celular y reparación del ADN [4] - [6]. La función supresora de tumor de p53 se atribuye principalmente a su papel en uno de dos mecanismos: o bien la promoción de la reparación y supervivencia de las células dañadas, o la promoción de la eliminación permanente de las células dañadas de manera irreparable a través de la apoptosis [6], [7]. Por ejemplo, p53 provoca la detención del ciclo celular principalmente mediante la activación de la transcripción de un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina, p21 /WAF1, e induce la apoptosis a través de la activación transcripcional de los genes de la familia pro-apoptóticos Bcl2, Bax, PUMA y Noxa [7]. Una vía de señalización alternativa y complementaria que conduce a la muerte celular programada incluye la muerte del receptor vía extrínseca. La vía extrínseca se inicia en la ligadura de receptor de ligando FAS /CD95 mediada por un dominio de muerte asociado a FAS molécula adaptadora (FADD) que llena el receptor con el efector aguas abajo, la caspasa 8, lo que resulta en el montaje de la muerte de inducción de complejo de señalización [ ,,,0],7], [8]. Las vías de la apoptosis intrínsecos y extrínsecos están conectados por la escisión mediada por la caspasa-8 de la pro-apoptóticos miembro de la familia Bcl-2 de la subasta. Truncado Oferta (tBid) se transloca a las mitocondrias, donde se induce la liberación de citocromo C, seguido por la inducción de la apoptosis [9].
Como la desregulación de la vía p53 en una célula de cáncer es un evento común y puede contribuir de resistencia a los medicamentos, se necesitan estrategias quimioterapéuticos dirigidos a este mecanismo defectuoso. Por ejemplo, un nuevo enfoque terapéutico, que implica la inhibición farmacológica de las histona desacetilasas (HDACs), permite la remodelación local de la cromatina y los cambios dinámicos en el embalaje nucleosomal, a través de acetilación /desacetilación de la proteína del núcleo de histona, y por lo tanto juega un papel fundamental en la regulación de la accesibilidad al DNA cromosómico, y de ese modo, en la regulación de la transcripción de genes [10]. Entre los reguladores más importantes de tales fenómenos son enzimas específicas que regulan la acetilación N-terminal de los residuos de lisina en las histonas H3 y H4, las histona acetiltransferasas (HAT) y HDACs [10], [11]. Estas enzimas pueden ser reclutados para modificar genes específicos en los complejos por factores de transcripción específicos de secuencia. La inhibición de la actividad HDAC provoca la detención del ciclo celular y la apoptosis en células de cáncer, principalmente a través de la activación transcripcional de la respuesta pro-apoptótica mediada por p53 y la inducción de ciclo celular inhibidor de la quinasa p21 /WAF1 y Bax, así como a través de la unión directa transcriptionally-independiente de p53 Bax, Bcl2 y Bcl
xL [12], [13].
al lado de la inactivación de los elementos de señalización apoptótica tumores también desarrollan resistencia a la quimioterapia mediante la activación de la supervivencia de señalización tales como el phosphatidylinositide 3-quinasa ( PI3K) /Akt vía [14]. La activación de PI3K por tirosina quinasas receptoras conduce al reclutamiento de la proteína quinasa B (PKB /Akt) a la membrana plasmática donde se activa posteriormente después de la fosforilación en los residuos Thr308 y Ser473, que son a su vez fosforilada por quinasas phosphoinositide-dependiente. Activado Akt aumenta la supervivencia de las células tanto por la inhibición de las proteínas pro-apoptóticas
a saber
. BAD o la caspasa-9 y por la activación de las proteínas anti-apoptóticas promoviendo así la supervivencia de las células [14], [15].
En las últimas décadas, una serie de compuestos polifenólicos naturales han sido evaluados para su posible uso en la prevención y tratamiento del cáncer [16]. Polifenoles de té verde, el constituyente principal de los cuales es epigallocatechic-3-galato (EGCG), se ha demostrado que induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en varios tipos de células de cáncer [17]. Nuestro laboratorio ha llevado a cabo extensas investigaciones sobre los mecanismos subyacentes a los efectos anti-cancerígenos de los polifenoles del té verde en las células de cáncer de próstata humano [12], [13]. Hemos demostrado anteriormente que los polifenoles del té verde causan apoptosis en células de cáncer de próstata, independientemente de la asociación de andrógenos y el estado de p53 [13]. Además, hemos demostrado que GTP y la actividad transcripcional de p53 aumento EGCG y acetilación mediante la supresión de la clase I de histona desacetilasas [12]. En el presente estudio, nuestros resultados demuestran que los polifenoles del té verde inducen apoptosis en células de cáncer de próstata mediante la activación del receptor de muerte FAS /caspasa-8 vía y la inhibición de la vía de supervivencia de células p-Akt /p-BAD. Nuestros resultados acumulados tienen implicaciones importantes para nuestra comprensión del mecanismo molecular de la quimiorresistencia en células de cáncer de próstata y, en particular, el papel de p53 y Akt en este proceso. Desde la quimio-resistencia es un factor limitante en los esfuerzos para proporcionar un tratamiento exitoso para el cáncer de próstata, es fundamental para entender cómo GTP supera diferencialmente resistencia terapéutica e induce la apoptosis en células de cáncer de próstata con diferentes tipos de alteraciones de p53.
Materiales y métodos
Cultivo celular y reactivos
células
LNCaPshV y LNCaPshp53 se generaron mediante la infección de células LNCaP de cáncer de próstata humanas obtenidas de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) con lentivirus shp53 preparado en el laboratorio mediante la transfección células 293T con vectores lentivirales pLVTHSiGFP o pLVTHMshp53RNA y envasado construcciones descritas anteriormente [18], [19]. Las células fueron cultivadas y mantenidas en medio RPMI 1640 (Hyclone, Thermo Fischer, Logan, UT) suplementado con 1% de penicilina-estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (Fundación, West Sacramento, CA) a 50-70% de confluencia. Las células recibieron los siguientes tratamientos: 20 ng /ml tricostatina A (Sigma, St Louis, MO), disuelto en DMSO; 20-80 g /ml Polyphenon E ® (Mitsui Norin, Japón) en lo sucesivo como los polifenoles del té verde (GTP) durante los tiempos indicados. Las concentraciones de 10 mg /ml Polyphenon E corresponden a 14 M EGCG como se determina por análisis de HPLC. Los constituyentes presentes en Polyphenon E® se describen anteriormente [20]. Los anticuerpos para anti-p53 (SC-126), anti-p21 /WAF1 (SC-397), anti-Akt (SC-8312), anti-Bax (SC-493), anti-BID (SC-6538), anti -HDAC1 (SC-7872), anti-HDAC2 (SC-6296), anti-HDAC3 (SC-11417), anti-HDAC8 (SC-11405), anti-FAS (SC-715), anti-FADD (SC- 5559), anti-p-FADD Ser194 (SC-12439), anti-caspasa-8 (SC-7890) y anti-β-actina (SC-47778) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos para H3 anti-histona (05-928), anti-histona acetil H3 Lys9 /18 (07-593) de Upstate (Merck Millipore, Billerica, MA), y el BID (44-4334) fue adquirido de Invitrogen Corporation (Camarillo , CA). Los anticuerpos para anti-caspasa-9 (# 9502), anti-caspasa-3 (# 9662), exfoliados PARP (# 9544), anti-c-IAP (# 3130), anti-X-IAP (# 2045), anti -SAPK /JNK (# 9258), anti-p-JNK Thr183 /Tyr185 (# 9251), anti-p-Akt Ser473 (# 4051), anti-BAD (# 9292), anti-p-BAD Ser136 (# 9295 ) y anti-VDAC (# 4866) fueron adquiridos de Tecnologías de señalización celular (Danvers, MA).
Generación de LNCaPshV y LNCaPshp53 células
células de empaquetamiento 293T se sembraron en placas de 100 mm de la día antes de la transfección en DMEM que contenía 10% de FBS inactivado por calor sin penicilina-estreptomicina. Las células se transfectaron con 6 g de shp53 o shGFP RNA (control), junto con construcciones de empaquetamiento de segunda generación (pCMV-dR8.74 y pMD2G) utilizando Lipofectamina Plus reactivo (Invitrogen Corp.) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el vendedor. Durante dos días subsiguientes, se recogió medios de comunicación y en capas sobre las células LNCaP después de la adición de 10 l de 4 mg /ml de polibreno por cada 10 ml y esterilizar a través de filtración.
Ensayo de proliferación de
El efecto de GTP sobre la proliferación celular se determinó mediante MTT [3- (4, 5-dimetil-tiazol-2-il) -2, 5-difenil tetrazoliumbromide] de ensayo y la inhibición del crecimiento se evaluó como la viabilidad por ciento, cuando se tomaron las células tratadas con vehículo como 100 % viable tal como se describe anteriormente [21].
azul de metileno de tinción y cuantificación
Las células se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos y se trataron con diversas concentraciones de camptotecina (50 a 200 ng /ml) durante 24 h. a continuación, los medios de comunicación se eliminó y las células fijadas con solución de azul de metileno después del tratamiento y las placas se mantuvieron en un agitador durante 1 h. Las placas se lavaron suavemente con agua doblemente destilada para eliminar el exceso de tinte, se secaron y escanearon.
Light Microscopy
células
LNCaPshV y LNCaPshp53 fueron cultivadas a 70% de confluencia y se trataron con 20 a 40 mg /ml concentración de GTP por 24 h. Las fotografías fueron capturadas con una ampliación x40 usando microscopio de luz.
Fragmentación del ADN Ensayo
Las células fueron cultivadas a aproximadamente el 70% de confluencia y se trataron con la concentración /ml 40 g de GTP durante 48 h. Las células se sometieron luego a procesamiento para el aislamiento de ADN y el ensayo de fragmentación. Las bandas se visualizaron bajo un transiluminador UV, seguido de la fotografía digital como se describe anteriormente [21].
Cell Death Ensayo
apoptosis celular se midió por
in vitro
determinación de histonas asociadas a fragmentos de ADN citoplasmáticos (mono y oligonucleosomas) después de la inducción de la muerte celular por inmunoensayo fotométrico de enzimas utilizando la célula kit ELISA de detección de muerte de Roche (Cat#11774425001) según el protocolo del proveedor. Brevemente, las células se trataron con 20 M LY294002 o 20 SP600125 mu M durante 8 h y 40 mg /ml GTP durante 16 h o en combinación para 24 h y extractos de células citoplásmicas se transfirieron a las placas de micropocillos recubiertas con estreptavidina con inmuno-reactivo que contiene anti- histona-biotina, anti-ADN-POD. Después de la incubación, se realizó la reacción enzimática y el color se leyó a 405 nm utilizando la longitud de onda de referencia como 490 nm. los valores de fondo (tampón de incubación solo) se restaron y los valores de DO que representan fragmentos de ADN nucleosomal en las muestras tratadas se compararon con los valores obtenidos a partir de células de control no tratadas, y se expresaron como veces de incremento.
Western Blot Analysis
las células se lisaron en el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) de tampón (que contiene 1% de NP40, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS en PBS, y recién añadidos completa cóctel inhibidor de proteasa (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN). la concentración de proteína en el lisado de células se determinó usando el ensayo de proteína con capacidad para un detergente de Bio-Rad (Hercules, CA). Las muestras de proteína se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. La membrana se incubó con el anticuerpo primario durante la noche bloqueados en 5% de leche sin grasa en PBS. Siguiente membrana días fue retirado de anticuerpo primario, se lavó con tampón de lavado y posteriormente se incubaron con peroxidasa de rábano picante apropiada (HRP) conjugado con anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. a continuación, la membrana se desarrolló con reactivo de quimioluminiscencia (GE Healthcare, Piscataway, NJ) y se expone a Hyblot CL autorradiografía película (Denville Científica, Metuchen, NJ). digitalización de la imagen y la cuantificación se realizaron con sistema de imágenes de Kodak 2000.
Extracción y expresión de proteínas histonas acetilados
cáncer de próstata humano y células LNCaPshV LNCaPshp53 fueron tratados con 20-80 mg /ml durante 24 GTP h y se recogieron a continuación, se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS) suplementado con butirato de sodio 5 mM. Después del lavado, las células se resuspendieron en tampón de extracción Triton [PBS que contiene 0,5% de Triton X-100 (vol /vol), 2 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 0,02% (peso /vol) NaN3] y se lisaron en hielo durante 10 min con agitación suave, se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 min a 4 ° C. El sedimento se lavó en tampón de extracción Triton y después se resuspendió en HCl 0,2 N. Las histonas se extrajeron ácido durante la noche a 4 ° C y se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Las muestras fueron procesadas para el análisis de las histonas mediante inmunotransferencia.
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) Ensayo
células LNCaPshV y LNCaPshp53 cáncer de próstata humano fueron tratados con dosis de 20-80 g /ml de GTP disueltos en PBS o sólo con PBS (control) durante 3 días. Al final del tratamiento, las células se incubaron en suero que contiene 1% de formaldehído durante 15 min a temperatura ambiente durante la reticulación. a continuación, reacción se terminó con 0,125 M de concentración final de glicina. La cromatina se digirió con la enzima nucleasa monococcal y se incubaron con la histona H3 acetilada anti (Cat#07-593; Upstate Biotechnology) anticuerpo durante la noche a 4 ° C. La reticulación se invirtió mediante la incubación de las muestras durante la noche a 65 ° C. El ADN se purificó usando solución de fenol-cloroformo-isoamilo con la extracción seguido de precipitación con etanol. a continuación, el ADN se resuspendió en agua libre de nucleasa. Los cebadores usados para el promotor del gen p21 /WAF1 fueron los siguientes: cebadores directos 5 'GTGGCTCTGATTGG CTTTCTG-3', 5'-cebadores inversos GTGAAAACAGGCAGCCCAAG-3 'y para el promotor del gen Bax, cebadores directos 5' TAATCCCAGCGCTTTGGAA-3 'y los cebadores inversa 5'-TGCA GAGACCTGGATCTAGCAA-3 ', respectivamente. Los ADN inmunoprecipitadas, perlas o los controles de entrada se someten a una reacción en cadena de polimerasa de amplificación (PCR) durante 30 ciclos de las siguientes condiciones en bicicleta: Etapa-1-95 ° C durante 2 min (1 ciclo), Etapa-2-95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min (30 ciclos), Etapa-3-72 ° C durante 3 min (1 ciclo). Los productos de PCR fueron sometidos a electroforesis utilizando 2% de gel de agarosa.
análisis del ciclo celular y de detección de apoptosis
El efecto de GTP en el ciclo celular y subG1 se midió mediante la realización de ensayo de citometría de flujo. LNCaPshV células y LNCaPshp53 fueron tratados con GTP y se cosecharon por tripsinización post-tratamiento (tanto fijado y las células flotantes de los medios de comunicación después del tratamiento) fueron recogidos. Las células se lavaron dos veces con PBS. Aproximadamente, 1 × 10
6 células fueron fijadas en 90% de metanol frío y se dejó en hielo durante al menos 30 minutos y se almacenaron a -20 ° C hasta el procesado de ciclo celular. Las células se sedimentaron, se lavaron, y se resuspendieron en 0,04 g /ml de yoduro de propidio y 100 mg /ml de RNasa en PBS. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min y citometría de flujo se realizó en el flujo EPICS XL-MCL citómetro y se analizaron usando software Modfit Cell Análisis de Quest para determinar el número de células en cada fase del ciclo celular.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se repitieron al menos dos veces por duplicado. Los resultados se expresan como valores medios ± SD. Las imágenes se digitalizaron y cuantificación se realizó mediante un programa de software con el sistema de formación de imágenes Kodak 2000. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett.
P
valores. & Lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
Aunque la eficacia de GTP en la inducción de la apoptosis en una variedad de tipos de células de cáncer ha sido bien documentado [22] - [24], el efecto de GTP en ausencia de anomalías de p53 no se ha investigado en detalle. Estudios anteriores han demostrado que la inactivación de p53 por siRNA en células LNCaP de cáncer de próstata humano mayor resistencia a la EGCG mediada apoptosis [25]. Para establecer de manera inequívoca el papel de p53 y para investigar las vías responsables del aumento de la resistencia celular, hemos generado células isogénicas con el fondo del vector de lentivirus por p53 desmontables de forma permanente en las células LNCaP para generar LNCaPshp53 y transfectadas con el vector de control para generar células LNCaPshV. Para determinar si los niveles de p53 afectan la respuesta de muerte celular, las células se trataron con isogénicas camptothechin, un agente contra el cáncer que daña el ADN que causa apoptosis en diversas células de cáncer humano [26]. Como se muestra en la figura 1A, el tratamiento con 50 y 100 ng /ml durante 24 h camptothechin dado lugar a un aumento significativo de las células LNCaPshV en la fase G1 del ciclo celular. En comparación con el control no tratado, el porcentaje de células en fase G1 aumentó de 67,36% a 79,62% y 86,22% después del tratamiento con 50 y 100 concentraciones ng /ml de camptotecina. Del mismo modo, las células exhibieron LNCaPshp53 fase de detención G1 después del tratamiento con camptotecina 74,43% y 71,42% después del tratamiento con 50 y 100 camptotecina ng /ml, en comparación con las células no tratadas con 62,51% en la fase G1. Además de detención en la fase G1, camptotecina también causó una acumulación significativa de células en fase subG1, indicativo de apoptosis. En comparación con las células no tratadas (3,37%), el tratamiento de células LNCaPshV con camptotecina aumentó de 34,91% a 50 ng /ml y 51,97% a 100 ng /ml en la fase sub-G1. Sin embargo, las células LNCaPshp53 eran más resistentes a la apoptosis mediada por camptothechin con 23,87% y 29,59% a 50 ng /ml y 100 ng /ml de dosis en la fase de subG1, en comparación con 1,71% en los controles no tratados. Se observaron resultados similares en el ensayo clonogénico donde desmontables de p53 dio como resultado una mayor resistencia a camptothechin mediada por la muerte celular (Figura 1B).
células isogénicas con-lentivirus vector fondo fueron generados por caída permanente de p53 en LNCaP células [LNCaPshp53] y transfectadas con el vector de control, las células LNCaPshV. [A] de células tratadas con 50 y 100 camptotecina ng /ml para se cosecharon 24 h, se tiñeron con PI y se analizaron por citometría de flujo para medir la sub-G1 y la población G1. [B] Las células se trataron con 50, 100 y 200 ng /ml de camptotecina durante 24 h y se tiñeron con azul de metileno. La intensidad de azul de metileno absorbido por las células vivas se midió spectrophotometerically después de eluir el colorante en HCl 0,1 N y en comparación con las células no tratadas. [C] Derribo de p53 regula positivamente la señalización Akt /BAD en células de cáncer de próstata. LNCaPshV células y se lisaron LNCaPshp53 y Western Blot se realizó para p53, Akt, proteínas P-Akt (Ser473), malo, p-BAD (Ser136). Actina se utilizó como control de carga interno. [D] intensidades relativas de p-Akt y de la proteína p-Bad en células LNCaPshV y LNCaPshp53RNA donde las bandas se normalizaron a la actina y expresado en valores relativos en comparación con la proteína nativa. Los detalles se describen en la sección de materiales y métodos.
Desmontables de p53 aumenta la supervivencia Akt vía de señalización
Dado que los estudios han demostrado que activa Akt puede conducir a la regulación a la baja de los niveles de p53 [27 ], se determinó el efecto de la próxima caída en los niveles de p53 Akt y sus objetivos de abajo. Como se muestra en la figura 1C, desmontables de p53 causó un aumento significativo en p-Akt (Ser473) y p-BAD expresión (Ser136) en células LNCaPshp53, en comparación con las células LNCaPshV. Un aumento de 2,0 veces en los niveles de p-Akt y 3,78 veces mayor en los niveles de p-BAD se observaron después de la caída de p53 en las células LNCaPshp53, en comparación con las células LNCaPshV (Figura 1D).
Los polifenoles del té verde inducir la apoptosis en los dos LNCaPshV las células y LNCaPshp53 independiente del estado de p53
Para caracterizar la condición de p53 en el efecto del tratamiento con GTP, se realizaron estudios posteriores en las células LNCaPshV y LNCaPshp53. Como se muestra en la figura 2A, el ensayo de MTT a cabo después de 24 h de tratamiento con la concentración /ml 20 a 80 g de GTP exhibió una inhibición dependiente de la dosis en la viabilidad celular a partir de 100% a 33,98% en LNCaPshV y 100% a 66% en las células LNCaPshp53. En comparación con las células LNCaPshp53, las células LNCaPshV eran más sensibles a GTP exposición en los primeros 24 h de tratamiento. Para estudiar los efectos de la exposición más prolongada a GTP, se realizaron estudios dependientes del tiempo con 40 mg de dosis /ml de GTP. El tratamiento de células con GTP causada marcada acumulación de células en fase G0 /G1; 71,02% a 84,57% en las células LNCaPshV, en comparación con 78,39% a 81,19% en las células LNCaPshp53 entre 48 a 96 h, respectivamente (Figura 2B). El número de células en subG1 también aumentó significativamente en 96 h de tratamiento post-GTP en ambas líneas celulares; 0.53% a 66.97% en las células LNCaPshV y 0,31% a 83,94% en las células LNCaPshp53, independientemente de su estado de p53 (Figura 2C). tratamiento GTP también dio lugar a la apoptosis de las células tanto LNCaPshV y LNCaPshp53 como se observa por microscopía de luz y ensayo de fragmentación de ADN (Figura 2 D & amp; E).
[A] Las células fueron expuestas a la concentración de 20 a 80 mg /ml de GTP durante 24 h, y la viabilidad de las células se determinó por el ensayo MTT. viabilidades celulares se representan como porcentajes; Las células tratadas con vehículo fueron considerados como 100% viables. Las barras representan la media ± desviación estándar de al menos dos experimentos independientes realizados por duplicado cada uno, **
p Hotel & lt; 0,001 representa diferencias significativas en comparación con el grupo control sin tratamiento GTP. [B] de la célula fueron tratados con 40 mg /ml GTP para 24, 48, 72 y 96 h y la distribución de las células se registraron en diferentes etapas del ciclo celular se analizaron utilizando el análisis FACS. [C] Las células fueron tratadas con 40 y 80 mg GTP /ml durante 96 h y el número de células sometidas a apoptosis se determinó mediante la medición de la población celular en la fase G1 sub del ciclo celular. Las barras representan la media ± desviación estándar de al menos dos experimentos independientes realizados por duplicado cada uno, **
p Hotel & lt; 0,001 representa diferencias significativas en comparación con el grupo control sin tratamiento GTP. [D] imágenes de microscopía óptica de las células LNCaPshV y LNCaPshp53 tratados con 40 y 80 mg /ml de GTP durante 96 h. tratamiento GTP exhibe cambios morfológicos consistentes con la apoptosis en estas dos células. [E] ensayo de fragmentación de ADN. Las células se trataron con la concentración /ml 40 g de GTP durante 48 h, se recogió para el aislamiento de ADN y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa, seguido por la visualización de las bandas con luz UV. Los detalles se describen en la sección de materiales y métodos.
Anteriormente se informó de que en las células de cáncer de próstata humano que contienen p53 funcional, GTP EGCG tratamiento constituyente regula al alza p53 y su fosforilación en residuos de serina críticos y p14
downregulation ARF-mediada de MDM2 en p53 dependiente de manera [28]. El tratamiento de células con concentraciones LNCaPshV 20-80 g /ml de GTP durante 24 h mostró un aumento dependiente de la dosis en p21 /WAF1, Bax y PUMA, abajo objetivos bien conocidas de p53, mientras que no se observaron alteraciones significativas en p-BAD y los niveles de P-Akt. En las células LNCaPshp53, el tratamiento GTP también resultó en un incremento dependiente de la dosis en la expresión de p21 /WAF1, Bax y PUMA, aunque no en la medida observada en células LNCaPshV, indicando tanto dependiente de p53 y la inducción de pro-apoptótica independiente de p53 proteínas en estas células (Figura 3A). Tras el tratamiento con GTP una disminución significativa de Akt y fosforilación de BAD fue evidente en las células LNCaPshp53. En consonancia con la apoptosis, se observaron aumentos dependientes del tiempo en la caspasa 9 escindida y la caspasa 3 en ambas líneas celulares (Figura 3B).
[A] Se trataron las células con 20 a 80 mg /ml de concentración de GTP para 24 h y Western Blot se realizó para p53, Akt, p-Akt (Ser473), p-BAD (Ser136), p21 /WAF1, PUMA y Bax proteínas BAD. [B] Las células se trataron con 40 mg de concentración /ml de GTP para 3, 6, 9, 12, 24 y 48 h y la transferencia Western se realizó para procaspasa-9, caspasa-9 escinden y se escindió de la caspasa-3 proteínas. Una mancha típica de actina demuestra un control interno de carga. El citocromo c de la mitocondria liberación de citosol se determinó por transferencia de Western en las células tratadas GTP. Una mancha típica de actina demuestra un control interno de carga para el citosol, mientras que VDAC como control de carga interna de la mitocondria. [D] Las células se trataron con 20 concentración mu M de inhibidor de PI3K-Akt LY294002 durante 8 h y con 40 g GTP /ml durante 16 h solo, o LY294002 durante 8 h seguido de tratamiento GTP en combinación seguida de Western blot para p-Akt , Akt, p-BAD BAD y proteínas. Las expresiones de las proteínas nativas se consideraron como controles de carga. [D] Medición de la muerte celular se realizó mediante inmunoensayo enzimático fotométrico Cell kit ELISA de detección de muerte. Las barras representan la media ± desviación estándar de al menos dos experimentos independientes realizados por duplicado cada uno, **
p Hotel & lt; 0,001 representa diferencias significativas en comparación con el grupo control. imágenes microscópicas [E] de luz de células LNCaPshV y LNCaPshp53 tratados con LY294002 y GTP solo o en combinación. Los detalles se describen en la sección de materiales y métodos.
A continuación, analizamos los efectos de la exposición de GTP en la ruta apoptótica aguas abajo, en concreto, los efectores de la cascada de muerte mitocondrial, mediante la evaluación de la liberación del citocromo C en el citosol. El tratamiento de células LNCaPshV y LNCaPshp53 con GTP aumentó significativamente los niveles de citocromo C en el citosol, que alcanzó su punto máximo a las 12 h post-exposición-GTP. Se observó la translocación del citocromo C de la mitocondria al citosol en ambas líneas celulares en una forma dependiente del tiempo (Figura 3B).
Los polifenoles del té verde inhiben la fosforilación de Akt Ser473 y aguas abajo objetivos en células LNCaPshp53
Anteriormente hemos demostrado que desmontables p53 dio como resultado un aumento de la expresión de Akt y aumentó su fosforilación en Ser473. A continuación se trataron ambas líneas celulares con GTP y /o LY294002, un inhibidor específico PI3K-Akt. La fosforilación de Ser473 y T308 activa Akt para fosforilar proteínas diana a través de su actividad de quinasa para promover la supervivencia y inhibir la apoptosis [29]. Como se muestra en la Figura 3C & amp; D, el tratamiento de las células con LY249002 causó una reducción en los niveles de P-Akt y dio como resultado un aumento de la apoptosis en ambas líneas celulares, aunque el grado de apoptosis fue mayor en las células LNCaPshp53. fosforilación de Akt similar, el tratamiento GTP inhibida a Ser473, que era consistente con aumento de la apoptosis, y el tratamiento combinado con GTP y LY294002 resultó en un nivel aún más alto de la muerte celular en las células LNCaPshp53 que en las células LNCaPshV. Consistentemente, la fosforilación de BAD se redujo significativamente como resultado de la disminución de la fosforilación de la actividad quinasa de Akt por LY294002 y GTP; esta correlacionado con el aumento de forma simultánea la muerte celular de las células LNCaPshp53. No se observaron efectos similares de menor magnitud en las células LNCaPshV (Figura 3 D & amp; E). Estos resultados demuestran que aunque la magnitud de la muerte celular causada por la exposición GTP es similar en ambas líneas celulares, las vías que conducen a la apoptosis son diferentes y pueden ser influenciadas por el estado de p53.
té verde polifenoles inducen la muerte del receptor Camino en las células de cáncer de próstata humano
con el fin de explorar posibles mecanismos implicados en la apoptosis inducida por GTP, el próximo enfocados en la vía extrínseca través de FAS. Como se muestra en la figura 4A, el tratamiento con GTP causó la inducción de la FAS dentro de 10 min en ambas líneas celulares, seguido por aumento de los niveles de fosforilados FADD en Ser194, mientras que los niveles totales de FADD se mantuvo sin cambios. Sin embargo, los niveles basales de FADD eran mucho más altos en las células LNCaPshp53 en comparación con células LNCaPshV.