Extracto
Antecedentes
El cáncer colorrectal (CCR) es considerada una enfermedad compleja, y por lo tanto la mayoría de la susceptibilidad genética se cree que está en la forma de variantes de baja penetrancia siguiendo un modelo poligénico de herencia. Los estudios candidato de genes han sido hasta ahora uno de los enfoques básicos tomados para identificar estas variantes de susceptibilidad. La participación constante de algunas rutas de señalización en la carcinogénesis prestado apoyo para los estudios basada en las vías naturales como estrategia para seleccionar genes que potencialmente podrían albergar nuevos loci de susceptibilidad.
Metodología /Principales conclusiones
Se seleccionaron dos principales rutas relacionadas con la carcinogénesis-: Wnt y BMP, con el fin de detectar los genes implicados en nuevas variantes de riesgo. A continuación, realizó un estudio de asociación de casos y controles en 933 casos de CCR y 969 controles basado en la codificación y SNPs reguladoras. También se incluyeron rs4444235 y rs9929218, que no cumplieron los criterios de selección sino que pertenecían a dos genes en la vía de BMP y constantemente se había vinculado a la CRC en los estudios anteriores. Ninguno de los dos alelos, ni los análisis genotípicos o haplotypic mostró ningún signo de asociación entre las 37 variantes tamizados y el riesgo de CCR. Ajustes por sexo y edad, y el análisis estratificado entre grupos esporádicos y de control no dió ningún resultado positivo tampoco.
Conclusiones /Importancia
A pesar de la relevancia de las dos vías en la patogénesis de la enfermedad, y el hecho de que este es el primer estudio que considera estas vías como un enfoque de selección de candidato-gen, nuestro estudio no presenta ninguna evidencia de la presencia de variantes de baja penetrancia de los marcadores seleccionados en cualquiera de los genes considerados en nuestra cohorte .
Visto: Fernández-Rozadilla C, de Castro L, J Clofent, Brea-Fernández A, X Bessa, Abulí A, et al. (2010) polimorfismos de nucleótido único en la Wnt y BMP vías y riesgo de cáncer colorrectal en una cohorte española. PLoS ONE 5 (9): e12673. doi: 10.1371 /journal.pone.0012673
Editor: Chun-Ming Wong, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 20 de mayo de 2010; Aceptado: 6 Agosto de 2010; Publicado: 9 de septiembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Fernández-Rozadilla et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Fondo de Investigación Sanitaria /FEDER (05/2031, 08/0024, 08/1276, PS09 /02368), la Xunta de Galicia (PGIDIT07PXIB9101209PR, Ministerio de Ciencia e Innovacion (SAF 07-64873), la Asociación Española Contra el cáncer (Fundación Científica y Junta de Barcelona), y la Fundación de Investigación Médica Mutua Madrileña. los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales formas de cáncer, siendo la segunda neoplasia más frecuente en ambos sexos y una de las causas más importantes de morbilidad en el mundo occidental [1]. La contribución genética a la CRC ha sido estimada en alrededor de un 35% de extensos estudios en gemelos [2]. Sin embargo, las variantes muy penetrantes, que causan síndromes de predisposición mendelianos, sólo para dar cuenta, como máximo, el 5% de los casos de la enfermedad [3]. La susceptibilidad genética restante se cree que seguir un modelo poligénico, con una interacción de múltiples alélica baja penetrancia variantes que aparecen en alta frecuencia en la población general, y cada uno que confiere un efecto modesto sobre el riesgo de la enfermedad [4], [5].
los estudios de gen candidato han sido una de las herramientas más utilizadas en la detección de nuevas variantes que afectan el riesgo de CCR. la selección de genes en estos estudios se basa principalmente en las implicaciones funcionales de una posible asociación, y por lo tanto los genes seleccionados o bien haber sido elegido debido a la presencia previa de otros alelos de riesgo alto /bajo [6], o su participación en una vía implicada en el patogénesis de la enfermedad [7]. Los estudios candidato de genes pueden llevar a cabo por cualquiera de los enfoques directos, en los que las variantes genotipo se supone que son la causa subyacente de la enfermedad debido a su ubicación (variantes en las regiones exonic o reglamentarias), o mediante métodos indirectos, en los que la etiqueta SNPs se aprovechan de las propiedades de desequilibrio de ligamiento del genoma humano para tratar de pantalla de la mayor parte de la variabilidad en un determinado gen.
Este último enfoque también ha permitido, junto con el desarrollo de tecnologías de alto rendimiento, la aplicación de la nueva hipótesis enfoques -free (en oposición con los enfoques candidato de genes basados en hipótesis), que abarca la mayor parte del genoma (estudios de asociación de genoma completo o GWAS). Esta aplicación ha llevado con éxito a la identificación de algunos de los nuevos loci de susceptibilidad [8] - [14], incluyendo rs4444235 y rs9929218, que caen dentro del alcance de dos genes que pertenecen a la vía de BMP. Sin embargo, estos se han encontrado para predecir sólo una pequeña proporción de la susceptibilidad a la enfermedad, con sin embargo, el restante de ser descubierto [15].
por lo tanto objetivo fue encontrar tales variantes de susceptibilidad a través de un enfoque de gen candidato cribado de una seleccionado número de variantes dentro de dos vías celulares que constantemente se han relacionado con la tumorigénesis CRC: la Wnt y BMP vías de señalización [16], [17]
la vía Wnt contiene genes que han sido durante mucho tiempo se sabe que. ser responsable de algunos síndromes hereditarios CRC, como
APC Opiniones y poliposis adenomatosa familiar [18]. Por otra parte, las alteraciones somáticas en
APC
se encuentran en casi el 80% de los cánceres colorrectales esporádicos, y la activación de la señalización de Wnt está implicada en la mejor parte de los carcinomas colorrectales esporádicos [19]. Por otro lado, la vía BMP actúa como regulador positivo de algunas de las proteínas Wnt [17], y el papel tumor supresor de esta vía de señalización en la patogénesis de la CRC y otros cánceres está bien establecida [20], [21]. Además, las mutaciones en dos de sus genes,
SMAD4
y
BMPR1A
, son responsables de síndrome de poliposis juvenil, otra condición hereditaria CRC [22]. Teniendo en cuenta toda esta información, pensamos que sería interesante examinar parte de la variabilidad genética dentro de estas vías para controlar si hay nuevas variantes relacionadas CRC que podrían explicar al menos parte de la heredabilidad faltante. Nuestro enfoque fue principalmente funcional, sólo para SNPs en exonic o
cis-regulador
secuencias (5 'y 3' regiones unstranslated) fueron seleccionados para analizar su relación con la susceptibilidad CRC.
Resultados y Discusión
Después de nuestro método de selección de candidato-gen basada en las vías, se realizó en nuestro estudio un total de 45 SNPs que se encontraban en las regiones ya sea exonic o reglamentarias, en un total de 21 genes de ambos las vías de Wnt y BMP. Los detalles de las características SNP y los valores de asociación de los 37 SNPs que pasaron con éxito los criterios de control de calidad se muestran en la Tabla 1. Ninguno de los SNPs seleccionados se asociaron significativamente con un riesgo alterado de la CRC, teniendo en cuenta las probabilidades de los coeficientes y los valores de p relacionados sobre alélicas y genotípicas (pruebas de tendencia, dominante y recesivo). Se realizó análisis de regresión logística para la edad y el sexo de ajuste, aunque no mejoró los resultados de valor p. Los resultados del análisis de haplotipos fueron consistentes en ambos unphased y Haploview, y no mostraron ningún signo de asociaciones positivas, ya sea para cualquiera de los 8 genes para los que se realizó este análisis (
AXIN1
,
HDAC9
,
BMP4
,
DACT1
,
CDH3
,
CDH1
,
BTRC
, y
APC)
, (Figura S1). También se llevó a cabo el análisis de la estratificación de la comparación de casos esporádicos y familiares, pero no proporcionó ninguna evidencia de diferencias en susceptibilidad entre los grupos que podrían ser una señal de todas las asociaciones específicas dentro de cualquiera de los grupos (Tabla 2).
por lo tanto, nuestra estrategia no ha logrado detectar cualquier nuevo locus de susceptibilidad para el riesgo de CCR.
expectativas basada en las vías han demostrado ser bastante desalentador en la literatura, así, por las vías de fuertes candidatos, tales como los de reparación del ADN, sorprendentemente no demasiado en la identificación de nuevas variantes de riesgo [7], [23] - [24]. Además de esto, la mayoría de las variantes genéticas que se han encontrado para ser asociado con la enfermedad se encuentran en regiones intergénicas, con las posibles funciones que son todavía desconocidos.
Sin embargo, a la luz de los recientes descubrimientos que realizaron el seguimiento el análisis de los datos de todo el genoma, tanto Wnt y BMP han ganado una fama renovada. El locus de susceptibilidad se encuentra en 8q24 (rs6983267) se ha relacionado con un Wnt mejorado la señalización a través de su interacción con TCF4 [25], [26], y un meta-análisis llevado a cabo en una serie de datos de GWAS tuvo éxito en asociar dos variantes en el
BMP4
y
CDH1
regiones de genes con la enfermedad (rs4444235 y rs9929218, respectivamente) [8].
A pesar de que este es realmente el primer estudio de asociación que se considera como las vías en su conjunto para la selección de genes, algunos de los genes incluidos en nuestro análisis (es decir,
APC, CCND1
,
CDH1
y
TCF7
) ya habían sido seleccionados para los alelos de riesgo [ ,,,0],6], [27] - [30]. Es muy notable que ha habido un creciente debate sobre algunos de estos loci, especialmente la variante p.V1822D en
APC gratis (rs459552). Este cambio de sentido erróneo está ampliamente documentada en la literatura, con algunos estudios que defenderla como neutrales (este estudio y otros) [31], y algunos que confiere su alelo menor un efecto protector [6], [28]. La falta de poder de estudio apropiado, resultante del número insuficiente de muestras ha sido un problema importante en muchos de estos estudios y por lo tanto la mayoría de ellos no han proporcionado resultados muy convincentes [32].
A pesar de que nuestro estudio tenía más del 80% de potencia para detectar o tan bajo como 1,21 con frecuencias menores alelo de 0,30 (57% de nuestros SNPs), y 1,24 para el MAF hasta 0,2 (78% de los SNPs), asumiendo un modelo log-aditivo y α = 0,05, que eran incapaz de detectar todas las asociaciones positivas que sugieren la presencia de nuevas variantes de susceptibilidad CRC. Sin embargo, es notable que, aunque nuestra incapacidad para replicar las asociaciones para la
BMP4
y
CDH1
SNPs, este es el primer estudio que investiga cualquiera de la llamada 10 nuevos GWAS -discovered loci de susceptibilidad en una población del sur-europea
.
a pesar de los resultados negativos, debemos tener en cuenta que no en absoluto cubrir de forma exhaustiva todas las posibles variantes de baja penetrancia dentro de los genes seleccionados. Esto se debe principalmente al hecho de que nuestra estrategia era puramente funcional, la selección de las variantes que eran
a priori
buenos candidatos para ser directamente asociados con la enfermedad. De hecho, esto puede constituir una limitación en el estudio, para la mayoría de la variación genética dentro de los loci no se investigó. Por lo tanto, creemos que deben realizarse más esfuerzos para explorar una variedad más amplia de loci dentro de estas vías, teniendo en cuenta especialmente las asociaciones positivas anteriores descritos hasta ahora para ambos genes relacionados con BMP y Wnt.
Reflexionando sobre los odds ratios de potenciales las variantes descritas hasta ahora (1.11, IC 1.08-1.15 y 0.91, IC 0.89-0.94 para rs4444235 y rs9929218, respectivamente), que asumen cohortes más grandes pueden ser necesarios para detectar tales efectos sutiles. Por otra parte, cuando se considera enfoques candidato-gen, también sería útil para meta-análisis de estudios previos y tire de la información a través de ellos por completo en la búsqueda de evidencias de posibles nuevas vías vinculados a la patogénesis de la enfermedad.
Materiales y Métodos
las poblaciones de estudio
los sujetos fueron 933 pacientes con CRC y 969 controles que pertenecían al proyecto EPICOLON, un estudio prospectivo, multicéntrico, estudio de la epidemiología basado en la población estudio de la incidencia y características de CRC familiar y esporádico en la población española [33]. Los casos fueron seleccionados a través de 11 hospitales en España como todos los pacientes con un
diagnóstico histológico de novo de adenocarcinoma colorrectal y que asistieron a 11 hospitales de la comunidad a través de España entre noviembre de 2006 y diciembre de 2007. Los pacientes en quienes CRC desarrolló en el se excluyeron contexto de la poliposis adenomatosa familiar o enfermedad inflamatoria del intestino, y los casos en que los pacientes o familiares se negaron a participar en el estudio. Las características demográficas, clínicas y relacionadas con el tumor de probandos, así como un historial familiar detallado se obtuvieron mediante un cuestionario preestablecido, y registrados en una base de datos única. De estos, 592 (63%) eran hombres y 341 (37%) hembra. La mediana de edad de los casos fue de 73 (rango 26-95), mientras que media fue de 71 (SD ± 10.7). controles basados en el hospital fueron reclutados junto con los casos y se confirmó que no tienen cáncer o antecedentes de neoplasia, y sin antecedentes familiares de CCR. Todos los controles fueron seleccionados al azar y se emparejan con los casos por sexo y edad (± 5 años) en una proporción de 01:01. Ambos casos y controles eran de ascendencia europea y desde España.
Ética declaración
El estudio fue aprobado por el "Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia", y cada una de las juntas de revisión institucional de los hospitales donde se recolectaron muestras ( "Comité de Ética del hospital Clínico-Barcelona", "Comité de Ética del hospital del Mar-Barcelona", "Comité de Ética de la Trias hospital alemán i Pujol-Barcelona", "Comité de Ética del hospital Sant Pau-Barcelona "," Comité de Ética del hospital Universitari Arnau de Vilanova-Lleida "," Comité de Ética del hospital general de Alicante "," Comité de Ética del hospital de Donosti "," Comité de Ética del hospital general de Asturias -Oviedo "," Comité de Ética del hospital Clínico-Zaragoza "," Comité de Ética del hospital de Calahorra-la Rioja "," Comité de Ética del hospital Meixoeiro-Vigo "). Todas las muestras se obtuvieron con consentimiento informado por escrito revisados por el comité de ética del hospital correspondiente
Extracción de ADN
se obtuvo el ADN a partir de sangre periférica congelada.; extracción se lleva a cabo en un robot Chemagen (Chemagen biopolímero-Technologie AG, Baesweiler, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en la Fundación Pública Gallega de Medicina Genómica en Santiago de Compostela. Los casos y controles se extrajeron en lotes mixtos para evitar cualquier tipo de sesgo.
Candidato-gen de selección
Tanto Wnt y BMP vías se seleccionaron inicialmente después de los resultados de Nishanian et al. [34], que demostró la interacción entre estas dos vías. Ambas vías se investigaron a fondo a través del sitio del Proyecto Anatomía del Genoma del Cáncer [35], pero no pudieron encontrar ninguna información con respecto a la vía BMP, ya sea en este u otros navegadores web. Por esa razón, los genes Wnt han sido seleccionados por navegar por la vía a través de Biocarta [36], mientras que los genes BMP tuvieron que ser seleccionado estrictamente de la literatura anterior [17], [34]. Cuarenta y un genes fueron finalmente seleccionados para ser incluidos en el análisis.
selección SNP y genotipado
criterios de selección SNP marcadores funcionales alelo con menor frecuencia sólo se consideran por encima de 0,05 y por lo menos dos criterios de validación independientes según lo establecido en dbSNP [37]. Esto incluye todas las variantes seleccionadas con exonic Pupasuite [38] y regiones gen regulador en
cis gratis (termina 5 'o 3' UTR), tal como se define por el navegador web FESD [39]. variantes 5'UTR se incluyeron sólo cuando se cumplan con los criterios antes mencionados y se presume que en el sitio de unión potencial de un factor de unión transctiptional conocido. 3 'UTR variantes se incluyeron debido a su posible relación con las regiones de unión miARN [40]. Debido a que algunos de los genes seleccionados no tenían SNPs de este tipo este tipo en cualquiera de los tres navegadores en el momento de la selección SNP, que al final tuvo que ser retirado del estudio. Por último, 43 SNPs se eligieron dentro de los 21 genes que se proyectarán como posibles modificadores directos de la susceptibilidad CRC (Tabla 3).
rs4444235 y rs9929218 son dos variantes que yacen en las regiones cercanas a-by y intrónicas de
BMP4
y
CDH1
, respectivamente, que se han informado recientemente que se asocia con la enfermedad [8]. Teniendo en cuenta que los SNPs que habíamos elegido dentro de estos dos genes no eran buenas etiquetadores para estas dos variantes (valores R-cuadrado fueron 0,6 para los SNPs en
BMP4
, y 0,02 para los de
CHD1
) (Figura 1), decidimos incluirlos en nuestro estudio, así, a pesar de que no cumplieron con los criterios de selección, por lo que el número total de SNPs interrogados aumente a 45.
R cuadrado relaciones entre SNP pares:. A. rs4444235-rs17563 en
BMP4
y B. rs9929218-rs1801552 en
CDH1
la genotipificación se realizó con el MassARRAY (Sequenom Inc., San Diego, EE.UU.) la tecnología en el nodo de Santiago de Compostela de la genotipificación Centro Español. Llamado de genotipos se realizó con el software v4.0 Sequenom Typer utilizando todos los datos del estudio de forma simultánea.
El análisis estadístico se realizó
El control de calidad, en primer lugar mediante la exclusión de ambos SNPs y muestras con éxito genotipo tasas por debajo del 95%, con la ayuda del filtro de genotipificación de datos (GDF) [41]. distribuciones genotípicas para todos los SNPs en los controles fueron consistentes con el equilibrio de Hardy-Weinberg como se evaluó usando un X
2 de prueba (1
df). Todos los valores p obtenidos fueron ≥0.05, excluyendo así la posibilidad de artefactos de genotipado (datos no mostrados). estratificación de la población se evaluó con Estructura v2.2 [42]. En pocas palabras, la posibilidad de diferentes escenarios se probó suponiendo un número diferente de las poblaciones subyacentes (k varía de 1 a 4), lo que permite un gran número de iteraciones (25 K en el período de ablande seguido de 500 K repeticiones). La probabilidad media logarítmica se estimó para los datos para un k dado (referido como L (K)) en cada serie. Tenemos así realizado múltiples carreras para cada valor de k calcular la media total L (K) y su desviación estándar. Todos los resultados parecían ser concordante con la suposición original de una única población existente. Por otra parte, los procedimientos adicionales para la visualización mejor variable de confusión se llevaron a cabo por medio de un Análisis de Componentes Principales (PCA) con la función EIGENSOFT
smartpca
[43], aunque el número de marcadores es muy baja. No se encontraron diferencias de estratificación de la población entre los casos y controles para la estructura o los 10 primeros componentes del análisis de componentes principales (Figura S2). Después del control de calidad 1746 muestras (854 casos y 892 controles) y 37 SNPs se mantuvieron para otros análisis.
Pruebas de asociación se realizaron mediante pruebas de chi-cuadrado para cada SNP y haplotipos en lo posible tanto con Haploview v4.0 [ ,,,0],44] y unphased [45]. En resumen, los patrones de LD a través de los genes para que se genotipo más de un SNP se verificaron en Haploview y la prueba de asociación utilizando unphased (para comprobar en cualquiera de los haplotipos se asoció) y Haploview (para ver cuál de los haplotipos estaba asociado). Las pruebas genotípicas de asociación, análisis de regresión logística para el sexo y la edad de ajuste, y el análisis estratificado entre los grupos esporádicos y familiares se estimaron con v1.03 PLINK [46]. los intervalos de confianza del 95% y O se calcularon para cada estadística, y para hacer frente a la cuestión de las múltiples pruebas, pruebas de permutación y la corrección de Bonferroni se utilizaron. potencia del estudio se calculó con el software de gatos [47].
Apoyo a la Información
Figura S1.
estructura de haplotipos y análisis de los 8 genes para los que se genotipo más de un SNP. La tabla muestra los valores de asociación para cada SNP generada por Haploview
doi:. 10.1371 /journal.pone.0012673.s001 gratis (3.40 MB TIF)
figura S2.
principal componente gráfico de análisis por primera vs. segundo componente, la comparación de nuestras poblaciones de casos y controles
doi:. 10.1371 /journal.pone.0012673.s002 gratis (0.96 MB TIF)
Nota S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0012673.s003 gratis (DOC 0,03 MB)
Reconocimientos
Estamos sinceramente agradecidos a todos los pacientes que participaron en este estudio que fueron reclutados en 11 hospitales españoles como parte del proyecto EPICOLON. Agradecemos a María Magdalena-Castro (MMC), Olga Lortes (OL) y Eva Fernández (EF) por su excelente asistencia técnica.