Extracto
Merkel poliomavirus de células (MCV) hace que la mayoría de los carcinomas de células de Merkel (MCC) humana y codifica un antígeno T pequeño (sT) que transforma los fibroblastos de roedores inmortalizadas
in vitro
. Para desarrollar un modelo de ratón para la carcinogénesis inducida por sT MCV, se generaron ratones transgénicos con una secuencia de MCV sT Flox Flox ventanilla recombinado de manera homóloga en el
ROSA
locus (
ROSA
sT
), lo que permite mediada por Cre, la expresión MCV sT condicional. estándar con tamoxifeno (TMX) la administración a adultos
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
ratones, en el que
Cre
se expresa de forma ubicua, dieron como resultado la expresión MCV St en múltiples órganos que era uniformemente letal dentro de los 5 días. Por el contrario, la mayoría de adultos
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
ratones sobrevivieron a dosis bajas de tamoxifeno, pero la administración desarrollada lóbulo de la oreja hiperqueratosis dérmica y hipergranulosis. MCV simultánea expresión condicional St y eliminación de p53 homocigotos generan multifocales, pobremente diferenciados, tumores anaplásicos altamente en los bazos e hígados de los ratones después de 60 días de tratamiento TMX. Fibroblastos embrionarios de ratón de estos ratones inducidos para expresar MCV sT mostraron un crecimiento celular independiente de anclaje. Para examinar la patología de células de Merkel, también se indujo la expresión MCV ST durante la mitad de la embriogénesis en las células de Merkel de
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
ST
ratones, que conducen a un aumento significativamente el número de células de Merkel en las cúpulas táctiles a finales de edades embrionarias que normalizaron después del nacimiento. la administración de tamoxifeno para adultos
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
ST
y
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
ST
;
p53f
lox /Flox
ratones no tuvo efectos sobre el número de células de Merkel y no indujo la formación de tumores. Tomados en conjunto, estos resultados muestran que la MCV sT estimula la proliferación de progenitores de células de Merkel en embriones de ratones y es una oncoproteína viral de buena fe que induce la transformación de células de cáncer completa en el
p53
entorno -null.
Visto : Shuda M, Guastafierro A, Geng X, Y Shuda, Ostrowski SM, Lukianov S, et al. Proliferación Celular (2015) de células de Merkel poliomavirus Pequeño T antígeno de cáncer induce y embrionarias Merkel en un modelo de ratón transgénico. PLoS ONE 10 (11): e0142329. doi: 10.1371 /journal.pone.0142329
Editor: Suzie Chen, de la Universidad de Rutgers, Estados Unidos |
Recibido: 24 Junio, 2015; Aceptado: 19 Octubre 2015; Publicado: 6 Noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Shuda et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NIH NCI R01CA136806, CA136363, CA170354, y Cátedras de la Sociedad Americana del cáncer para PSM e YC. MS fue apoyado en parte por la Universidad de Pittsburgh del cáncer de piel SPORE CA12197305. SMM fue apoyado por el NIH NIAMS R01AR05114, Richard King Mellon Institute for Pediatric Research. SMO fue apoyado por la Fundación de Dermatología y NIH NIAMS T32-AR007569. Este proyecto utiliza las instalaciones centrales Universidad de Pittsburgh Cancer Institute que se admiten en parte por el premio P30CA047904
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
poliomavirus de células de Merkel (MCV) está integrado por clonación en ~ 80% de los carcinomas de células de Merkel (MCC) y es actualmente el único poliomavirus humano conocido por ser oncogénico [1, 2]. Este virus fue la primera patógeno humano descubierto por un método RNAseq no dirigida llamado sustracción transcriptoma digital [3], un enfoque que ahora se utiliza comúnmente para descubrir y caracterizar los virus humanos [4]. El locus del antígeno T MCV codifica dos principales superposición de las transcripciones de la gran T (LT) y oncoproteínas pequeña T (ST) de antígenos [5, 6]. Todos los tumores MCV-MCC examinados hasta la fecha no sólo llevar a virus clonal integrada pero también poseen mutaciones LT específicos de tumores clonales que truncar el C-terminal y alteran las funciones de helicasa de la proteína LT [5, 7, 8]. p53 de orientación a través de un dominio de interacción bipartito del antígeno LT del virus vacuolizante Simian 40 (SV40) estrechamente relacionado es esencial para la actividad de transformación de SV40 LT. Sin embargo, hay análoga dominio p53 focalización ha sido identificado, ya sea para MCV LT o ST oncoproteínas [9-11].
MCV ST es un inhibidor de la promiscua ligasa E3 [12, 13] y por sí solo es suficiente para transformar fibroblastos de roedores líneas celulares [14]. MCV sT la transformación de células de roedores no requiere activa la proteína fosfatasa 2A actividad (PP2A) unión a [14]. En su lugar, una región llamada el dominio de estabilización T grande (LSD) se une e inhibe diversas proteínas de reconocimiento de ligasa E3 incluyendo Fbw7, Cdc20 y CDH1 [12, 13]. Las dos últimas proteínas son subunidades de reconocimiento para la promoción de complejos anafase /cyclosome (APC /C) y la expresión sT promueve mitótico detención prometaphase [13]. Esto a su vez aumenta la fosforilación de CDK1-dirigida de 4E-BP1 y la activación de la mitosis asociada a la tapa que dependen de la traducción (MACT) [14]. Las mutaciones en la MCV sT LSD eliminan transformación inducida por sT MCV, y desmontables de, ya sea LT o ST inicia la muerte celular o detención del ciclo celular de las células de MCC MCV-positivas [15, 16].
Recientemente, Spurgeon et al demostró que transgénica, impulsada por el promotor de la queratina 14 la expresión del antígeno T genómico derivado de MCC en la piel del ratón induce papilomatosis [17]. Del mismo modo, Verhaegen et al demostraron que la expresión transgénica MCV sT en ratones utilizando un 5 promotor de queratina (K5) induce lesiones hiperproliferativas que imitan carcinoma de células escamosas humano
in situ
[18]. Esta hiperplasia depende de una región LSD MCV sT intacto. Hasta la fecha, sin embargo, no hay modelos de ratón han demostrado que la expresión transgénica antígeno MCV T induce la neoplasia completa.
Hemos generado ratones transgénicos que expresan condicionalmente MCV pt desde el
ROSA26
locus para medir el potencial oncogénico de esta proteína viral. Confirmamos que la expresión MCV sT induce una respuesta hiperplásica en tejidos de la piel como se describió anteriormente. Además, demuestran que sólo la expresión prolongada MCV St en un contexto de p53 nula produce tumores malignos altamente anaplásicos, pobremente diferenciados en los órganos internos. Este requisito de múltiples contribuciones oncogénicos para la transformación completa es similar a la observada para c-Myc, Wnt-1 y SV40 LT [19-21]. También se encontró que la inducción MCV ST en las células de Merkel de embriones de ratones condujo a aumentos transitorios en el número de células de Merkel, pero no fue suficiente para causar la proliferación o la tumorigénesis en las poblaciones de células de Merkel adultos, independientemente de la condición de p53.
Resultados
Generación de MCV sT ratón transgénico
Un modelo de ratón transgénico con la expresión inducible MCV sT,
ROSA
sT
, se generaron en los C57BL /6 genética fondo. Para expresar la proteína condicionalmente MCV ST, con codones optimizados MCV St (STCO) cDNA fue clonado del vector aguas abajo de un
loxP-
flanqueado secuencia de ADNc de la neomicina fosfotransferasa con una secuencia 5 'homóloga al ratón
ROSA26
locus para generar
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco gratis (figura 1A). células
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco
fue entregado por recombinación homóloga en el locus ROSA26 de madre embrionarias de ratón (ES) (ver detalles en materiales y métodos).
(A) Diseño de
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco
, un ROSA26 ronda en construcción que codifica codones optimizados MCV jersey con secuencia de acompañamiento loxP-STOP-Neo-loxP (LNL), recombinado con el locus genómico ROSA26.
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco
ha cruzado con
UBC
CreERT2
o
Atoh1
CreERT2
ratones permite inducida por TMX recombinasa Cre escisión de la secuencia loxP-STOP-Neo-loxP que se traduce en la expresión MCV sT bajo el promotor CAG. expresión (B) MCV ST es letal en
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
ratones transgénicos. Curva de Kaplan-Meier de dosis alta (0,2 mg /g) y dosis baja (0,02 mg /g) TMX ratones inyectados. TMX inyección de dosis alta pérdida causada rápida de peso y los ratones alcanzaron el criterio de la eutanasia (20% de pérdida de peso corporal) dentro de los 5 días siguientes a la inyección (n = 4, sólido de color naranja). Supervivencia del control
UBC
CreERT2
ratones (n = 7, naranja de puntos) no fue afectada por la inyección de TMX.
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
ratones inyectados con dosis más baja TMX exhibieron una supervivencia significativamente prolongada en comparación con la dosis alta TMX (n = 18, sólido rojo) y los ratones de control no se vieron afectados (n = 10, salpicado de rojo) (C) Multi-expresión de la proteína del tejido MCV st en
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
ratones que murió inmediatamente después de la inyección de dosis alta TMX (& lt; 5 días). TMX inyección de dosis más baja induce la expresión de proteínas de menos MCV St en un ratón que murió en el día 7 después de la inyección como se detectó por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo generado contra el MCV ST, CM8E6 [22]. vector MCV sT o vector vacío transfectadas se utilizaron células HEK293 como un positivo y un control negativo, respectivamente. Igual cantidad de transfectadas-St lisados de células HEK293 fueron cargados para la normalización a través de diferentes manchas. Hsp70 /Hsc70 se detectó como un control de calidad de la proteína. expresión de la proteína (D) MCV sT se mantuvo en los tejidos de
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
ratones que sobrevivieron más de 70 días después de la inyección de dosis baja TMX. Las inmunotransferencias se realizaron como en (C). lisados de tejido de
ROSA
ST
se utilizaron como control negativo.
alto nivel de expresión en tejidos MCV sT es letal para los ratones
para inducir condicionalmente cre-loxP recombinación y la expresión del sT en múltiples órganos,
ROSA
sT
ratones se aparearon con
UBC
CreERT2
ratones que codifican la ubiquitina C humana promotor impulsado recombinasa Cre fusionado a una forma mutante triple de la activable receptor de estrógeno humano por tamoxifeno (TMX). Se examinó la expresión pt en dos niveles diferentes de dosificación TMX: alta dosis de activación TMX para promover la expresión St-amplia difusión, y la activación TMX-dosis baja en la que una fracción de las células estocástico en la mayoría de los tejidos se sometería a la recombinación y la expresión sT
.
Las dosis altas de CreERT2 la activación por una sola inyección intraperitoneal (ip) TMX (0,2 mg por gramo de peso corporal del ratón) para adultos
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
ratones inducida por la pérdida rápida de peso en todos los ratones analizados (n = 4). Estos ratones se convirtieron en deshidratado, menos activo en día 3 después de la inyección y alcanzaron el punto final de la pérdida de peso eutanasia 20% dentro de los 5 días. Ninguno de los ratones de control negativo para el
UBC
CreERT2
transgén mostró pérdida de peso apreciable después de la inyección TMX (figura 1B).
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
ratones no mostraron pérdida de peso en ausencia de inyección de TMX, y su supervivencia fue comparable a
UBC
CreERT2
y
ROSA
sT
ratones de control.
las dosis bajas de TMX, en el 10% de la dosis alta (0,02 mg /g), redujo notablemente la letalidad, con 72% (13/18) de los ratones supervivientes 10 o más días (n = 18) (Figs 1B y 2B) a pesar de una pérdida de peso constante durante el curso del experimento. Uno de esos ratón sobrevivió 144 días después de la inyección TMX antes de llegar al criterio de la eutanasia pérdida de peso del 20% y esto fue considerado entonces el punto final para el período de estudio.
(A) fenotipo hiperplásico en la piel de la oreja de
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
ratones. tejidos de la piel del oído de
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
ratones fueron sometidos a H & amp; E tinción. (B) fenotipo hiperproliferativo en piel de oreja de
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
ratones. H & amp; E secciones de piel teñidas de oreja a baja dosis inyectadas TMX
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
y
ROSA
ST
ratones fueron asignados al azar y se evaluó en una forma ciega por dos patólogos para la hiperqueratosis /hipergranulosis en el epidermis y el aumento de la celularidad anomalías /apéndice. N /A: No disponible desde los tejidos del oído eran normales y no se recolectan. . ND: no determinado
Independientemente de la dosis TMX, inmunotransferencia tejido de
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
ratones reveló la expresión generalizada MCV St en músculo, bazo, pulmón, hígado, riñón, intestino, corazón y los tejidos del cerebro de los ratones que murieron dentro de los 10 días después de la inyección TMX mientras que dosis bajas de TMX indujo menos tejido de expresión de proteínas st (figura 1C y la figura S1 A). Ninguna expresión ST fue detectada en
ROSA
ST
control de ratones de la misma camada. Para los ratones inyectados con dosis bajas de TMX y sobrevivir a & gt; 10 días, sin embargo, la expresión de proteínas MCV St en diversos tejidos se redujo en comparación con aquellos que sobreviven & lt; 10 días, con la proteína sT detectado sólo en los oídos, la piel, los músculos y los tejidos del cerebro por inmunotransferencia (Fig 1D). MCV expresión sT no era detectable, excepto en el músculo para
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
ratones sacrificados en el día 144 después de la inyección de dosis bajas de TMX. Se detectaron un aumento del número de células epiteliales TUNEL positivas en el intestino de los
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
ratones que recibieron dosis altas de múltiples TMX (una vez al día durante 3 días), en comparación con
ROSA
ST los ratones de control S1 gratis (FIG). Otros órganos, como el bazo, pulmón y riñón mostraron resultados similares (datos no mostrados).
Baja Dosis MCV sT Expresión Induce la hiperplasia epidérmica y dérmica en los tejidos del oído
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
ratones que sobrevivieron más de 42 días después de la inyección de TMX (n = 12), el examen externa bruta mostró golpeando engrosamiento bilateral y difusa de las aurículas. proteína MCV sT se detectó por inmunotransferencia de los tejidos del oído en 77,8% de los ratones (7/9, tres tejidos del oído no se cosecharon), y la inducción sT se asoció con la hiperproliferación de la dermis y la epidermis por microscopía en 61,1% (11/18) de
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
ratones (Figura 2A). MCV sT niveles de expresión de proteínas, sin embargo, no se asociaron con este fenotipo. Dos ratones supervivientes de más de 117 días (9F y 9M) exhibieron un fenotipo oído hiperplásico pesar de la falta de expresión de proteína detectable ST en las orejas. Ni
ROSA
ST
ni
UBC
CreERT2
ratones de control demostró este fenotipo oreja. Hematoxilina & amp; eosina (H & amp; E) tinción de tejido del oído espesado mostró hiperqueratosis del epitelio (90,9%, 10/11) y hipergranulosis (81,8%, 9/11) (Fig 2). Aparte de anomalías del oído macro y microscópicas, que hemos detectado ninguna otra lesión hiperproliferativa en este grupo de ratones que expresan ST.
MCV sT expresión induce aumento de la proliferación de fibroblastos embrionarios de ratón
Para investigar el fibroblasto dérmico proliferación y para determinar si MCV sT afecta a la proliferación celular en este modelo de ratón, se aislaron fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST Opiniones y
ROSA
ST
embriones.
in vitro
tratamiento con 500 Nm 4-hidroxi tamoxifeno (4-OHTMX) inducida por la expresión MCV St en
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
MEFs (n = 8), pero no los embriones
ROSA
ST
MEFs (n = 2 embriones) (Fig 3A). Algunos MEFs mostraron expresión MCV sT fugas, incluso en ausencia de 4-OHTMX tratamiento (S2A Fig). la expresión de c-Myc, que se ha demostrado que ha de estabilizarse por MCV sT [12], también fue aumentado por la expresión MCV sT (Fig 3 y S2B Fig). WST-1 ensayo de proliferación celular demostró que el crecimiento acelerado en
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
pero no
ROSA
ST
MEFs (Figura 3 y Figura S2 B).
(a) inducción de MCV sT en las células de fibroblastos embrionarios de varios ratones (MEF) de la camada por 4-OHTMX. MEFs extraen de
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
y
ROSA
ST
embriones se cultivaron en presencia o ausencia de 500 nM de 4 OHTMX durante 7 días. MCV St y c-Myc expresión de la proteína se detectó mediante inmunotransferencia. expresión de la proteína Hsp /Hsc70 se detectó como control de carga. expresión (B) MCV sT acelera la proliferación celular en células MEF. Proliferación de células MEF tratados con o sin 4-OHTMX se evaluó mediante ensayos WST1.
MCV sT Expresión de p53 ratones nulos Produce anaplásico, pobremente diferenciado-Neoplasia que expresan marcadores de linaje mixto en bazo y el hígado
Para evitar la mortalidad producida por la expresión MCV sT como se refleja en los altos índices de TUNEL en los tejidos y la muerte rápida de la pérdida de peso de los ratones experimentales, cruzamos
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
ratones con
p53
flox /flox
ratones para generar
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
flox /flox
ratones. En estos ratones, la administración simultánea TMX indujo la expresión MCV St y
p53
supresión de genes. Sin embargo, cuando la dosis alta (0,2 mg /g) TMX fue entregado ip, se detectó expresión MCV sT en múltiples tejidos y todos los ratones murieron dentro de los 5 días (n = 9), lo que sugiere que
p53
supresión no rescatar letalidad inducida por altos niveles de expresión sT (S3A Fig). Al igual que con los ratones de tipo salvaje de p53, las tasas de supervivencia a corto plazo para
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
flox /flox
ratones fueron mayores para los de baja dosis en comparación con dosis altas de TMX ratones (Fig S3 A) y el 42,3% de los tratados (11/26) los ratones murieron dentro de los 10 TMX días de la inyección de dosis baja. expresión de la proteína MCV sT generalizada también fue detectado en múltiples tejidos de estos ratones que murieron dentro de los 10 días de baja dosis TMX inyección (Fig S3 B).
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
flox /flox
ratones también exhibió la hiperqueratosis /hipergranulosis fenotipo piel de la oreja se ve en la p53 de tipo salvaje, ratones (Fig S4) ST-expresando.
Aproximadamente el 19% de los
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
flox /flox
ratones (5/26) sobrevivieron 60 días o más después de la baja dosis de tratamiento TMX (figura 4A). Cuatro de estos cinco (80%) ratones desarrollaron tumores de alto grado en los órganos internos visibles en la autopsia; tres ratones tenían tumores tanto en el bazo y el hígado, y uno tenía nódulos tumorales groseramente detectables en el bazo solo (figura 4B). Por microscopía de luz, las células tumorales tenían núcleos altamente pleomórficas que variaban drásticamente en tamaño y forma con múltiples nucleolos y hipercromatismo. Mitosis eran numerosas y las células tenían límites citoplasmáticos indistintos. Una encuesta inmunotransferencia de tejidos (Figura 4C y S5 FIG) demostró que sT se expresa fuertemente en estos tumores mientras que la expresión sT no era detectable en general bazos e hígados de larga duración
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
ratones o el tumor negativo
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
flox /flox
ratón (Figura 1D y S5 figura). sT expresión de la proteína en los tumores del bazo se detectó en el 75% (3/4) de los ratones portadores de tumor (Fig S5). sT expresión También se detectó por inmunotransferencia de un nódulo hepático representativa tomada de un ratón afectado (p53.7F, la figura 4C). Para algunos de estos ratones (2/5), MCV sT también se expresó en los tejidos del riñón y el examen histopatológico mostraron un marcado cambios proliferativos en los epitelios tubulares que van desde
las lesiones in situ
a lesiones malignas plenamente con invasión a través de las membranas basales. A pesar de la evidencia microscópica de neoplasia renal, tumores renales discretas no eran detectables mediante el examen macroscópico en la necropsia. La inmunohistoquímica mostró fuerte expresión de MCV sT de localización a las lesiones malignas del hígado y el bazo, y en las lesiones epiteliales hiperproliferativas malignas y del riñón (Fig 4D). Estos resultados se reprodujeron en la inyección de un medio de baja dosis TMX (0,01 mg /g). supervivencia de los ratones estaba inversamente relacionada con TMX dosificación de 0,01, 0,02 y 0,2 mg /g (Fig S3). 87,5% (7/8) de
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
; p53
flox /flox
ratones que sobrevivieron más de 60 días con 0,01 mg /g TMX tumores de alto grado desarrollados también en el bazo y /o los tejidos del hígado (datos no mostrados). No se observó la tumorigénesis por deleción del gen p53 solo en
UBC
CreERT2
; p53
flox /flox
ratones hasta 140 días después de 0,02 mg /g Tratamiento TMX (figura 4A). Mientras que la línea de germen de supresión de p53 en este modelo de ratón promueve la formación de tumores tan pronto como 50 días, se ha demostrado que postnatal deleción del gen p53 conduce a una incidencia de tumores de sólo el 3% incluso 600 días después de la transducción Cre recombinasa, lo que indica que el momento de la pérdida de p53 es un determinante crítico para la incidencia de tumores [23, 24].
(a) de ablación p53 no rescatar a los ratones de la letalidad inducida por sT MCV. Curva de Kaplan-Meier de dosis baja (0,02 mg /g) TMX inyecta
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
; p53
flox /flox
ratones (línea azul sólido, n = 26) y
UBC
CreERT2
; p53
flox /flox
ratones (línea punteada azul, n = 10). líneas de color rosa indican la supervivencia de
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
(línea continua) y
UBC
CreERT2 gratis (línea de puntos) con los ratones de tipo salvaje p53 como se muestra en la figura 1B para la comparación con el fondo p53 knockout (líneas azules). (B) la expresión MCV sT produce tumores
in vivo Hoteles en
p53
valor nulo. 80% (4/5) de los ratones que sobrevivieron más de 60 días después de la inyección TMX desarrollar tumores macroscópicos visibles en el bazo y el hígado. tejidos bazo y el hígado representativos con nódulos tumorales de p53.7F se muestran con los correspondientes tejidos normales de un ratón de control C57BL /6. (C) La inmunotransferencia de la expresión de proteínas MCV sT en hígado y bazo tejidos de ratón p53.7F) con tumores macroscópicos. El bazo, los músculos y los tejidos del oído mantienen constantemente la expresión sT más de 60 días después de la inyección TMX. sT expresión fue detectable en los tejidos del hígado mediante inmunotransferencia sólo de hígado con nódulos visibles (p53.7F ratón). proteína MCV sT se detectó utilizando anticuerpo CM8E6, y la expresión de Hsp /Hsc70 se utilizó como control de carga. (D) El panel superior muestra la neoplasia anaplásico en el bazo y el hígado. Se observó una serie de cambios proliferativos en el riñón, donde el epitelio tubular distal se ven afectadas más gravemente, pero glomérulos (punta de flecha negro), epitelios tubular proximal (*), y intersticiales tejidos son relativamente a salvo de cambios proliferativos. El panel central muestra una tinción inmunohistoquímica representante de la expresión de proteínas en sT tumor en el hígado, el bazo y el tumor de los tejidos renales de
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
; p53
flox /flox
ratones. Las muestras de tejido fueron immunostained con MCV St (CM5E1) de anticuerpos. (E) El panel superior muestra un tumor hepático inducido-ST con inmunorreactividad a alfa-actina de músculo liso (ASMA) y el panel inferior muestra K14 positividad en las células tumorales dispersas.
Para determinar la histogénesis de San neoplasia inducida, los tumores de
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
flox /flox
ratones fueron immunostained con marcadores de diferentes linajes: CD45 (pan-linfocito), CD68 (macrófagos), α-actina de músculo liso (ASMA-músculo liso ), citoqueratina 14 (epitelial), citoqueratina 8 (epitelial), molécula de adhesión neural (NCAM). Las células tumorales fueron uniformemente ASMA positivo. las células tumorales diseminadas mostró positividad para CK14 y NCAM (Figura 4E). No vimos ninguna tinción con los otros marcadores CD68 y CD45, incluyendo (S6 figura).
Ablación p53 se requiere para la transformación completa del MEF por MCV sT
Dado que MCV ST es una transformación oncogénica en los ratones p53 nula, se realizaron ensayos de transformación usando MEF aisladas de
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
,
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
flox /flox
,
UBC
CreERT2
;
p53
flox /flox
y
ROSA
ST
ratones. Tras el tratamiento de 4 OHTMX, clones de MEFs aisladas de dos independientes
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
Flox colonias /Flox
formada ratones 4 semanas después de la siembra de células individuales en el cultivo de agar blando (Fig 5A-5C). Ni la expresión MCV sT solo (
UBC
CreERT2
;
ROSA
ST
) ni p53 knockout solo (
ubc
CreERT2
;
p53
flox /flox
) inducida por la formación de colonias (figura 6B). Estos resultados son consistentes con nuestros
in vivo
resultados tumorigénesis.
(A) MCV sT induce la formación de colonias en agar blando en ausencia de p53 en células MEF. MEF células aisladas forma
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
,
ROSA
ST
,
UBC
CreERT2
; p53
flox /flox
y dos
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
; p53
flox /flox
embriones a partir de la misma camada fueron tratados con 500 nM 4OHTMX más de 7 días, y las células fueron sometidas a ensayo de formación de colonias en agar blando. Asteriscos (*) indican significación estadística
p. & Lt; 0
05
. (B) colonias en agar blando inducidos por la ablación de p53. ablación p53 solo no dio lugar a la formación de colonias. (C) Expresión de MCV St en MEFs de
UBC
CreERT2
; ROSA
ST
; p53
flox /flox
.
Wholemount, piel K8-inmunotinción muestra cúpulas táctiles de control de la misma camada (A, C, F, H, K),
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
ST gratis (B, D, G, I) y
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
ST
;
p53
flox /flox gratis (L) en los ratones que recibieron TMX P28 (A-D) o E14.5 (F-I, K, L). Edad en la cosecha de tejidos se muestra para cada par de paneles. (E, J, M) Gráficos que muestran los recuentos de células de Merkel por domo táctil para paneles de acompañamiento. * P & lt; 0,05, *** p & lt; 0,001. Barra de escala:. 10μm
MCV sT expresión aumenta embrionaria de células de Merkel Precursor proliferación pero no afecta a números de la célula de Merkel adulto o causa Tumorigénesis
MCC expresa marcadores fenotípicos más similares a las expresadas por residente de la piel, las células de Merkel normales. Para examinar el efecto de ST en este tipo celular específico, nos centramos en St a las células de Merkel por la cría de
ROSA
ST
ratones a los
Atoh1
CreERT2 /+
ratones [25]. Atoh1 es el factor de un grupo Atonal proneural básica hélice-bucle-hélice de la transcripción con la función de anti-oncogénica [26] que juega un papel crítico en el desarrollo de células de Merkel [27]. El
Atoh1
CreERT2 /+
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ROSA
ST
ratones y control de
ROSA
ST
camada recibieron una sola dosis de tamoxifeno (0,25 mg /g ) a través de una sonda oral en postnatal día 28 (P28) para activar la expresión sT específicamente en las células de Merkel [28]. piel de la espalda se cosechó 7 días o 12 meses más tarde y immunostained para el marcador de células de Merkel queratina 8 (K8). En ambos momentos, el número de células de Merkel por domo toque fue menor en
Atoh1
CreERT2 /+
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ROSA
ST
ratones en comparación con
Atoh1
+ /+
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ROSA
ST
ratones de control, en consonancia con los efectos ya se ha informado de heterocigosidad en el
Atoh1
locus [28] (Figura 6A-6E). En ningún momento nos encontramos con cúpulas táctiles con el número de células de Merkel excepcionalmente altos, las células de Merkel ectópicos o evidencia de la formación de tumores. Estos datos sugieren que la expresión sT solo en las células de Merkel adultos no induce la división celular o la carcinogénesis.
mitótico
Atoh1 células progenitoras
+ producen las células de Merkel maduros durante la embriogénesis tardía [28]. Para estudiar los efectos de la expresión pt en esta población, se administró tamoxifeno a las presas embarazadas en E14.5 y se recogieron los embriones en E18.5 o a los 5 meses de edad. Se encontró que E18.5
Atoh1
CreERT2 /+
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ROSA
ST
ratones tenían ~ 50% más de células de Merkel que los controles de la misma camada, mientras que el 5 meses de edad
Atoh1
CreERT2 /+
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ROSA
ST
ratones tenían ~ 30% menos de células de Merkel que sus hermanos de camada controles (Figura 6F-6J). No hay tumores se encontraron en cada edad. Estos datos son consistentes con la expresión sT promover la mitosis en las poblaciones de células que se dividen activamente, y demuestran que la cúpula toque el número de células de Merkel se regulan incluso en la cara de este aumento de la división. Al igual que en los animales adultos, la expresión MCV sT no transforma estas células.
Para determinar si la expresión sT combinado y la pérdida de p53 podrían promover la proliferación de células de Merkel, se administró a E14.5 TMX
Atoh1
CreERT2 /+
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ROSA
ST
;
p53
flox /flox
ratones y piel obtenida en P28. No se encontraron aumentos en el número de células de Merkel y no hay pruebas de la tumorigénesis (Figura 6K-6M). A diferencia de la neoplasia hígado y el bazo inducida por ST, estos datos sugieren que la expresión sT junto con
p53
eliminación es insuficiente para promover la división de células de Merkel o tumorigénesis sostenida.
Discusión
MCV sT transforma inmortalizado fibroblastos de roedores tales como Rat1 y NIH3T3 [14] y la expresión sT viral que se requiere para el crecimiento de líneas celulares de cáncer de MCV-positivos MCC [15, 16]. Nuestros datos actuales sugieren que la expresión de MCV en el contexto de la pérdida de p53 promueve lesiones neoplásicas completamente en ratones. Encontramos que MCV sT induce la proliferación de células de Merkel embrionario pero es insuficiente para recapitular completamente carcinoma de células de Merkel independientemente del estado de p53.
Recientemente, Verhaegen et al demostraron que la expresión de St-epitelio específica utilizando un promotor K5 en ratones C57BL /6 ratones inducida por lesiones hiperplásicas se asemejan a carcinoma de células escamosas
In situ
[18]. Este efecto proliferativo fue mediada a través del dominio MCV sT LSD, que se ha encontrado para apuntar múltiples E3 ligasa proteínas supresoras de tumor [12, 13]. En contraste, se encontró que la inducción postnatal ubicuo de expresión MCV sT era uniformemente letal para ratones después de la inyección TMX de dosis alta. Nuestro modelo de ratón transgénico emplea una MCV sT cDNA de codones optimizados, lo que resulta en la expresión de proteínas mayor que la secuencia de cDNA sT natural (datos no mostrados), y los efectos citotóxicos de aumento de los niveles de expresión MCV sT puede dar cuenta de esta diferencia. Del oído, la piel, los músculos y los tejidos del cerebro mantienen la expresión St Long TMX después de la inyección de dosis baja, lo que sugiere que los ratones pueden tolerar la expresión quimérica de MCV ST.
Spurgeon et al. también informó de que cuando el antígeno T genómico derivado de tumor (tanto sT y MCC derivan-LT truncado) se expresa bajo un promotor K14 constitutiva en N ratones FVB /fondo (
K14-MCPyV168), dos tercios de los ratones son viables, mientras que el resto de los ratones murieron o fueron sacrificados a una edad temprana debido a la desnutrición [17].