Extracto
La investigación reciente ha sugerido que ciertos polifenoles derivados de plantas, es decir, el ácido ursólico (UA), que se informó de que las actividades antitumorales, podría ser utilizado para sensibilizar las células tumorales a la radioterapia por vías inhibidoras que conducen a la resistencia a la terapia de radiación. Este experimento fue diseñado para investigar los efectos y los posibles mecanismos de la radiosensibilización por la AU en la línea celular BGC-823 de cáncer gástrico adenocarcinoma humano
in vitro
. UA causó la citotoxicidad de una manera dependiente de la dosis, y se utilizó una concentración sub-citotoxicidad de la UA para probar la eficacia radioenhancement con AI en el cáncer gástrico. Radiosensibilidad se determinó mediante ensayo de supervivencia clonogénico. La fracción superviviente del grupo combinado con irradiación y sub-UA citotoxicidad significativamente disminuido en comparación con el grupo de irradiación. La eficacia mejorada radiosensibilización se asoció con una mejora de G2 /M detención, el aumento de las especies reactivas de oxígeno (ROS), las reguladas nivel de Ki-67 y la mejora de la apoptosis. En conclusión, como UA demostró efecto antiproliferación potente y efecto sinérgico, que podría ser utilizado como un sensibilizador de fármaco potencial para la aplicación de radioterapia
Visto:. Yang Y, Jiang H, Hu J, Lv X, Yu L , Qian X, et al. (2015) potenciación de los efectos de la radiación por el ácido ursólico en la línea celular BGC-823 de adenocarcinoma humano cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (7): e0133169. doi: 10.1371 /journal.pone.0133169
Editor: Jian-Hua Mao, el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley, Universidad de California, Berkeley, Estados Unidos |
Recibido: 26 Enero, 2015; Aceptado: 24 Junio 2015; Publicado: July 15, 2015
Derechos de Autor © 2015 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención Nº 81.172.094), el máximo seis talentos de Proyectos de la provincia de Jiangsu (Grant No. 2011ws005), y Ciencia y Tecnología médica Los proyectos de desarrollo de Nanjing (subvención Nº ZKX10011). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de una disminución de la incidencia, el cáncer gástrico sigue siendo considerada una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo. La cirugía sigue siendo el pilar de cualquier tratamiento curativo; Sin embargo, aproximadamente dos tercios de los pacientes diagnosticados con cáncer gástrico tienen enfermedad localmente avanzada y /o metastásico no resecable. La tasa de supervivencia a los 5 años de los pacientes que fueron diagnosticados con cáncer gástrico locorregional avanzada y han sido sometidos a resección curativa siguen siendo bajos debido al alto riesgo de recurrencia o metástasis a distancia locales, incluso si la resección se cree que es curativa. [1] Una perspectiva aleatorizado Intergroup (INT) -0116 ensayo (556 pacientes) y la experiencia de Corea retrospectiva (990 pacientes) mostraron una reducción en la tasa de recidiva local con radiación postoperatoria regional junto con la quimioterapia y una tasa de supervivencia más alta en el grupo adyuvante. [2] la radioterapia es el principal modalidad de control loco-regional para el cáncer gástrico resecable [3] La National Comprehensive Cancer Network (NCCN) recomiendan la radioterapia como tratamiento estándar para los pacientes con cáncer gástrico con un alto riesgo de recurrencia.; [4] Sin embargo, hay dos límites principales asociados con el tratamiento del cáncer gástrico con radiación: (1) intrínseca o resistencia adquirida a la radioterapia; (2) la toxicidad no específica hacia la mucosa gástrica y los tejidos circundantes normales. [2,5]
, se han realizado
Para hacer frente a estas limitaciones intentos académicos para buscar un radiosensibilizador eficaz de hierbas con menor toxicidad y mayor eficacia. La investigación reciente ha sugerido que muchos polifenoles derivados de plantas, incluyendo la curcumina, flavopiridol, emodina, ácido ursólico y etc, pueden ser usados para sensibilizar a las células tumorales a los agentes quimioterapéuticos y la radioterapia mediante la inhibición de las vías que conducen a la resistencia al tratamiento. [6,7, 8] Estos agentes también se han encontrado para tener un efecto protector de las toxicidades de la terapia asociada. [5] el ácido ursólico (UA), un ácido triterpeno pentacíclico, que se considera uno de los agente quimiopreventivo más prometedora para el cáncer, se ha demostrado que pedirá antitumoral actividades que incluyen la inhibición de la iniciación del tumor y la promoción. [9,10] también induce la diferenciación de las células tumorales mediante la regulación de la expresión de genes específicos de la diferenciación en células de teratocarcinoma F9 de ratón. [11] Además, no ha habido evidencia que demuestra que la AU producido un efecto anti-angiogénico en la membrana de pollo chorioalantoic y una actividad anti-invasivo en las células de fibrosarcoma humano HT1080. [12,13]
Sin embargo, la investigación previa todavía tiene que demostrar si la AU puede mejorar los efectos de la radiación en la neoplasia maligna . El experimento fue diseñado para explorar los efectos y posible mecanismo in vitro de radiosensibilización por la AU en la línea celular BGC-823 de cáncer gástrico adenocarcinoma humano para proporcionar el apoyo teórico para el uso clínico.
Materiales y métodos
cultivo de células
BGC-823 células se obtuvieron de Shanghai Instituto de Biología celular (Shanghai, china) y se almacenan en RPMI 1640 con 10% de suero bovino de ternera a 37 ° C en una atmósfera saturada de agua con un 5% de CO
2.
citotoxicidad celular ensayo
la citotoxicidad se determinó mediante el ensayo de MTT realizó una publicados anteriormente. [14] Para ilustrar, se sembraron las células a las 8 × 10
3 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se dejó durante la noche. adjuntar A continuación, las células se trataron con varias concentraciones de UA (0, 5, 6,25, 10, 12,5, 20, 40, 50 ug /ml) durante 48 h en un mínimo de tres pocillos replicados. Cada pocillo se añadió MTT 20 ul, preparado mediante la mezcla de MTT 5 mg con 1 ml de solución salina normal, y se incubaron durante 4 h más. Medio de cada pocillo se sustituyó con 150ul DMSO. La absorbancia se determinó con un lector de microplacas (BIP-RAD) a 490 nm. Los pocillos de control en blanco se utilizaron para poner a cero la absorbancia. La tasa de inhibición (IR%) se calculó utilizando la absorbancia de fondo corregido mediante la siguiente ecuación:.
El IC
50 se definió como la concentración requerida para una inhibición del 50% del crecimiento celular
agrupación celular e in vitro radiación ionizante
Las células se dividieron al azar en 4 grupos: grupo control (a), grupo UA (B), la radioterapia (RT) grupo (C), y el grupo combinado (D ). Las células BGC-823 se cultivaron en placas de 6 pocillos, y después el Grupo B y D fueron tratados con UA, mientras que el Grupo C y D se irradiaron usando un niño de 6 MeV acelerador de haz de electrones lineal (Elekta, Suecia).
clonigénicas ensayo de supervivencia
radiosensibilidad se determinó mediante ensayo clonogénico de supervivencia. Las células (500-2000 por pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos y se dejó que se unieran durante la noche. Luego, las células se trataron con UA (0, 6,25 y 10 ug /ml) durante 24 h y luego expuestos a dosis crecientes de RT (0, 2, 4, 6 y 8 Gy). Después de 10-14 días de incubación, las colonias consistían en más de 50 células fueron observadas. Las colonias se lavaron cuidadosamente, impregnada con un tinte violeta etanol /cristal, y luego se contaron. La eficiencia en placas (PE) se calculó como (media de los recuentos de colonias /células sembradas), y fracción de supervivencia (SF) se calculó como [significa /(células sembradas × PE) recuentos de colonias], donde PE se definió como (media los recuentos de colonias para des-irradiado controles /células sembradas). D
0 valores se calcularon por un multi-destino de un solo golpe modelo [S = 1 - (1-e
-D /D0)
N], lo que representó la dosis media de una exposición letal. relación de mejora sensibilizador (SER) se calculó como D
0 relación entre el tratamiento de combinación y RT sola.
análisis del ciclo celular
La influencia del ciclo celular se analizó utilizando tampón de yoduro de propidio /RNasa (BD Pharmingen, San Jose, CA, EE.UU.) y la tinción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 2,5 × 10
5 células se sembraron en placas de 6 pocillos y se dejó que se unieran durante la noche. Luego, las células se trataron con UA (0 y 10 ug /ml) durante 24 h y luego expuestos a RT (0 y 2Gy) durante 48 h. Las células se recogieron por tripsinización, se fijaron en 70% de etanol a -20 ° C, se lavaron en PBS, se resuspendieron en 1 ml de PBS que contiene 1 mg /ml de RNasa y 50 ug /ml de yoduro de propidio, se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a 37 ° C, y se analizaron mediante citometría de flujo (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, EE.UU.).
se evaluó Medición de la apoptosis
Las células cuantificación de las células de la apoptosis usando un V-Anexina-FITC Kit de Detección de apoptosis (BD Pharmingen, San Jose, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. 2,5 × 10
5 células se sembraron en placas de 6 pocillos y se dejó que se unieran durante la noche. Luego, las células se trataron con UA (0 y 10 ug /ml) durante 24 h y luego expuestos a RT (0 y 2Gy) durante 48 h. Las células se recogieron por tripsinización y se resuspendieron en 500 ul de tampón de unión, y 5 ul de isotiocianato de Anexina-V-fluoresceína (FITC) y, a continuación, se añadieron 5 ul de yoduro de propidio (PI). Los análisis se realizaron con una citometría de flujo.
detección de especies reactivas de oxígeno (ROS) generación
Las concentraciones de ROS intracelular se detectaron utilizando las sondas fluorescentes de membrana permeable 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetato (DCFH-DA) (Beyotime, Haimen, Jiangsu, china) según las instrucciones del fabricante. 1 × 10
6 células se sembraron en placas de 6 pocillos y se dejó que se unieran durante la noche. Luego, las células se trataron con UA (0 y 10 ug /ml) durante 24 h, y luego expuestos a RT (0 y 2Gy) durante 48 h. Las células se recogieron por tripsinización, se resuspendieron DCFH-DA durante 30 minutos, se lavó por RPMI libre de suero 1640, y luego detectada por citometría de flujo. La intensidad media de fluorescencia (MFI) representa el nivel intracelular de ROS.
La tinción inmunohistoquímica para evaluar la expresión de Ki-67
Ki-67 expresión de la proteína se evaluó mediante la inmunohistoquímica complejo avidina-biotina (ZSGB-BIO , Beijing, china) según las instrucciones del fabricante. 2 × 10
4 células se sembraron en placas de 6 pocillos con una hoja de cubierta para cada pozo, y dejó que se unieran durante la noche. Luego, las células se trataron con UA (0 y 10 ug /ml) durante 24 h, y luego expuestos a RT (0 y 2Gy) durante 24 h. A continuación, los cubreobjetos se fijaron en paraformaldehído al 4%, se incubaron con 0,5% de Triton X-100 durante 20 min, se lavaron en PBS, y se incubaron con 3% de H
2O 2
durante 15 min. Después de aclarar con PBS tres veces, las células que se adjuntan en los cubreobjetos se incubaron con Ki-67 anticuerpos monoclonales para 60 minutos a 37 ° C, y después se lavaron en PBS de nuevo. anticuerpos conjugado con biotina secundarias durante 20 min a 20-37 ° C, se lavaron con PBS cuatro veces, después se tiñeron por DAB kit de tinción, se lavaron con agua, y después de contraste con hematoxilina.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± desviación estándar, y las comparaciones se realizaron mediante ANOVA de una vía significa. P & lt; 0,05 fue aceptado como estadísticamente significativo. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS, v. 17.0.
Resultados
efectos citotóxicos de la UA sobre las células BGC-823
El efecto citotóxico sobre las células de la AU BGC-823 se evaluado basado en el ensayo de MTT. Encontramos que la AU aumentó la citotoxicidad dependiente de la dosis en la línea celular de cáncer gástrico BGC-823 (Figura 1). Los valores de concentración inhibitoria semimáxima (IC
50) para BGC-823 fue 17.5ug /ml. citotoxicidad ligera (& lt; 15%) de la UA para la BGC-823, 10 ug /ml, se utilizó para los experimentos previstas con posterioridad, en el control de la radioenhancement debido a un efecto citotóxico directo
Después de la incubación de 48 horas con la UA en. las concentraciones indicadas, la citotoxicidad se determinó mediante el ensayo de MTT. UA causó la citotoxicidad de una manera dependiente de la dosis, la IC
50 de UA para BGC-823 se 17.5ug /ml, y que define 10 ug /ml como una ligera citotoxicidad (sub-citotoxicidad) (& lt; 15%) concentración .
Los efectos de sensibilización radiológica de UA in vitro
curvas de supervivencia celular medida mediante el ensayo clonogénico de supervivencia se ilustran en la figura 2. en comparación con la RT solamente, SF
2 de RT combinadas con AI disminuyó significativamente en células BGC-823, los valores SER de los grupos combinados eran 1.180 veces y 1.315 veces. Estos resultados indicaron que la AU mejorarse el efecto de radiación de BGC-823 de una manera dependiente de la dosis dentro de un ligero concentraciones de citotoxicidad.
radiosensibilidad se determinó mediante ensayo de supervivencia clonogénico. La fracción superviviente del grupo combinado disminuyó significativamente comparado con el grupo de irradiación (** p & lt; 0,01)..
distribución del ciclo celular y la inducción de la apoptosis
Para investigar si la temperatura ambiente y /o tratamiento UA podría causar cualquier perturbación del ciclo celular, un análisis de las células BGC-823 tratadas con radiación y /o 10 ug 2Gy /ml se realizó UA. En relación con el grupo de control, 10 ug /ml UA solo produjo casi ningún efecto sobre el ciclo celular. Sin embargo, el grupo combinado de la AU y la detención del ciclo celular irradiación inducida en el G
1 fase (51,87% frente a 60,28%, p = 0,13) y el G
2 /M fase (3,14% frente a 13,67%, p & lt ; 0,01) en comparación con el grupo de irradiación 2Gy (Fig 3A y 3C). Estos hallazgos sugieren que el tratamiento de combinación puede haber causado G
1 fase y G
2 arresto /M fase, que era más susceptibles a los efectos dañinos de la radiación. Las conclusiones similares a partir de los datos del ciclo celular se ha demostrado por el estudio anterior. [15]
contenido de ADN de las células fijadas y teñidas con PI se midió por citometría de flujo, y del ciclo celular se analizó. Los porcentajes de células en cada fase del ciclo celular se proporcionan en cada diagrama (Fig 3A). En comparación con el grupo de IR, la adición de UA detención del ciclo celular inducida en el G
1 fase y G
fase 2 /M y una disminución significativa de la fase S, lo que demuestra la resistencia a la terapia de radiación. Fig 3B mostró la proporción de células apoptóticas (anexina V
+, PI
+/-). El grupo de combinación indujo apoptosis de las células más BGC-823 en comparación con los otros tres grupos.
La combinación de UA y la irradiación podría también causar la muerte celular apoptótica más como se muestra en la figura 3B. La proporción de células apoptóticas aumentó considerablemente mediante la aplicación de ambos UA y la irradiación en células BGC-823 en lugar de UA o IR tratamiento solo. (78,2% frente a 9,6% y 12,5%, p & lt; 0,01, Fig 3D)
UA aumentó RT indujo la formación de ROS
es un hecho ampliamente aceptado que la muerte celular después de la exposición a las radiaciones ionizantes está parcialmente mediada por ROS. [16] el análisis de ROS mediante DCF-DA producido la intensidad media de fluorescencia (MFI), que representado nivel ROS intracelular de cada grupo (Fig 4A y 4B). IMF de UA grupo solo, RT solo grupo y grupo UA + RT aumentó en 1,15 veces, 1,53 veces y 2,09 veces en comparación con el grupo control. El nivel de ROS de el grupo de combinación aumentó significativamente en relación con el grupo de sólo RT, revelando que la adición de UA a RT induce más formación de ROS de RT sola.
Las concentraciones de ROS intracelular se detectaron utilizando el fluorescente membrana permeable sondas 20, diacetato de 70-dichlorofluorescin (DCFH-DA) por citometría de flujo. La intensidad media de fluorescencia (MFI) representa el nivel intracelular de ROS. La diferencia entre el grupo de combinación IMF y el grupo de RT fue significativa (P & lt; 0,01) (ns: no significativo; **: P & lt; 0,01) guía empresas
tinción inmunohistoquímica de Ki-67
.
Ki-67 era conocido como un antígeno nuclear, que a menudo se correlaciona con la proliferación celular. Nuestro experimento detecta la tasa positiva de la proteína Ki-67 por tinción inmunohistoquímica, y los resultados se ilustra en la figura 5. Porcentaje de Ki-67 células positivas del grupo combinado disminuyó significativamente en comparación con el grupo de control, así como el grupo de terapia de radiación .
la figura 5A mostró las imágenes de los resultados de Ki-67 tinción inmunohistoquímica de la línea celular BGC-823 (magnificación: 10 x 40). Porcentaje de Ki-67 células positivas del grupo combinado disminuyó significativamente en comparación con el grupo de control, así como el grupo de terapia de radiación. Fig 5B mostró que la diferencia entre el grupo control y el grupo UA no fue significativa; Sin embargo, hubo una disminución significativa entre el grupo de combinación y el grupo RT (** p & lt; 0,01).
Discusión
Esta investigación examinó los efectos y los posibles mecanismos de la UA como radiosensibilizador. El ensayo de MTT y el ensayo de supervivencia clonogénico demostraron que el IR se combina con la AU fue superior en la citotoxicidad de IR solo. Este efecto se observó en ambos grupos con diferentes concentraciones sub-citotoxicidad de UA, 6.25ug /ml y 10 ug /ml. A esta dosis, UA tenía una ligera citotoxicidad de adenocarcinoma gástrico línea celular de cáncer humano BGC823 y no tienen una citotoxicidad significativa a la línea celular gástrica normal. [17] Esto demuestra que la AU fue una radiosensibilización prometedora
in vitro
.
Centro para la radioterapia del cáncer es la maximización de la eficacia terapéutica de tejido tumoral y reducir al mínimo el daño a los tejidos normales. Si bien la planificación elaborada y técnicas físicas recientes pueden aumentar con seguridad la dosis de radiación al tejido tumoral, mientras que la reducción de la dosis a los tejidos circundantes normales, [18] las técnicas de radioterapia actuales todavía no puede evitar lesiones en los tejidos normales cercanos. Además beneficio radioterapéutico se puede encontrar mediante el examen de la respuesta biológica de la microambiente tumoral para descubrir cómo aumentar la sensibilidad de un tumor a la radiación o inhibir los efectos secundarios por la radiación. [19]
Los tejidos normales alrededor de cáncer gástrico, tales como intestinal y gástrica, son sensibles a la radiación ionizante. Como resultado, la dosis de radiación ionizante hacia el tejido tumoral debe ser restringido. Por otra parte, los efectos secundarios de la radiación ionizante solapadas mejorará los efectos secundarios de radioterapia, e incluso interrumpir el tratamiento. concentración sub-citotoxicidad de la UA en combinación con la radiación ionizante, sin embargo, puede aumentar la citotoxicidad de la radiación ionizante, mientras que la baja concentración de UA es casi inocuo para los tejidos normales. Esta estrategia puede aumentar el índice terapéutico en el tejido tumoral sin aumentar la dosis de radiación y efecto secundario radioterapéutico.
Para identificar el mecanismo de la radiosensibilización de UA, se realizó un análisis en múltiples pasos. En primer lugar, se analizó la distribución del ciclo celular. concentración Sub-citotoxicidad de UA no dió ningún efecto significativo en el ciclo celular, mientras que comparar con radiación ionizante solos, el tratamiento combinado mejorado G
arresto 2 /M. La radiosensibilidad de las células se correlaciona con el ciclo celular, y la correlación es mayor en el G
fase 2 /M y más bajo en la fase S. Esta puede ser la razón subyacente más importante para la radiosensibilización mejorada observada en este estudio. En segundo lugar, se analizaron los niveles de ROS intracelulares. El nivel de ROS de el grupo de combinación aumentó significativamente en comparación con el grupo control, el grupo que sólo UA, o incluso el grupo de radiación ionizante. La adición de la AU para ionizante más la formación de ROS inducida por la radiación. La radiación ionizante induce la radiólisis del agua, lo que generó ROS, tales como radicales hidroxilo y superóxido. Estas moléculas ROS juegan un papel importante en ionizante lesiones celulares inducidos por la radiación, como el daño oxidativo del ADN, que puede conducir a la muerte tanto clonogénico y la apoptosis. En tercer lugar, en este estudio, se encontró que el porcentaje de Ki-67 células positivas del grupo de combinación disminuido en comparación significativa con el grupo de control o el grupo de terapia de radiación. Ki-67 se conoce como un antígeno asociado del ciclo celular y un marcador de proliferación útil. Ki-67 nivel de proteína se correlaciona con una mayor capacidad de proliferación y metástasis. [20,21]
En conclusión, el presente estudio es el primer intento de demostrar que la AU podría sinergia con la radiación ionizante frente a líneas celulares de cáncer gástrico humano . El mecanismo subyacente de la eficacia radiosensibilización mejorado puede ser mejorada la detención G2 /M, el aumento de ROS y regulada de Nivel de Ki-67. En conjunto, como UA demostró efecto antiproliferación potente y efecto sinérgico, que podría ser utilizado como un sensibilizador de fármaco potencial para la aplicación de radioterapia. Sin embargo, es sin lugar a dudas de que se necesita más investigación para evaluar la viabilidad y beneficios del uso de la medicina tradicional china como radiosensibilizadores antes de las aplicaciones clínicas reales. Se necesitan más experimentos y repeticiones en otros tipos de tumores y en ensayos con animales con el fin de confirmar la eficacia de la estrategia propuesta.