Extracto
El cáncer de próstata es un líder de la causa de muerte relacionada con el cáncer en los hombres. A pesar de una fuerte inversión para mejorar el diagnóstico precoz, que a menudo escapa a la detección oportuna. La mortalidad sigue siendo alta en el cáncer de próstata en estadio avanzado, donde los cuidados paliativos sigue siendo la única opción. Por lo tanto, se necesitan estrategias eficaces para prevenir la aparición y la progresión de la enfermedad. compuestos derivados de plantas han sido una importante fuente de varios agentes anticancerosos clínicamente útiles y ofrecer un enfoque atractivo contra el cáncer de próstata. Anteriormente mostró que el extracto de metanol de Maytenus royleanus (MEM) hojas y sus fracciones poseen actividad antioxidante significativa con potencial terapéutico contra los daños asociados de radicales libres. El presente estudio evaluó la actividad anti-proliferativa de MEM en el sistema de modelo de cáncer de próstata. Análisis de MEM y sus diversas fracciones reveló la presencia de triterpenoides, flavonoides y taninos, conjugado con uno o más grupos polares y restos de carbohidratos. Estudios adicionales contra estándares conocidos establecieron la existencia de ácido cafeico y quercetina-3 ramnósido en concentraciones variables en diferentes fracciones del MEM. tiempo de análisis de MEM tratado las células de cáncer de próstata indican disminución significativa de la viabilidad celular, evaluada por MTT y ensayos de supervivencia clonogénico. Esto fue acompañado por la detención de la fase G2 del ciclo celular, regulación a la baja de la ciclina /cdk red y el aumento de inhibidores de CDK. células tratadas exhibieron MEM de escisión de la caspasa-3 y PARP, y la modulación de las proteínas apoptóticas, el establecimiento de la apoptosis como el principal mecanismo de la muerte celular. Notablemente MEM suprimida de señalización tanto en cultivos de células de cáncer de próstata y en el modelo in vivo AR /PSA. La inyección intraperitoneal de MEM (1,25 y 2,5 mg /animal) a ratones desnudos atímicos implantados con células sensibles CWR22Rν1 de andrógenos mostró una inhibición significativa en el crecimiento tumoral y la disminución de los niveles de PSA en suero de movimiento alternativo hallazgos in vitro. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que el MEM se puede estudiarse más a fondo por sus potenciales efectos terapéuticos contra la progresión del cáncer de próstata en humanos
Visto:. Shabbir M, Syed DN, Lall RK, Khan MR, Mukhtar H (2015) Potente anti-proliferativa, pro-apoptóticos actividad de la Maytenus Royleanus Extraer contra las células del cáncer de próstata: la evidencia en
In-Vitro
y
in vivo
modelos. PLoS ONE 10 (3): e0119859. doi: 10.1371 /journal.pone.0119859
Editor Académico: Ying-Jan Wang, de la Universidad Nacional Cheng Kung, Taiwán
Recibido: 12 de septiembre de 2014; Aceptado 17 de enero de 2015; Publicado: 23 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Shabbir et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. se prestó apoyo por el Instituto Nacional de salud /Instituto Nacional del cáncer RO1CA160867. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de los avances en el diagnóstico y el tratamiento, el cáncer de próstata sigue siendo uno de los problemas de salud más comunes que afectan a los hombres durante su vida. De hecho el cáncer de próstata es la segunda causa principal de muerte entre los hombres en los Estados Unidos y en muchos países occidentales [1]. Reciente proyecto de datos que de próstata, de pulmón y cáncer de colon se representan aproximadamente la mitad de todos los nuevos diagnósticos de cáncer en los hombres en 2014, con el cáncer de próstata por sí sola representa aproximadamente 1 de cada 4 casos [2].
El receptor de andrógenos (AR), que pertenece a la superfamilia de receptores nucleares desempeña un papel fundamental en el desarrollo, función y la homeostasis de la próstata [3]. La presencia de un ligando, tal como la dihidrotestosterona (DHT) induce la fosforilación y el cambio conformacional en AR, lo que resulta en su translocación nuclear, donde se une a elementos de respuesta a andrógenos en los genes diana y regula la transcripción. La sobreexpresión de la AR y la regulación positiva de su actividad transcripcional se observan a menudo en el cáncer de próstata avanzado [4, 5]. La terapia de privación de andrógenos sigue siendo el tratamiento estándar para el tratamiento de la enfermedad avanzada. A pesar de una respuesta inicial favorable, casi todos los pacientes progresan invariablemente a un fenotipo más agresivo, resistente a la castración. Los estudios sobre las muestras de pacientes muestran que la AR se expresa en casi todos los cánceres de la próstata, tanto antes como después de la terapia de ablación de andrógenos [6]. De hecho, el antígeno específico de la próstata (PSA), que está codificada por un gen sensible a los andrógenos, se ha detectado en la mayoría de los cánceres hormono-refractario, lo que indica que la vía de señalización AR es todavía funcional en estos tipos de cáncer [7].
la detección de PSA, en combinación con el tacto rectal y biopsia con aguja, han mejorado la supervivencia de los pacientes, facilitando la detección de la enfermedad temprana y localizada. Sin embargo, cura para la enfermedad avanzada y metastásica es todavía difícil de alcanzar [8]. enfoques de tratamientos médicos actuales incluyen la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, ya sea como monoterapia o en el enfoque multimodal [8]. El papel de la dieta en el cáncer humano ha ganado considerable atención en las últimas décadas y se ha traducido en un cambio de paradigma en nuestra comprensión de la prevención y el tratamiento del cáncer. Hay nuevas pruebas de que la dieta, la actividad física y el peso corporal a menudo denominados factores de balance de energía son factores importantes en la modificación de la progresión del cáncer, y pueden estar vinculadas a un mayor riesgo de recurrencia del cáncer [9]. En la actualidad, se están realizando estudios para aumentar nuestra comprensión de la relación entre la dieta y el cáncer de próstata. La nutrición óptima puede reducir la incidencia de cáncer de próstata y puede ayudar a reducir el riesgo de su progresión. Incluyendo los alimentos de colores, a base de plantas y mantener un peso saludable Se ha sugerido que las estrategias de nutrición importantes para los sobrevivientes de cáncer de próstata [10]. Un estudio reciente mostró que la baja concentración de licopeno de próstata está relacionado con el desarrollo de cáncer de próstata en pacientes con alto grado de neoplasia intraepitelial prostática [11]. La adherencia a la dieta mediterránea que comprende de abundantes frutos, verduras, legumbres, frutos secos, cereales sin refinar, aceite de oliva y cantidades moderadas de pescado se asoció con una baja mortalidad global después del diagnóstico de cáncer de próstata no metastásico [12]
.
Maytenus royleanus pertenece a la familia Celastraceae, una gran familia que forma parte de aproximadamente 100 géneros y 1.300 especies, de amplia distribución en el mundo. Varias especies de Maytenus se han usado en la medicina tradicional, para el tratamiento de trastornos gastrointestinales, fiebre, artritis etc. [13, 14]. Las actividades biológicas de las especies Maytenus se atribuyen a la presencia de diferentes clases de metabolitos secundarios, tales como glucósidos fenólicos, flavonoides y triterpenos [15]. En nuestros estudios anteriores, se demostró que el extracto de metanol de Maytenus royleanus (MEM) hojas y sus fracciones derivadas poseía una actividad antioxidante significativa con potencial terapéutico contra daños asociados de radicales libres [15]. Aquí, se estudió el efecto de MEM sobre la proliferación de células de cáncer de próstata y demostramos que MEM inhibe el crecimiento y la viabilidad de ambas células sensibles y de cáncer de próstata independiente de andrógenos de andrógenos y ejerce potente efecto inhibidor sobre AR /PSA señalización ambos cultivos de células en in vitro e in xenoinjertos de tumores in vivo.
Materiales y Métodos
Materiales
Los anticuerpos contra CDK2, CDK4, CDK6, ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2, ciclina e, p27, p21, PSA, poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), Bcl-2, Bax, Bak, Bcl-XL y AR se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-ratón y anti-conejo conjugado anticuerpo secundario de rábano picante per-oxidasa se obtuvo de Amersham Pharmacia Ciencias de la Vida. El kit de ensayo de proteínas Bio-Rad DC se adquirió de Bio-Rad, CA. Novex prefabricados de geles de Tris-glicina se obtuvieron de Invitrogen. La anexina-V-FLUOS kit de tinción fue adquirido de Roche.
Preparación del extracto de la planta
Las hojas secas de MEM, fueron primero en polvo seguidos por dos extracciones con metanol al 95%. Filtrado MEM se secó por pulverización y se suspendió en agua destilada 50 ml y se prepararon fracciones en 200 ml de solventes con polaridad creciente, es decir, n-hexano, acetato de etilo y n-butanol. Cada capa se separó con agitación vigorosa y el sobrante solubles se utilizó como fracción acuosa residual.
Tamizaje fitoquímico
[A] El análisis por cromatografía líquida de espectrometría de masas.
MEM se analizó por LC-MS para generar una huella digital de fitoquímicos presentes en la planta. muestra seca de MEM y sus diversas fracciones se disolvieron en 15 mg /ml de metanol. partículas no disueltas se eliminaron y 10μl de la muestra se sometió a cromatografía en HILIC ionización negativa y de fase inversa (RP), tanto en modos de ionización positivo y negativo para apuntar flavonoides y ácidos fenólicos. Para la separación HILIC, las muestras se resolvieron cromatográficamente con Phenomenex Luna HILIC, 3μm, columna 2x150mm en Agilent 1200 HPLC (Agilent, CA) con un auto-muestreador celebrado en 5 ° C, usando un gradiente lineal de formiato de amonio 10 mM (pH = 4,5) en agua y formiato de amonio 1 mM (pH = 4,5) en 99% de acetonitrilo durante 45 minutos. Para la separación de RP positivas, las muestras se resolvieron cromatográficamente con Agilent ZORBAX 300SB-C18, 1.8μm, columna 2.1x50mm en una HPLC Agilent 1200 (Agilent, Palo Alto, CA) con un auto-muestreador celebrado en 5 ° C, usando un gradiente lineal de El ácido fórmico 0,1% en ácido fórmico al agua y 0,1% en acetonitrilo durante 60 min. Para la separación de RP negativo, se utilizó la configuración del instrumento similar para modo positivo como anteriormente, mientras que el cambio de la fase móvil a un gradiente lineal de formiato de amonio 10 mM (pH 6,5) en agua y formiato de amonio 1 mM (pH 6,5) en 99% de acetonitrilo durante 45 minutos. La velocidad de flujo tanto para los modos de separación era 250μl /min.
[B] cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de extracto de la planta.
se extrajo de 250 mg de polvo de la planta con 10 ml de 25% de HCl y 25 ml de cloroformo. El extracto se filtró y se diluyó a 100 ml. 10μl de muestras filtradas se inyectaron en el sistema de HPLC Agilent 1200. La separación se lleva a cabo a través de una columna C18 equipado con un detector UV-VIS Spectra-Focus, inyector y muestreador automático). El ácido trifluoroacético y acetonitrilo se utilizaron como fases móviles con velocidad de flujo de 1 ml /min. El ácido cafeico y quercetina-3 ramnósido fueron utilizados como estándares internos para la detección comparativa dentro de las fracciones del MEM. Las curvas de calibración fueron generados para ambos compuestos estándar en el rango de cantidad de muestra (0,02 a 0,5 g). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
El tratamiento de células
C
4-2 y células de carcinoma de próstata humano CWR22Rν1 se adquirieron de ATCC (American Type Culture Collection). Ambas líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 (Life Technologies, NY) suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina /estreptomicina, con 5% de CO
2, a 37 ° C. MEM disuelto en DMSO se utiliza para el tratamiento de las células. Las células en una confluencia del 70 ~% se trataron con MEM en 10-100μg /ml durante 24 horas en medio de células completa, donde la concentración final de DMSO usada para cada tratamiento fue de menos de 0,1% (v /v).
viabilidad de las células de ensayo
3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazoliumbromide (MTT) ensayo fue empleado para estudiar el efecto de MEM en la viabilidad de C
4-2, PC3, DU145 y CWR22Rν1cell líneas. Se sembraron las células (1 × 10
4 células por pocillo) en 1 ml de medio de cultivo completo que contiene concentraciones 10-200μg /ml de MEM en placas de microtitulación de 24 pocillos. Después de la incubación en un incubador humidificado durante 24 horas a 37 ° C, 200μl de MTT (5 mg /ml: 1XPBS) se añadió a cada pocillo y se incubó durante dos horas, después de lo cual se añadió 200μl de DMSO. Las placas se centrifugaron a continuación (1.800 × g durante 5 min a 4 ° C). La absorbancia a 540 nm se registró en un lector de microplacas. El efecto de MEM en la inhibición del crecimiento se calculó como% de viabilidad celular, donde se tomaron las células tratadas con DMSO como control de 100%.
ensayo clonogénico
El efecto del tratamiento sobre la supervivencia clonogénica de las células de cáncer de próstata se determinó usando el ensayo de formación de colonias. Tanto CWR22Rν1 y C células
4-2 se trataron con concentraciones crecientes (20, 40 & amp; 60μg /ml) de MEM en RPMI-1640 medio completo. Después del tratamiento, las células se re-sembraron por triplicado en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos con 5000 células /pocillo y se cultivaron en 5% de CO2 a 37 ° C durante 8 días con medio de crecimiento de ser reemplazado con /sin MEM cada 2 días. Las células fueron teñidas con 0,5% de cristal violeta (en metanol: H
2O; 1: 1) y las imágenes fueron tomadas con una cámara digital. Las imágenes fueron mejoradas utilizando Adobe Photoshop para el brillo, el contraste y afiladas para la uniformidad de la apariencia.
análisis del ciclo celular /apoptosis por citometría de flujo
4-2 células
CWR22Rν1 y C
tratada con MEM (20-60μM: 24h) en medio completo se tripsinizaron y se fija en 1% de paraformaldehído: 1XPBS durante una hora y se lavaron dos veces con PBS frío y se centrifugó. El sedimento se suspendió en etanol frío al 70% y se almacena durante la noche. A continuación, las células se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm, y el sedimento obtenido se lavó dos veces con PBS frío para eliminar el etanol. Las células se marcaron con FITC y yoduro de propidio usando el kit de Apo-Direct (BD Pharmagen, CA) según el protocolo del fabricante. El análisis se realizó con un FACScan (Becton Dickinson, NJ). Se recogieron alrededor de 10.000 células por muestra y los histogramas de ADN se analizaron con el software ModFitLT (En verdad Software House, ME).
La extracción de proteínas y Western blot
Después del tratamiento con MEM lisis enfriado con hielo tampón se añadió a las células (50 nmol /litro de Tris-HCl, 150 mmol /litro de NaCl, 1 mmol /litro EGTA, EDTA 1 mmol /litro, 20 mmol /litro NaF, 100 mmol /litro Na3VO4, 0,5% Nonidet P-40, 1% Triton X-100, 1 mmol PMSF /litro, pH 7,4) con inhibidores de proteasa (Calbiochem, Alemania) se incubaron sobre hielo durante 20 min. Para 8-12% de geles de poli acrilamida de transferencia Western se utilizaron para resolver 40μg de proteína, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, se sondearon con anticuerpos primarios monoclonales apropiados, y se detectó por autorradiografía quimioluminiscencia después de la incubación con anticuerpos secundarios específicos.
la expresión de genes
ARN total fue aislado de las células usando un kit RNeasy comercial (Qiagen, CA) concentración de ARN se midió espectrofotométricamente a 260 nm y cDNA se hizo, siguiendo el protocolo del fabricante. La mezcla de reacción fue preparada con 10μL de Comienzo Acelerado universal SYBR verde Maestro (Roche, Alemania), cebadores inversos 6 micras, y cDNA 10μg, con ARNasa libre de agua hasta un volumen total de 20μL. El análisis de amplificación y en tiempo real se llevó a cabo durante 40 ciclos con los siguientes factores; 95 ° C (10 minutos) con el fin de activar de Fast Start Taq ADN polimerasa; 60 ° C (1 minuto) para la amplificación y análisis en tiempo real. Los niveles de expresión génica se determinaron utilizando 2
-ΔΔCT. secuencia de cebador utilizadas fueron; AR sentido 5'-CTGGACACGACAACAACCAG-3 '; AR antisentido 5'CAGATCAGGGGCGAAGTAGA-3 '; GAPDH Sentido 5 'AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3; GAPDH antisentido 5'-ACAAAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3 '.
inmunofluorescencia microscopía
C
4-2 y las células fueron sembradas en CWR22Rν1 una de dos cámaras portaobjetos de vidrio cultivo de tejidos y se trataron con 40μg /ml de MEM a 70% de confluencia durante 24 h. Después de lavar con PBS, las células se fijaron con paraformaldehído al 2% seguido de permeabilización y el bloqueo con metanol con 2% de suero. La incubación con anticuerpos primarios durante la noche fue seguido por incubación con fluoróforo apropiado marcado con anticuerpos secundarios. Antifade DAPI (Invitrogen, NY) se utilizó como el montaje y la contratinción medio. Para el análisis, se utilizó Bio-Rad Resplandor 2100 MP sistema de arco iris para imágenes biológicas. Para detectar células apoptóticas y necróticas se utilizó el kit de tinción con anexina-V-Fluos (Roche, Suiza) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Zeiss LSM 410 microscopía confocal se usó para fluorescencia medida. Las células teñidas con anexina-V y las células no teñidas en un campo seleccionado se contaron para determinar el grado de apoptosis y necrosis.
PSA ELISA
Para la determinación cuantitativa de los niveles de PSA en el C
4-2 y CWR22Rν1 células PSA humano kit ELISA (Anogen, Ontario, Canadá) se utilizó de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Declaración de ética para los estudios en animales
se llevaron a cabo estudios con ratones desnudos atímicos de acuerdo a las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales y fueron aprobados por el cuidado de animales y el empleo Comisión de la Facultad de Medicina y Salud Pública de la Universidad de Wisconsin-Madison.
in vivo del tumor modelo de xenoinjerto
atímicos (nu /nu) ratones desnudos masculinos obtenidos de NxGen Biosciences (San Diego, CA) fueron alojados en condiciones libres de patógenos (12 horas de luz /12 h oscuridad calendario) y se alimentaron con una dieta ad libitum en autoclave. Se seleccionaron células CWR22Rν1 para determinar los efectos in vivo de MEM ya que estas células forman tumores rápidos y reproducibles en ratones desnudos. La implantación de células CWR22Rν1 también es responsable de la secreción de cantidades significativas de PSA en la corriente sanguínea del huésped. xenoinjertos de tumores en ratones fueron establecidos por inyección subcutánea de células CWR22Rν1 (1 × 10
6) mezclado con Matrigel (Collaborative Biomedical Products, MA) en una relación de 1: 1. Dieciocho animales se seleccionaron al azar en tres grupos que consisten en seis animales cada uno. El primer grupo de animales que sirven como grupo de control recibió DMSO por vía intraperitoneal (i.p.). Los animales de los grupos 2 y 3 recibieron i.p. inyección de MEM, 1,25 mg y 2,5 mg por animal, respectivamente, dos veces por semana y durante todo el estudio el peso corporal, la dieta y el consumo de agua se registraron. El volumen del tumor se calculó por la fórmula 0,5238 × × L1 L2 × H (L1 = diámetro largo, L2 = diámetro corto, y H = altura del tumor) y tamaños de los tumores se midieron dos veces por semana. Los animales fueron sacrificados mediante el método de inhalación de CO2 siguiendo las directrices ARAC, cuando los volúmenes tumorales alcanzaron a ~ 1.200 mm
3. Las muestras de sangre se recogieron mediante el sangrado mandibular y se separa el suero de la sangre entera se almacenó a -20 ° C. Los niveles de PSA en suero se analizaron mediante el kit ELISA PSA descrito anteriormente. H & amp; E diapositivas de pulmón, riñón, hígado, corazón y cerebro teñidas se prepara para examinar los posibles efectos tóxicos del tratamiento MEM
La inmunohistoquímica
secciones de tejidos tumorales fueron teñidas con hematoxilina y eosina para. visualización morfológica. Por otra parte, los tejidos fijados en formalina al 10% fueron sometidos a análisis inmunohistoquímico. En pocas palabras, después de la desparafinación en tampón de citrato de sodio, las secciones se incubaron durante la noche con anticuerpos contra exfoliados caspasa-3 y la histona 3-fosfato (H3-P) [1:75] (la señalización celular, MA) seguido de incubación con apropiado conjugado con HRP secundaria anticuerpos, diamminobenzidine /DAB (DAKO, CA) y la tinción tinción contador con hematoxilina. Después de montar con Permount, las secciones se cubrieron con cubreobjetos y tinción fue analizada por un patólogo experimentado ciego a los grupos de tratamiento.
Análisis estadístico
Todo el análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism (San Diego , CA) y los valores & lt p;. 0,05 se consideraron significativos
resultados
El análisis fitoquímico de MEM
MEM junto con n-hexano, butanol, acetato de etilo y acuosa residual fracciones se separaron por análisis LC-MS. Esta técnica fue utilizada principalmente para generar una huella digital de la composición fitoquímica de la MEM. El extracto parece ser una mezcla compleja de fitoquímicos desconocidos como se ve en el cromatograma de pico base de la HILIC (-ve) cromatograma (Fig. 1). La carrera HILIC de MEM mostró la presencia de 164 compuestos sobre la base de los picos de base generadas a partir de tiempo de la masa y la retención molar de compuestos (Fig 1A;. De datos adjuntos como S1_Dataset). La extensión de la misma análisis de datos para las otras fracciones en modo HILIC (-ve), la fracción de n-butanol contenía 79 compuestos, mientras que el acetato de etilo y las fracciones de n-hexano mostraron 69 y 40 compuestos respectivamente. RP C18 (-ve) cromatograma de la fracción acuosa residual mostró la presencia de 84 compuestos, mientras que el HILIC (-ve) mostró 83 compuestos. Con base en la evidencia preliminar obtenida a partir de los datos de LC-MS, señaladas anteriormente (fig. 1A), se realizó un análisis adicional para clasificar los compuestos constituyentes del MEM, el uso de detectores de matriz de diodos UV. El ácido cafeico y quercetina-3-ramnósido fueron identificados por comparación de sus espectros UV y MS a las normas internas correspondientes. Los espectros UV de las fracciones de n-hexano, acetato de etilo y n-butanol reveló la presencia de ácido cafeico y quercetina-3-ramnósido en concentraciones variables que indica que MEM tiene un alto contenido de flavonoides con conocida actividad anti-cáncer (Fig 1B;. S1 Fig ).
a. Tabla que muestra el número total de compuestos que se encuentran en MEM y sus diversas fracciones con HILIC y cromatografía RP C18, con base en el tiempo de retención y la masa molar; cromatogramas de iones totales de diversas fracciones: fracción de acetato de etilo (HILIC -ve); fracción n-butanol (HILIC -ve); n-hexano fracción (HILIC -ve); fracción acuosa (HILIC -ve); fracción acuosa (-ve RP C18). segundo. cromatogramas UV de acetato de etilo n-hexano y n-butanol fracciones de MEM, en 280, 320 & amp; 370 nm, con ácido cafeico y quercetina-3 normas internas ramnósido.
MEM inhibe el crecimiento y la viabilidad de las células de cáncer de próstata
Dado que ambos compuestos son conocidos por poseer actividad contra el cáncer , nos preguntamos si el extracto en sí sería más eficaz en la inhibición del crecimiento y la viabilidad de las células del cáncer de próstata. Para investigar el potencial anti-proliferativa de MEM, se realizó 3- (4, 5-dimethythiazol-2-il) -2, 5-difenil bromuro de tetrazolio (MTT) ensayo contra andrógeno-sensibles (C
4-2 y CWR22Rν1) y andrógeno-independiente (PC3 y DU-145) células de cáncer de próstata. Hemos observado que el tratamiento MEM (10-180μg /ml durante 24 h y 48 h) a las células de cáncer de próstata causada inhibición del crecimiento celular de una manera dependiente de la dosis. tiempo de análisis reveló que existía sólo una modesta diferencia entre la disminución de la viabilidad celular de las células a las 24h y 48h, lo que sugiere que las células de cáncer de próstata responden al tratamiento MEM dentro de 24 horas. Como se muestra en (Fig. 2A), el IC
50 valores de CWR22Rν1 MEM-tratadas fueron 47,4 & amp; 42 mg /ml; para C
4-2, 52,8 & amp; 44,4 mg /ml; en el CP3, 61,8 & amp; 36 mg /ml; y para DU145, 90,6 & amp; 88,2 mg /ml para 24 y 48 horas respectivamente. Los datos sugieren que los andrógenos sensibles C células
4-2 y CWR22Rν1 mostraron ligeramente mejor sensibilidad al tratamiento MEM que DU145 y PC3cells (Fig. 2A). ensayo clonogénico valida aún más estos hallazgos, donde CWR22Rν1 y C
4-2 células tratadas durante siete días con MEM a 20, 40 & amp; 60 mg /ml mostraron una inhibición significativa dependiente de la dosis de la formación de colonias en relación con los controles no tratados (Fig. 2B). Las diferentes fracciones de MEM separados sobre la base de la polaridad en diferentes disolventes como n-hexano, acetato de etilo, n-butanol y el agua también fueron investigados por su efecto inhibidor del crecimiento sobre las células CWR22Rν1. El n-hexano y fracciones acuosas demostraron ser más potente en la inhibición de la proliferación de células CWR22Rν1 (20 & amp; 36μg /ml) en comparación con el butanol y fracciones de acetato de etilo (39,6 & Amp; 66.8μg /ml). (Fig. 2C)
a. células de cáncer de próstata fueron tratados con MEM para 24 /48h, y la viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT. La Tabla muestra el IC
50 de
CWR
22Rν1, C
4-2, PC-3 y DU145 a las 24 y 48 h. Se muestra la media ± desviación estándar de los experimentos realizados por triplicado. segundo. efecto dependiente de la dosis de MEM en clonogenecity de
CWR
22Rν1 y C
4-2 células tal como se detecta mediante el ensayo de formación de colonias. Los detalles se describen en los métodos de materiales. do. Efecto de varias fracciones (n-hexano, acetato de etilo, n-butanol y acuosa) sobre la viabilidad de células
CWR
22R ν1, determinados mediante el ensayo de MTT. * P & lt; 0,05 y ** p & lt;. 0,01 fue considerado estadísticamente significativo
MEM induce la detención fase G2 de las células de cáncer de próstata
Para evaluar el perfil del ciclo celular de cáncer de próstata tratados con MEM las células de cáncer se realizó un análisis de citometría de flujo y se observaron los efectos de MEM en la distribución del ciclo celular. Un aumento significativo dependiente de la dosis en la población de células en la fase G2 del ciclo celular se observó como resultado de tratamiento en MEM CWR22Rν1 y C
4-2 células. La distribución del ciclo celular de fase G2 para C
4-2 era 25,7%, 44,61%, 59,52% y para CWR22Rν1was 38,6%, 47,72% y 57,72% a 20, 40 y las concentraciones de 60μM de MEM, respectivamente (Fig. 3A; Fig S2). El aumento de la población de células en fase G2 se acompañó de una disminución simultánea en el G0 /G1 y población de células en fase S. A continuación examinó el efecto de MEM en moléculas reguladoras del ciclo celular operativos en la fase G2 del ciclo celular. El análisis por inmunotransferencia mostró que el tratamiento MEM a C
4-2 y CWR22Rν1 produjo una reducción de las expresiones de proteínas de las CDK 2, 4 y amp; 6 y ciclinas B1, D1, D2 & Amp; E en comparación con los controles no tratados (Fig 3A y 3B; S3. FIG). Esto se asoció con la inducción notable de p21 y p27 en las células tratadas MEM (Fig 3D;. S3 Fig).
a.
CWR
22Rν1 y C
4-2 células tratadas con MEM durante 24 h se tiñeron con yoduro de propidio y se analizó por citometría de flujo. Porcentaje de población de células en G2-fase del ciclo celular se muestra en el cuadro de cada histograma. Se muestra la media ± desviación estándar de los experimentos realizados por triplicado. b-D. Efecto del tratamiento MEM en las proteínas reguladoras del ciclo celular: lisados de células enteras de
CWR
células 22Rν1 y C
4-2 con /sin MEM (20-60 mg /ml: 24h) se sometieron a SDS electroforesis en gel de poliacrilamida. La igualdad de carga fue confirmada por reprobing con GAPDH. Las inmunotransferencias se muestran son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares.
MEM induce la apoptosis a través de la activación de la vía intrínseca y extrínseca
Para examinar si la disminución observada en la viabilidad celular está vinculada a inducción de la apoptosis se realizó la tinción con anexina del MEM tratado las células del cáncer de próstata. Se utilizó anexina V etiquetada con FITC, que tiene una afinidad fuerte y específica para la fosfatidilserina, para supervisar su translocación a la membrana plasmática. células tratadas MEM mostraron un aumento significativo de la fluorescencia verde en contraste con los controles no tratados indica que el tratamiento con MEM inducida por apoptosis en células de cáncer de próstata (S4 FIG). a continuación, se realizó un análisis de citometría de flujo para cuantificar el número de células sometidas a la apoptosis como resultado de un tratamiento MEM. Se observó un aumento significativo dependiente de la dosis en la población de células apoptóticas en ambas líneas celulares, a consecuencia del tratamiento MEM (Fig 4A;. S4 Fig). Se empleó siguiente análisis por inmunotransferencia para estudiar la expresión de las proteínas implicadas en la apoptosis celular. La caspasa-3, un miembro de la familia caspasa de proteasas de cisteína-aspartato específico juega un papel central en la ejecución del programa de apoptosis. PARP-1 es uno de varios sustratos celulares conocidas de caspasas y la escisión de PARP-1 por caspasas se considera que es una característica de la apoptosis [16]. MEM células tratadas mostraron una mayor expresión de la caspasa-3 activada; asociada con la escisión de PARP (Fig 4B;. S5 Fig) más la validación de que la apoptosis es el mecanismo principal de la muerte celular inducida por MEM. Para investigar si la apoptosis inducida por MEM está mediada a través de la activación de vías intrínsecos o extrínsecos que junto estudió la expresión de las caspasas -8 y -9 en las células tratadas MEM. Encontramos una inducción de la caspasa-8 escindido en las células tratadas con 20, 40 y 60 mg /ml de MEM (Fig 4C;. S5 Fig). disminución concomitante de la pro-forma de la caspasa-9 y la subasta en CWR22Rν1 y C
4-2 células, tratamiento post MEM sugirió la activación de ambas vías intrínsecas y extrínsecas de la apoptosis. Se evaluó el efecto del extracto sobre la familia Bcl-2 de proteínas, que participan en la apoptosis. células MEM tratados mostraron un aumento en la expresión de pro-apoptótica Bax y Bak y una disminución en la expresión de anti-apoptótica de Bcl-2 y Bcl-X
L proteínas (Fig 4D;. S5 Fig).
a.
CWR
22Rν1 y C células
4-2 tratados con MEM (20-60 mg /ml: 24h) se marcaron con FITC y se analizaron mediante citometría de flujo. Porcentaje de células apoptóticas con la dosis correspondiente de MEM se muestra en cada histograma. Se muestra la media ± desviación estándar de los experimentos realizados por triplicado. b-D. lisados de células enteras de
CWR
22Rν1 y C células
4-2 con /sin MEM (20-60 mg /ml: 24h) el tratamiento se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Efecto del tratamiento MEM en proteínas implicadas en vías de la apoptosis. La igualdad de carga fue confirmada por reprobing con GAPDH. Las inmunotransferencias se muestran son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares.
MEM disminuye AR y la expresión de PSA en células de cáncer de próstata
Los andrógenos juegan un papel importante en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata y PSA, un gen de andrógenos sensible conocida es actualmente el marcador más aceptado para la evaluación de la progresión del cáncer de próstata en seres humanos [17]. El efecto del tratamiento sobre la expresión de MEM AR y PSA fue examinado en CWR22Rν1and C líneas
4-2 celulares que emplean inmunotransferencia y RT-PCR. Una disminución significativa en la expresión de proteínas AR se observó con el tratamiento MEM (Fig 5A y 5B;. S6 Fig). La tinción de inmunofluorescencia de CWR22Rν1 & amp; C
4-2 células mostraron disminución de localización nuclear de AR en MEM células tratadas en comparación con el control (Fig. 5B) .La CWR22Rν1 y C las células cancerosas
4-2 próstata exhiben altos niveles de la proteína de PSA intracelular, como evidenciado por una banda de PSA de 34 kDa (Fig. 5A). El efecto dependiente de la dosis de MEM en CWR22Rν1 y C
4-2 células resultó en una disminución significativa en los niveles de proteína PSA en 20, 40 y las concentraciones de 60 mg /ml (Fig 5A;. S6 Fig). La disminución de la expresión de la proteína fue acompañada de una reducción de los niveles de transcripción AR en las células tratadas con MEM (Figura 5C;. S6 FIG). Se determinó aún más los niveles de PSA secretados en CWR22Rν1 líneas y C
4-2 celulares, empleando la técnica cuantitativa sándwich de ELISA. Una reducción significativa en los niveles de PSA se observó en ambas líneas celulares con MEM (40 mg /ml) de tratamiento (Fig. 5D).
a. lisados de células enteras de
CWR
22Rν1 y C células
4-2 con /sin MEM (20-60 mg /ml: 24h) se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. La igualdad de carga fue confirmada por reprobing con GAPDH. Las inmunotransferencias se muestran son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares. segundo. do. 0,05, ** p & lt; re. mi. segundo. do. re. segundo. segundo.