Extracto
El papel de la
WDR3
gen de la inestabilidad genómica se ha evaluado en un grupo de 115 diferenciado cáncer de tiroides (CDT) pacientes. La inestabilidad genómica se ha medido de acuerdo con la respuesta de los linfocitos de sangre periférica a la radiación ionizante (0,5 Gy). La respuesta se ha medido con el ensayo de micronúcleos (MN) la evaluación de la frecuencia de células binucleadas con MN (BNMN), tanto antes como después de la irradiación. , No se observaron diferencias entre genotipos, para las frecuencias anteriores BNMN la irradiación. Sin embargo disminuciones significativas en el daño del ADN después de la irradiación se observaron en los individuos que llevan los alelos variantes para cada uno de los tres SNPs genotipo: rs3754127 [-8,85 (-15,01
a
-2,70), P & lt; 0,01]; rs3765501 [-8,98 (-15,61
para
-2,36), P & lt; 0,01]; rs4658973 [-8,70 (-14,94
para
-2.46), P & lt; 0,01]. Estos valores corresponden a los obtenidos asumiendo un modelo dominante. Este estudio demuestra por primera vez que
WDR3
puede modular la estabilidad del genoma
Visto:. García-Quispes WA, el pastor S, P Galofré, Biarnés J, J Castell, Velázquez A, et al . (2012) Posible papel de la
WDR3
gen en el genoma de estabilidad en los pacientes con cáncer de tiroides. PLoS ONE 7 (9): e44288. doi: 10.1371 /journal.pone.0044288
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, España |
Recibido: 17 Abril, 2012; Aceptado: August 1, 2012; Publicado: 26 Septiembre 2012
Copyright: © García-Quispes et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Ministerio español de Educación y Ciencia (SAF2007-6338) y la Generalitat de Catalunya (CIRIT; 2009SGR-725). W. A. García-Quispes fue apoyado por una beca predoctoral de la Universidad Autónoma de Barcelona (PIF). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cromosoma 1p12 región se ha asociado a diferentes tipos de cáncer, incluyendo el cáncer diferenciado de tiroides (CDT) [1], [2]. Estudios previos realizados por nuestro grupo en esta región han encontrado que el
WDR3
gen, mapeado en esta región, muestra una asociación significativa con el DTC, lo que sugiere su implicación en la etiología del cáncer de tiroides [3].
existe poca información sobre el papel de
WDR3
, pero se sabe que pertenece a una familia de genes eucariotas que llevan WD repite [4]. repeticiones WD se conservan mínimamente regiones de aproximadamente 40 aminoácidos, típicamente entre corchetes por Gly-His y Trp-Asp, que pueden facilitar la formación de complejos multiproteicos o heterotrimeric. Dado que las proteínas de repetición WD-no existen en los genomas de procariotas, se supone que probablemente surgieron en los precursores inmediatos de eucariotas [5]. Las proteínas pertenecientes a la familia de repetición WD están involucrados en una variedad de procesos celulares; incluyendo la progresión del ciclo celular, la transducción de señales, la apoptosis y la regulación de genes [6]. En lo que respecta a la
WDR3
gen, se debe mencionar que codifica una proteína nuclear de 943 aminoácidos que contiene 10 WD repite [4]. Este gen está implicado en la progresión del ciclo celular y la transducción de señales [7] y, a pesar de la función específica de
WDR3
es desconocida, un papel en la biogénesis de ribosomas Recientemente se ha informado [8].
Dado que ninguna de las funciones atribuidas a WDR3 puede estar asociado específicamente con el cáncer de tiroides, la hipótesis de que tal vez está implicado en mecanismos más generales mantenimiento de la estabilidad genómica. En consecuencia, las variaciones en la función
WDR3 servicios asociados con la existencia de polimorfismos genéticos pueden generar inestabilidad del genoma que pueden dar lugar a un mayor riesgo de cáncer. En este contexto, se debe indicar que se ha informado de proteínas ribosomales que también participan en el mantenimiento de la integridad del genoma [9].
Aunque la inestabilidad genómica es un parámetro complejo, una característica general de los individuos que muestran enfermedades como Fanconi de anemia o ataxia telangiectasia es una respuesta pobre frente a los agentes que afectan la integridad del genoma, como es el caso de la radiación (IR) ionizante. Por lo tanto, la radiosensibilidad se considera un biomarcador de la inestabilidad genómica [10]. Para determinar si un gen candidato está involucrada en la estabilidad genómica, es preciso demostrar que las células portadoras de diferentes polimorfismos genéticos son especialmente sensibles frente a la acción del IR.
A continuación, se evaluó la relación entre los tres no codificante de un solo nucleótido polimorfismos del
WDR3
gen y la frecuencia de micronúcleos, tanto espontánea como después de la exposición IR. El estudio se ha llevado a cabo en linfocitos de sangre periférica de un grupo de 115 pacientes con CDT, y se han evaluado los niveles de daño del ADN mediante el ensayo de la citocinesis-bloque de micronúcleos (CBMN), debido a que es una técnica citogenética bien establecido con muchos ventajas sobre otros métodos citogenéticos. En este contexto, hay que subrayar que ha sido bien demostrado que el ensayo de CBMN es muy útil como un marcador de la espontánea e inducida daño en el DNA [11] - [13].
Materiales y Métodos
declaración ética
el estudio fue aprobado por los comités de ética del hospital Universitario Vall d'Hebron de Barcelona, y el hospital Universitari doctor Josep Trueta de Girona (España).
Población estudiada
el estudio se llevó a cabo en un total de 115 pacientes con cáncer de tiroides, 93 (81%) mujeres y 22 (19%) hombres, reclutados tanto del hospital Universitari Vall d'Hebron en Barcelona, y el hospital Universitari doctor Josep Trueta de Girona (España). La edad media al diagnóstico fue de 43.30 ± 15.07 (media ± DE) años y 49.76 ± 16.49, cuando se obtuvo la muestra. De acuerdo con el tipo de tumor, 99 (86%) de los pacientes fueron clasificados como papilar y 16 (14%) como folicular.
Las muestras de sangre se recogieron antes del tratamiento de yodo (
131I), después de obtener un consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. Todos los participantes completaron un cuestionario, que abarca preguntas estándar demográficos, así como una breve ocupacional, y la historia médica familiar. La clasificación histológica del tumor se obtuvo de los registros médicos. Todos los participantes firmaron un consentimiento por escrito.
Cultivo celular y tratamiento con IR
El ensayo de micronúcleos citocinesis-bloque (CBMN) se llevó a cabo utilizando la técnica de citocalasina B y siguiendo un procedimiento estándar [14]. Las muestras de sangre fueron tomadas por punción venosa y 0,5 ml de sangre heparinizada se diluyó con 4,5 ml de medio de cultivo completo que consiste en RPMI 1640, suplementado con suero de 15% fetal bovino, 1% de antibióticos (penicilina y estreptomicina) y 1% de L-glutamina; todos los productos químicos se obtuvieron de PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria. Los linfocitos fueron estimulados a dividirse con un 1% fitohemaglutinina (PHA) (Gibco San Diego, EE.UU.) inmediatamente después del tratamiento con IR.
Se establecieron cuatro cultivos por cada donante. Dos de ellos fueron irradiadas con 0,5 Gy 137Cs los rayos gamma, mientras que los otros dos permanecen sin tratar. La irradiación se llevó a cabo en la Unitat Tècnica de Protecció Radiológica (UTPR-UAB) de la Universidad Autónoma de Barcelona. La tasa de dosis fue de 6,00 Gy min
-1. Los linfocitos (irradiados y no irradiados) se cultivaron a 37 ° C durante 72 horas. En 44 horas después de la estimulación con PHA, se añadieron 10 l (3 mg /ml) de citocalasina B (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) para dar una concentración final en el cultivo de 6 mg /ml. Los cultivos se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO
2.
recolección de células y MN puntuación
Las células se recogieron por centrifugación (10 min a 120 g). Se desechó el sobrenadante después de cada centrifugación. El tratamiento hipotónico se llevó a cabo añadiendo 5 ml de KCl 0,075 M a 4 ° C durante 10 min. A continuación, se centrifugaron las células y una mezcla de metanol /ácido acético (03:01 v /v) se añadió suavemente. Esta etapa de fijación se repitió dos veces y las células resultantes se resuspendieron en un volumen pequeño de solución de fijación. preparaciones secadas al aire se realizaron y los portaobjetos se tiñeron con Giemsa al 10% (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) en tampón de fosfato (pH 6,8) durante 7 min. Las láminas fueron codificadas por una persona no involucrada en el marcador.
Para detectar el nivel de daño genético, se evaluó la frecuencia de células binucleadas con micronúcleos (BNMN). Una puntuación cegado de 1000 células binucleadas por muestra se analizaron para determinar la presencia de micronúcleos, de acuerdo con los criterios estándar (irradiados y no irradiados) [14].
SNP selección
Los polimorfismos utilizado en este estudio fueron seleccionados de acuerdo con nuestros análisis anteriores [3]. Por lo tanto, se seleccionaron tres etiqueta SNPs que muestran asociación de haplotipos con cáncer de tiroides, rs3754127 (C /T, 5 ', cerca de genes), rs3765501 (G /A, intrón) y rs4658973 (T /G, intrón).
extracción de ADN y genotipado SNP
se aisló el ADN a partir de sangre periférica, usando el método de fenol-cloroformo estándar. El genotipado de SNP se realizó en el Centro Nacional de genotipado (CeGen) utilizando la técnica de IPLEX (Sequenom) y se genotipo con éxito de acuerdo con los criterios de control de calidad de la CeGen (http://www.cegen.org). Para asegurar la fiabilidad de genotipificación, se seleccionaron al azar 10% de las muestras y doble genotipo por réplicas en placas de pocillos múltiples 96. Además, dos tríos de referencia HapMap se incorporaron en placas y la concordancia genotipo y la herencia mendeliana correcta fueron verificadas.
El análisis estadístico
El análisis de las diferencias, el desequilibrio de ligamiento y estimación de las frecuencias de haplotipos se llevaron a cabo utilizando la herramienta web para SNPStats análisis de SNP [15]. Se realizaron modelo de regresión lineal para la herencia dominante y codominante. Todos los análisis se ajustaron por edad, sexo y diagnóstico histológico. Haplotipo análisis se realizaron utilizando la misma herramienta web. software Haploview [16] se utilizó para examinar el LD entre SNPs. Otros análisis estadísticos se realizaron utilizando R versión 2.12.1 [17].
Resultados
Características generales de los pacientes con CDT seleccionados se resumen en la sección de Materiales y Métodos. Como se ha indicado, la proporción de mujeres fue mayor que la de los hombres, lo que refleja la mayor incidencia de DTC en mujeres. Además, la incidencia elevada de la cáncer papilar de tiroides indica el predominio de este subtipo histológico.
Tabla 1 muestra que la media de la frecuencia BNMN espontánea en los 115 pacientes fue de 6,87 ± 0,55 (media ± SE). Los valores BNMN mostraron un aumento de 4,6 veces (31,35 ± 1,5) después de la exposición a 0,5 Gy de radiación ionizante, en cuanto a los niveles espontáneos. Estas diferencias entre la frecuencia de irradiación BNMN espontánea y después fueron, como era de esperar, estadísticamente significativa (P & lt; 0,001). Por otra parte, aunque la media de BNMN espontánea fue mayor en las mujeres (7,19 ± 0,65) que en los varones (5,51 ± 0,94) esta diferencia no alcanzó significación estadística (p = 0,339). Por otro lado, no se observaron diferencias entre las hembras y los machos después de la irradiación (31,19 ± 1,70 y 31,01 ± 3,11; respectivamente, p = 0,833).
Los valores BNMN espontáneas en el subtipo de pacientes con cáncer papilar de tiroides mostró una disminución ligera pero no significativa, en comparación con el subtipo folicular (6,64 ± 0,57 y 8,31 ± 1,82; respectivamente, P = 0,559). Los valores de BNMN después de la irradiación no se muestra diferencias significativas entre los dos subtipos (31,71 ± 1,50 y 29,13 ± 5,53; respectivamente, P = 0,553).
En la Figura 1 se observa la buena correlación que existe entre el BNMN espontánea valores y los observados después de la irradiación (R
2 = 0,28, P & lt; 0,001). Esto indicaría una causa genética subyacente.
También hemos evaluado la tasa de proliferación celular utilizando el índice de proliferación citocinesis-bloqueado (CBPI). El valor CBPI indica el número medio de ciclos celulares por célula [18]. Los resultados (datos no mostrados) indican una disminución significativa de CBPI en cultivos expuestos a la radiación ionizante (P & lt; 0,001).
Las diferencias y sus intervalos de confianza del 95% se calcularon por análisis de regresión lineal utilizando como referencia la genotipo homocigótico para el alelo más frecuente, con ajuste por edad, género y diagnósticos. La Tabla 2 muestra las diferencias observadas en los valores BNMN espontáneas, de acuerdo con los diferentes polimorfismos, teniendo en cuenta el modelo codominante de herencia. Para la frecuencia BNMN espontánea se encontraron pequeñas diferencias entre genotipos para todos los polimorfismos evaluados. Curiosamente, en todos los casos los valores BNMN fueron mayores en los genotipos de referencia (homocigotos para el alelo común), pero estas diferencias no alcanzaron significación estadística.
El análisis de haplotipos se realizó durante los tres SNPs de WDR3 y la Los resultados se indican en la Tabla 3. Tres haplotipos se prevé que tenga una frecuencia & gt; 0,01. Los otros haplotipos se prevé que sea demasiado extraño para un análisis estadístico significativo. No se observaron diferencias significativas en ninguno de los haplotipos más frecuentes con los valores BNMN espontáneas.
Los medios para las frecuencias BNMN fueron significativamente diferentes según el genotipo entre los tres
WDR3
polimorfismos (Tabla 4) . Hemos observado diferencias en el promedio frecuencias BNMN en presencia del alelo menor después de la exposición a la radiación ionizante que sugiere un modelo de herencia dominante. Por ejemplo, el rs3754127 C /T-T /T genotipos mostró una disminución de la frecuencia BNMN comparación con los individuos CC (véase la Tabla 4). Del mismo modo, también encontramos una disminución en el daño inducido por la radiación por haplotipo al combinar el alelo menor de cada uno de los tres SNPs genotipo [-4.9 (-9,16
para
-0.63), P = 0,026] (véase . Tabla 5)
Cuando se realizó el análisis de la estratificación de la población por el tipo de tumor al momento del diagnóstico (folicular o papilar), el subgrupo papilar mostró valores después de la irradiación similares a los de la población general: rs3754127 [-8.39 (-14,45--2,33), P & lt; 0,01]; rs3765501 [-8,83 (-15,37--2,29), P & lt; 0,01]; rs4658973 [-8,36 (-14,46 a -2,27), P & lt; 0,01], todo por el modelo dominante. Por otro lado, el efecto observado para el subtipo folicular después de la irradiación fue mayor que en papilar y en los pacientes con CDT generales; Sin embargo, las diferencias no fueron estadísticamente significativas, probablemente debido al bajo número de individuos: rs3754127 [-27,78 (-55,54 a -0.02), P = 0,074]; rs3765501 [-28,67 (-62.46 a la 5.12), p = 0,12]; rs4658973 [-29,10 (-60,26 a 2,06), p = 0,094], todo por el modelo dominante.
Discusión
En este estudio hemos demostrado una relación significativa entre los tres polimorfismos seleccionados de la
WDR3
gen y los niveles de daño del ADN después de un tratamiento con IR. Esto indicaría un papel de WDR3 en el mantenimiento de la estabilidad genómica.
WDR3
gen codifica una proteína nuclear que contiene 10 WD repite con función desconocida [4] y los miembros de esta gran familia son estructuralmente relacionadas, pero funcionalmente diversa. Algunas de las funciones celulares o vías reguladas por los miembros de esta familia incluye la regulación génica, transducción de señales, procesamiento del ARN y empalme, homing de los linfocitos, la regulación de la progresión del ciclo celular, la división celular /separación de la cromatina, y la diferenciación de células /tejidos, entre otros, tal como fue revisado [5], [6]. Sin embargo, hasta ahora no hay información que indique una posible participación en los mecanismos de reparación o influencia, en el mantenimiento de la estabilidad genómica de
WDR3
, o por cualquier miembro de su familia.
Con el objetivo de encontrar una explicación razonable para la asociación observada entre la
WDR3
polimorfismos y la incidencia de DTC, ya hemos informado la sobre regulación de
WRD3
en diferentes líneas celulares de cáncer de tiroides, lo que sugiere su posible implicación en la tiroides la tumorigénesis del cáncer [3]. Esto estaría de acuerdo con los estudios llevados a cabo en la línea celular de carcinoma de mama MCF-7, que muestra que la supresión de
WDR3
reducir la proliferación celular, disminuir el tamaño celular y reducir la formación de focos, lo que indica que
WDR3
confiere un crecimiento y una ventaja proliferativa en las células del cáncer [8]. La proteína WDR3 se redistribuye dentro del núcleo cuando se interrumpe la biogénesis de ribosomas. eventos celulares parecen estar influidos por la regulación de la expresión de
WDR3
alterar la biogénesis de ribosomas [8]. La disminución de los cambios transitorios en los niveles de proteínas de reparación del daño de ADN (no homóloga unión de extremos proteínas) se han observado en el nucleolo después de exposición a radiación ionizante; Por lo tanto, parece posible que estas alteraciones reflejan una respuesta biológicamente relevante para dañan el ADN de doble filamento romper [19].
Nuestros hallazgos sugieren una correlación entre los alelos de frecuencias menores para rs3754127, rs3765501, rs4658973 polimorfismos y los valores más bajos de daño en el ADN, después del tratamiento con radiación ionizante. Aunque los SNPs utilizados en nuestro estudio no producen cambios de aminoácidos en la secuencia de la proteína, se sabe que no codificantes polimorfismos de nucleótido único pueden alterar la expresión de genes [20]. Modificaciones cerca de la secuencia del promotor (rs3754127) pueden interrumpir la correcta interacción con factores de transcripción cambiar totalmente la expresión de genes o influir en el nivel de expresión [21]; esto significa que la transcripción de WDR3 podría depender de la variación genética en su región promotora. A pesar de splicing alternativo, debido a la presencia de SNPs, probablemente producirse [22], [23], es preciso señalar que los transcritos alternativos también son inducidos por la radiación [24] ionizante. Por lo tanto, los polimorfismos en rs3765501 y /o rs4658973 también pueden influir en corte y empalme alternativo, no sólo debido a su presencia, sino también por los efectos adicionales o diferenciales con los efectos de la radiación ionizante. Alternativamente, cualquiera de estos polimorfismos pueden ser responsables de la disminución del daño al ADN después de IR, pero actúan como marcadores genéticos de variantes genéticas de WDR3 que participan directamente en la estabilidad genómica WDR3.
Los efectos observados, lo que indica la implicación de
WDR3
en el mantenimiento de la estabilidad genómica después de la exposición a IR, estarían de acuerdo con la asociación encontró con DTC y con el papel que se atribuye en la biogénesis de ribosomas. Por lo tanto, las alteraciones en la expresión de
WDR3
interrumpirían las vías de señalización que existen entre la biogénesis de ribosomas y p53 activación [8]. Todos estos resultados en conjunto sugieren un papel importante de
WDR3
en el mantenimiento de la estabilidad del genoma, así como en la regulación de la carcinogénesis y el ciclo celular. Los resultados preliminares interesantes con los pacientes de cáncer de colon (V. Moreno, comunicación personal) parecen indicar una expresión alterada de
WDR3 Hoteles en cáncer de colon, el apoyo a nuestro punto de vista, proponiendo un papel de WDR3 en la estabilidad genómica y cáncer. Nuestros datos son lo suficientemente interesante como para llevar a cabo estudios adicionales en
WDR3
la expresión génica para confirmar esta hipótesis.
Reconocimientos
Agradecemos a todos los sujetos que participaron en este estudio, así como a los miembros del Servicio de Medicina Nuclear del hospital Vall d'Hebron (Barcelona) y la Unidad de Endocrinología del hospital Josep Trueta (Girona) para proporcionar muestras de sangre del paciente.