Extracto
Cáncer de mutagénesis dirigida;-Viro-Terapia (CTGVT) se construye mediante la inserción de un gen antitumoral en un virus oncolítico (OV). En realidad, es una terapia OV-gen, que tiene mucho mejor efecto antitumoral de la terapia génica, ya sea solo o virotherapy solos en nuestros trabajos publicados con anterioridad. Este estudio es una modificación de CTGVT mediante la inserción de un cáncer colorrectal (CRC) gen supresor específica, ST13, en un virus oncolítico específica CRC, el anuncio · CEA · E1A (Δ24), para la construcción de la Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) para aumentar el tropismo dirigido al cáncer colorrectal y fue nombrado brevemente como CTGVT-CRC. Aunque se informó de muchos estudios sobre la CEA promotor y ST13 gen, pero sin construcción se ha realizado para combinar ambos como una nueva estrategia para el tratamiento específico del cáncer colorrectal (CCR). Además de la especificidad CRC, el efecto antitumoral de Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) también era excelente y consiguió una inhibición casi completa (no erradicación) de CRC xenoinjerto desde ST13 era un gen antitumoral efectiva con menos toxicidad, y una patente china (No. 201110319434.4) estaba disponible para este estudio. Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) causó apoptosis de las células a través de MAPK P38 (es decir, P38), que upregulated CHOP y ATF2 expresión. La vía de la apoptosis mitocondrial medicado fue activado por el aumento de la caspasa 9 y caspasa 3 expresión
Visto:. Zhou X, Xie G, Wang S, Wang Y, Zhang K, Zheng S, et al. (2012) potente y específico Efecto antitumoral para el cáncer colorrectal por el CEA y Rb doble Regulado Oncolítico adenovirus que albergan
ST13
génica. PLoS ONE 7 (10): e47566. doi: 10.1371 /journal.pone.0047566
Editor: Zhaozhong Han, la Universidad de Vanderbilt, Estados Unidos de América
Recibido: 22 de mayo de 2012; Aceptado: 18 Septiembre 2012; Publicado: 15 Octubre 2012
Copyright: © Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de la Universidad de Zhejiang Sci-Tech (ZSTU) con la subvención No. 1.016.834-Y, el Programa Nacional de Investigación básica de China (973 programas) (núm 2010CB529901, Nº 2011CB510104), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de de China (81172449), el Consejo Nacional de Ciencia Importante & amp; Tecnología del proyecto específico de la hepatitis y el programa relacionado con hepatoma (2008ZX10002-023), y el Programa de Innovación Nueva (2009-ZX-09102-246). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es una de las principales preocupaciones de salud pública mundial. Un total de 1,529,560 nuevos casos de cáncer y 569,490 muertes por cáncer se produjo en los Estados Unidos solamente en 2010 [1]. El cáncer colorrectal es la segunda causa de muerte en los EE.UU., y es el cuarto cáncer más común en hombres y el tercer cáncer más común en las mujeres en todo el mundo [2]. Por lo tanto, es esencial para los científicos y médicos para desarrollar nuevas estrategias para el tratamiento del cáncer de colon. Una estrategia que fue iniciado por nosotros en el año 1999 hasta el 2011, denominado cáncer de mutagénesis dirigida;-Viro-Terapia (CTGVT), implica la inserción de un gen antitumoral en un virus oncolítico (OV) [3], [4]. En realidad, es una terapia OV-gen. El CTGVT (OV-gen) tiene efecto antitumoral potente, que es el resultado de los genes insertados se replique de varios cientos veces junto con la replicación del virus oncolítico en las células cancerosas [5]. Por lo general, el orden de efecto antitumoral es mejor por CTGVT (OV-gen) que el efecto de OV y Ad-gen. Nos hemos dedicado a estudiar el CTGVT (OV-gen) estrategia por más de 10 años y publicado alrededor de 70 papeles relacionados, que siempre mostraron actividad antitumoral mucho más alta que la de Ad-gen [6], [7], [8]. El CTGVT (OV-gen) es oportuna convertirse en un tema candente desde Amgen pagó 1 mil millones de dólares para comprar el OncoHSV-GM-CSF (OV del virus del herpes simple) de BioVex [9] y la OncoPox-GM-CSF ha sido publicado en naturaleza, 2011 [10].
colorrectal tumorigénesis es un proceso complicado que es impulsado por múltiples genes e implica numerosas etapas. Investigaciones anteriores han demostrado que
ras
mutaciones genéticas; deleciones en los cromosomas 5q, 17q y 18q;
neu, c-myc, España o
c-myb
amplificaciones; y reordenamientos del
trk
oncogén estaban involucrados en los tumores de colon [11]. Sin embargo, estos cambios moleculares no podían explicar totalmente todo el proceso de tumorigénesis colorrectal. En 1993, Zheng
et al
. identificado un gen relacionado con el cáncer colorrectal, que se downregulated en el cáncer colorrectal, la supresión de la tumorigenicidad llamado 13 (ST13) (GenBank nº de acceso HSU17714), que se clonó mediante el cribado de hibridación sustractiva entre el cDNA de tejidos de las mucosas normales y el ARNm de carcinoma colorrectal tejidos [12], [13], [14], [15]. Por lo tanto, ST13 era un candidato gen supresor de tumores implicados en el carcinoma colorrectal [16], [17]. Aumento de la expresión de la proteína ST13 podría suprimir la proliferación e inducir la apoptosis de líneas de células colorrectales. Nuestra investigación anterior se verifica que el uso de ZD55-ST13 (un adenovirus oncolítico eliminación de E1B de 55 kDa) condujo a un efecto inhibidor de 100 veces para el crecimiento de células tumorales en comparación con Ad-ST13
in vitro, España y ZD55-ST13 también ejercida un efecto antitumoral potente en un modelo animal de xenoinjerto SW620 de carcinoma colorrectal [18]. La eficacia antitumoral mejorada de otro oncolítico construcción adenovirus SG500-ST13 sobre SG500 era evidente a partir de los experimentos usando el HCT116 y las líneas celulares SW620
in vitro
así como la aplicación del modelo de xenoinjerto de HCT116
in vivo
[19]. En todas las investigaciones ST13 anteriormente, no hay trabajo usando el promotor CEA específico de tipo celular para dirigir la expresión de E1A (Δ24) para controlar la replicación selectiva de virus para su posterior tratamiento específico CRC.
antígeno carcinoembrionario (CEA) es un marcador tumoral ampliamente utilizado, especialmente en la vigilancia de pacientes con cáncer de colon [20]. Experimentos recientes indican que el CEA puede funcionar como una molécula de adhesión celular que podría desempeñar un papel importante durante la embriogénesis y posiblemente durante el desarrollo de tumores [21]. Schrewe H
et al
., Encontró que un promotor del gen de CEA constructo demostró actividad contra el cáncer que era nueve veces mayor contra la línea celular de adenocarcinoma de CEA-SW403 de la producción de la línea celular HeLa no CEA productoras [20]. El promotor CEA acoplado al herpes simple timidina quinasa del virus (HSV-tk), que parecía regular al alza selectivamente la expresión de HSK-tk en la línea celular de carcinoma de páncreas que expresan CEA BxPC3, que dio lugar a efectos antitumorales [22]. AdCEAp /Rep, en el que la expresión de E1A fue impulsado por el promotor CEA, efectivamente inhibidos múltiples metástasis hepáticas de la CEA positivos de cáncer de colon M7609 en un modelo de xenoinjerto [23].
En este estudio, se insertó el gen ST13 en un anuncio vector viral oncolítico · CEA · E1A (Δ24) que aplica promotor CEA para controlar la expresión E1A con una deleción de 24 pb en la región de E1A responsables de proteína (Rb) y su replicación y este constructo retinoblastoma de unión se denomina Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) (el ST13 en el paréntesis representa un casete de expresión). Esta es una modificación de CTGVT con el CRC cáncer específico de mutagénesis dirigida;-Viro-Terapia (brevemente CTGVT-CRC), que constituye una estrategia novedosa que no se ha informado anteriormente. Nuestros datos indicaron que el antitumoral de Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) fue mayor que la de Ad · (EGFP) CEA · E1A (Δ24), más alta que la de ONYX-015
in vitro
y
in vivo
. Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) de tratamiento inhibió significativamente pero no erradicada completamente el crecimiento de carcinomas colorrectales xenoinjerto SW620 en ratones desnudos, y el tiempo de supervivencia se mejoró drásticamente sin una muerte ratones desnudos en el anuncio · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) grupo tratado. Estos resultados proporcionan una nueva visión para la terapia específica del cáncer colorrectal clínica y una patente se ha aplicado [201,110,319,434.4].
Materiales y Métodos
Los plásmidos, virus y reactivos
La pMD18-T vector se adquirió de Takara, Ltd., y el plásmido pBHGE3 se adquirió de Microbix Biosystems Inc. (Toronto). La almohadilla · E1A (Δ24), pMD18 T-Simple-HCMV-MCS-Pole (SV40) y pXC2-CEA plásmidos se construyeron previamente por nuestro grupo. El pCA13-ST13, ONYX-015 y los virus Ad-WT se mantuvieron en nuestro laboratorio.
A. construcción esquemática de Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) y Ad · (EGFP) · · CEA E1A (Δ24). El nativo de
E1A
promotor fue sustituido por el promotor CEA para controlar la expresión de la
E1A
gen con una deleción de 24 pb. Se insertó un ST13 o EGFP casete de expresión bajo el control del promotor hCMV entre la secuencia señal de embalaje ψ y el gen E1A. B. Identificación del promotor del gen CEA y ST13 en el Bloc · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) por PCR. Carril M: Marcador DL2000; Carril 1: promotor CEA; Carril 2: gen ST13. C. Detección de E1A (Δ24) y los niveles de expresión ST13 cuando las células SW620 se infectaron con Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · · CEA E1A (Δ24) o el virus oncolítico típica ONYX- 015 a una MOI de 5 durante 48 horas. Se realizó un análisis de Western blot para detectar E1A (Δ24) y proteínas ST13 niveles.
Los anticuerpos contra la caspasa-3, caspasa-9, Fas, Bcl-XL, CHOP, E1A, p38, p38-fosfo MAP quinasa, ATF-2 y fosfo-ATF-2 fueron adquiridos de Señalización Cell Technology, Inc. Los anticuerpos de PARP-1/2 y beta-actina se obtuvieron de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti-ST13 y los anticuerpos anti-hexon se adquirieron de Epitomic, y la IRDye® 680 de burro anti-IgG de ratón y IRDye® 680 burro IgG anti-conejo fueron adquiridos de LI-COR.
la viabilidad de las células tumorales infectadas con diferente MOI de los diferentes adenovirus oncolíticos. Tres líneas de células de tumor de CRC (SW620, HCT116 y HT29), y tres líneas de CEA-negativos células (Bcap37 de cáncer de mama, carcinoma de CNE Nasopharynageal y de carcinoma cervical HeLa) y dos células normales (QSG7701 y WI38) fueron infectadas con cualquiera de Ad · (ST13 ) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24), o el típico virus oncolítico ONYX-015 en un intervalo de MOI (0,1, 1, 5 o 10 MOI), 4 días, célula viabilidad se determinó utilizando un ensayo MTT. se consideraron células no infectadas para ser 100% viable. Las barras representan la media ± SD (n = 6). B. La influencia de la infección viral sobre la viabilidad celular en diferentes momentos. Tres líneas de CEA de células positivas (SW620, HCT116 y HT29) y tres líneas de CEA-negativos células (Bcap37, CNE y HeLa) y dos células normales (QSG7701 y WI38) fueron infectadas con cualquiera de ONYX-015, Anuncio · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24), o Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) a una MOI de 10. Después de 24, 48, 72, y 96 horas, la viabilidad celular se midió usando el ensayo de MTT. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos. C. La viabilidad de las células tumorales infectadas con diferentes MOIs de Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24). línea celular de cáncer de colon CEA-negativo línea celular de cáncer no de colon (Colo-320) y CEA-positivo (A549, MCF-7) se infectaron con Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) en un intervalo de MOI ( 0,1, 1, 5 o 10 MOI), 3 días, la viabilidad celular se determinó usando un ensayo de MTT. Las barras representan la media ± SD (n = 6).
Construcción de diferente promotor adenovirusesThe CEA recombinante a partir de pXC2-CEA se subclonó en el armazón · E1A (Δ24) para formar pAd · · CEA E1A (Δ24 ) que lleva el gen E1A de adenovirus serotipo 5 con una deleción de 24 pb de 923 pb a 946 pb. Todo el casete de expresión ST13 se inserta más en el armazón · · CEA E1A (Δ24) para formar pAd · (ST13) · · CEA E1A (Δ24). El método de construcción para la generación de la EAP · (EGFP) CEA · E1A (Δ24) fue similar a la para el cojín · (ST13) CEA · E1A (Δ24)
. La secuencia de cada una de las construcciones de plásmidos se confirmó mediante digestión con enzimas de restricción, PCR y secuenciación de ADN. El virus oncolítico anuncio · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) y Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) se generaron mediante recombinación homóloga entre la almohadilla · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) o almohadilla · ( ST13) · · CEA E1A (Δ24) con el plásmido de empaquetamiento de adenovirus pBHGE3 (Microbix Biosystem) en células HEK293 utilizando el reactivo de transfección Effectene (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada adenovirus recombinante fue seleccionado después de tres rondas de purificación de placas en células HEK293 y fue identificado por separado mediante PCR. La purificación final de los virus se realizó mediante cloruro de cesio centrifugación en gradiente de densidad.
observaciones morfológicas de las células tumorales y las células normales infectadas con los diferentes adenovirus oncolíticos como se detecta por microscopía. Las células se infectaron a una MOI de 10, y los cambios morfológicos en las células se observaron por microscopía después de 72 horas de la infección. B. Detección de la apoptosis en células SW620 mediante FACS. SW620 células fueron infectadas con cualquiera de ONYX-015, Anuncio · (EGFP) · · CEA E1A (Δ24) o Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) a una MOI de 10. A las 48 horas, se recogieron las células y teñidas con anexina V-FITC (para las primeras etapas de la apoptosis) o PI (para la fase tardía de la apoptosis) y se examinaron por citometría de flujo. C. El porcentaje de células apoptóticas se calculó utilizando el software Cell Quest. Los datos se presentan como los (barras de error) media ± desviación estándar de tres experimentos. (** P & lt; 0,01; *** p & lt; 0,001) guía empresas
Líneas celulares y cultivo celular
HEK293 (línea celular de riñón embrionario humano) células, A549 (adenocarcinoma de pulmón humano. línea), Colo-320 (línea celular de cáncer de colon humano), y MCF-7 (línea celular de cáncer de mama humano) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.). HeLa (línea celular de carcinoma cervical humano), células SW620, HT29 y HCT116 (líneas celulares de cáncer colorrectal humano), WI38 (línea celular fetal de fibroblastos de pulmón humano normal), y QSG-7701 (línea de células de hígado humano normal) fueron adquiridos de la célula Banco en la Colección de Cultivos Tipo de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). células SW620 se cultivaron en Dulbecco modificado de Eagle Medium (DMEM, GIBCO BRL, Grand Island, NY) que fue suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), glutamina 4 mM, penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml). Todas las otras líneas celulares se cultivaron en DMEM suplementado con 10% FBS. Todos los cultivos celulares se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO
2 en un incubador humidificado. Las células en una fase de crecimiento logarítmico fueron utilizados para los experimentos.
células SW620 por Western blot. Las células SW620 se infectaron con cualquiera de ONYX-015, Anuncio · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) o Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) a una MOI de 5, durante 48 h, las proteínas relacionadas con la apoptosis se analizaron por Western blot.
Análisis de Western blot
para profundizar en los mecanismos moleculares responsables de la muerte celular inducida por el adenovirus recombinante, se realizaron análisis de Western blot. células SW620 y HCT116 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 × 10
5 por pocillo y se cultivaron durante la noche, y luego se trataron con o sin el virus durante 48 h. Tanto las células adherentes y flotantes se recogieron en tampón de lisis [62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% de dodecil sulfato de sodio (SDS), glicerol 10 mM, y 1,55% ditiotreitol]. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Scientific, Rockford, EE.UU.). Igual cantidad de proteínas se separaron por 12% SDS-PAGE y luego se transfirieron a nitrocelulosa membranas (NC). Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% y después se incubaron con anticuerpos primarios y los anticuerpos fluorescentes secundarias apropiadas. La inmunodetección se visualizó usando un sistema de imagen de infrarrojos Odyssey (LI-COR Biosciences Inc, América).
viabilidad celular Ensayo
Las células se distribuyeron en placas de 96 pocillos y se trataron con ONYX-015, Ad · (EGFP) · · CEA E1A (Δ24), o Ad (ST13) · · CEA E1A (Δ24) en los puntos de MOIs y tiempo indicados. Se realizó un ensayo de MTT para determinar la viabilidad celular después del tratamiento con los diversos adenovirus. Cuatro horas antes del final de la incubación, 20 l de solución de MTT se añadió (5,0 mg /ml) a cada pocillo. Los cristales resultantes se disolvieron con 150 l de DMSO /pocillo por agitación durante 10 min. La densidad óptica (D.O.) se midió a 570 nm utilizando un lector de microplacas de ADN (modelo GENios; Tecan, Mannedorf, Suiza). El porcentaje de supervivencia celular se calcula utilizando la siguiente fórmula:% de supervivencia celular = (valor de absorbancia de células tratadas /valor de la absorbancia de las células de control sin tratar) x 100%. Se evaluaron seis muestras replicadas para cada concentración.
Los tumores se establecieron mediante la inyección de células SW620 por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos. Cuando los tumores alcanzaron 100-130 mm
3, los ratones fueron divididos aleatoriamente en tres grupos (n = 8) y fueron tratados diariamente con inyecciones intratumorales cuatro veces consecutivas de ONYX-015, Anuncio · (EGFP) · · CEA (E1A Δ24) o Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) a 5 x 10
8 PFU /día y PBS. A. El tamaño del tumor se midió con calibres, y el volumen del tumor se calculó usando la siguiente fórmula: volumen del tumor (mm
3) = 0,5 x longitud x anchura
2. B. La curva de supervivencia para los animales durante el período de observación. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (barras de error). Una prueba de log-rank se ha utilizado para analizar las tasas de supervivencia en los diferentes grupos. La significación estadística: a, p & lt; 0,001, en comparación con PBS; b, p & lt; 0,01, en comparación con ONYX015; c, p & lt; 0,05, en comparación con Ad * (EGFP) * * CEA E1A (Δ24). C. Hexon y expresión ST13
in vivo. Tumor secciones
derivados de PBS o diferentes medicamentos adenovirus tratadas 4 días se analizaron para Hexon y expresión ST13 por inmunohistoquímica. Un aumento de 400x original.
Análisis de citometría de flujo
p>
5 por pocillo y se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO
2 en un incubador humidificado. Tras el cultivo durante la noche, las células se trataron con ONYX-015 o Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) en una MOI de 5. Las células se tripsinizaron y se recogieron 48 h después del tratamiento. Las células fueron teñidas con anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC) y yoduro de propidio (PI) en un tampón de unión, como se describe en el protocolo del kit de detección de apoptosis de anexina V-FITC (BioVision, Palo Alto, CA). Después de la tinción, las células se analizaron para la apoptosis mediante fluorescencia de células activadas por la clasificación. (FACS; Becton Dickinson)
Declaración de Ética y animal Experimento
Hombre Balb /c ratones nude (4-semana- edad) se mantuvieron y se utiliza en una sala de luz y temperatura controladas en una instalación acreditada por la AAALAC, y se le dio agua y de laboratorio Chow
ad libitum. MyBestPlay Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y uso de Animales institucional de Shanghai Instituto de Bioquímica y Biología celular bajo protocolo IBCB-SPF0029. ratones xenoinjertados fueron utilizados como un sistema modelo para estudiar los efectos citotóxicos de células SW620 (Academia de Ciencias de China, Shanghai, China)
in vivo
. células SW620 (5 × 10
6/100 l) se inyectaron subcutáneamente en el costado inferior derecho de ratones hembra desnudos para establecer el modelo de xenoinjerto de tumor. El volumen del tumor (V), que se basa en mediciones de la pinza, se calculó utilizando la fórmula V (mm
3) = longitud (mm) x anchura (mm)
2/2. Después de que los tumores alcanzaron 100 a 130 mm
3 de tamaño, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos control y de tratamiento (n = 8). Los grupos de tratamiento se administraron por vía intratumoral a las dosis diarias consecutivas de 5 × 10
8 unidades formadoras de placas (UFP) /100 l de cualquiera de ONYX-015, Anuncio · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24), Ad ( ST13) · · CEA E1A (Δ24) durante cuatro días. El grupo de control se trató con inyecciones intratumorales consecutivos cuatro veces con el mismo volumen de PBS
secciones tumorales de HCT116 CRC se analizaron para la necrosis por hematoxilina-eosina (H & amp; E). Mediada por TdT tinción, para la apoptosis por dUTP-biotina etiquetado nick-end (TUNEL), y para observaciones morfológicas por análisis de microscopio electrónico de transmisión (TEM). (B1), la apoptosis en las células tumorales. (B2), por claridad, se observó un solo tumor de apoptosis.
inmunohistoquímicos e histopatológicas experimentos
Para la evaluación inmunohistoquímica, dos ratones por grupo fueron seleccionados al azar 4 días después de viral administración. En condiciones asépticas, los tejidos tumorales se recogieron y se cortan en piezas de aproximadamente 1 milímetro cúbico de tamaño. El tejido fresco se sumergió inmediatamente en paraformaldehído al 4%, donde se mantuvo durante 48 h a temperatura ambiente y, a continuación embebido en parafina. Después, las muestras se cortaron en secciones de 4 micras de espesor. La inmunohistoquímica se realizó con una hexon o anti-ST13 anticuerpo anti-adenoviral (Biodesign International, Saco, ME) usando un kit de inmunohistoquímica de acuerdo con el protocolo del fabricante. Además, los cambios patológicos en el tejido tumoral se examinaron después de hematoxilina y eosina (H & amp; E). Tinción y la tinción TUNEL, así como por la transmisión microscopía eléctrico (TEM)
Análisis estadístico
Todo los datos se presentan como la media ± desviación estándar y se procesaron mediante el programa estadístico SPSS 10.1. Cada experimento cuantitativo se llevó a cabo al menos tres veces, y se le asignó significación estadística para valores de p ≤0.05.
Después de anuncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24), la infección, por una parte, el fosforilada se detectaron P38, ATF2 y la regulación positiva de la expresión de CHOP. Por otro lado, se activó verdugo caspasa-3.
Resultados
Construcción y caracterización de anuncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24)
el anuncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) vector se construyó con éxito mediante la sustitución del promotor E1A nativo con el promotor CEA específico del cáncer colorrectal, la supresión de 24 pb en Ad · E1A (923-946 pb) y que alberga el ST13 antitumoral gen, como se muestra en la Fig. 1A. La identificación de ST13 y la expresión de CEA por PCR se muestra en la Fig. 1B. Para determinar el E1A (Δ24) y la expresión ST13 de los varios virus, la línea celular CRC SW620 estaba infectado, ya sea con Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) CEA · E1A (Δ24), o el típico virus oncolítico ONYX-015 en una MOI de 5. Western blot análisis se utiliza para detectar E1A (Δ24) y la proteína ST13. Los resultados mostraron que el anuncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) vector de expresión inducida ST13 específica y la expresión mayor E1A (Δ24) (Fig. 1C) en las células de CRC detectables.
antitumoral CRC-específica efecto del anuncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24)
in vitro
líneas celulares de CRC positivo para CEA (SW620, HCT116 y HT29), y células de cáncer en tres CEA-negativos líneas (cáncer línea celular Bcap37 de mama, la línea de carcinoma de células CNE Nasopharynageal y el carcinoma cervical línea celular HeLa) y dos líneas de células normales (QSG7701 y WI38) se infectaron con cualquiera anuncio · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · ( EGFP) · · CEA E1A (Δ24), o ONYX-015 en la MOI indicada (0,1, 1, 5, o 10). Después de 96 h, la viabilidad celular se analizó utilizando el ensayo MTT.
Como se muestra en la Fig. 2A, el efecto oncolítico de Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) de tratamiento demostró un efecto antitumoral superior que hizo el tratamiento con Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) o ONYX-015 a una MOI de 5 o 10. Además, la inhibición era dependiente de la dosis. El Bcap37, las células CNE y HeLa mostraron un nivel más bajo de la inhibición de las tres líneas celulares de CRC, y no hubo inhibición en las líneas celulares normales o QSG7701 WI38.
Tal como se muestra en la Fig. 2B, un curso de tiempo para el tratamiento con los virus recombinantes también fue probado. Las células fueron infectadas con cualquiera de anuncio · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) o ONYX-015 a una MOI de 10 durante diferentes períodos de tiempo (24, 48, 72 o 96 h), y la viabilidad celular después de la infección se determinó usando el ensayo de MTT. Los resultados indican que la inhibición celular fue dependiente del tiempo. El efecto antitumoral siguiente Ad (ST13) · CEA · E1A tratamiento (Δ24) fue superior a la siguiente anuncio · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) y el tratamiento ONYX-015 en cada una de las líneas celulares examinadas (Fig. 2B) . Después de 96 h, la viabilidad de anuncio · (ST13) · · CEA células E1A (Δ24) infectados se redujo significativamente. Una vez más la citotoxicidad del anuncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) en tres tipos de cáncer colorrectal mostró mayor efecto antitumoral que la de cáncer tres CEA-negativo, mientras que no citotoxicidad en dos células normales.
Estos resultados se indica que Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) ejerce un mayor efecto antitumoral específica en las células de cáncer colorrectal tres CEA-positivas que la de tres cáncer de CEA-negativos.
a fin de confirmar si el efecto antitumoral de Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) fue CEA-específico o específico de colon, se comparó su efecto sobre la CEA negativo línea celular de cáncer de colon línea celular de cáncer no de colon (Colo-320) y positivo para CEA (A549 , MCF-7), como se muestra en la Fig. 3C. Nuestros hallazgos sugieren que Ad (ST13) · · CEA E1A (Δ24) fue más específico en las células cancerosas CEA-positivos.
cambios morfológicos y la apoptosis inducida por el tratamiento de virus y se ensayaron los cambios eytometryMorphological flujo en las células tumorales y normales las células tratadas con diferentes virus a una MOI de 10 después de 72 horas se observaron por microscopía. Como se muestra en la Fig. 3A, se observó un efecto citopático en las células de cáncer colorrectal CEA-positivas infectadas o bien con Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) o ONYX-015 en comparación con el células HeLa CEA-negativos. Los resultados indicaron que no hubo más cambios morfológicos significativos en Ad · (ST13) · · CEA células E1A (Δ24) infectado con cáncer que en Ad · (EGFP) · · CEA E1A (Δ24) infectados o infectados por el ONYX-015 células , tales como el encogimiento celular y la aparición de pequeños fragmentos celulares. Además, no se observaron cambios morfológicos en la línea celular hepática QSG7701 normal. Estos resultados fueron confirmados por los resultados de ensayos de MTT.
Para determinar si la apoptosis estaba involucrado en Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) la muerte celular inducida, la apoptosis se evaluó mediante citometría de flujo ensayo. SW620 células fueron infectadas con cualquiera de ONYX-015 o Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) a una MOI de 5 para 48 h. Las células se sometieron a continuación a tinción de anexina V para identificar las primeras etapas de la apoptosis y la tinción PI para identificar la apoptosis de la última etapa de análisis de citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 3B, los porcentajes de anuncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) células tumorales infectadas en fase inicial y la fase tardía de la apoptosis fueron 7,13% y 22,22%, respectivamente. Las sumas de los porcentajes de células para temprana y la fase tardía de la apoptosis, que se muestran en la Fig. 3C, fueron 29,35% para Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24), 8,85% para ONYX-015 y del 3,9% para las células infectadas. Estos datos revelaron que Ad (ST13) · · CEA E1A tratamiento (Δ24) podría inducir eficazmente la muerte de las células cancerosas mediante la inducción de la apoptosis en concreto.
La apoptosis detectada por la caspasa Enzyms relacionados
La apoptosis es comúnmente acompañada de cambios dramáticos en los niveles de enzimas y proteínas relacionadas con la caspasa. Las investigaciones anteriores habían demostrado que el tratamiento ZD55-ST13 induce apoptosis a través de la vía mitocondrial [18]. Por lo tanto, varias proteínas relacionadas con la apoptosis de las células SW620 se analizaron mediante western blot. Como se muestra en la Fig. 4A, el nivel de la proteína anti-apoptótica de Bcl-XL se redujo, lo que apoyaría el papel de la apoptosis mitocondrial. Además, escinde la caspasa-9, caspasa-3 escinde y la escisión de PARP, fueron todos aumentó notablemente en Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) células infectadas. Estaba claro que Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) la apoptosis inducida tratamiento de manera más eficaz que el tratamiento con cualquiera de anuncio · (EGFP) CEA · E1A (Δ24) o ONYX-015.
El p38 vía de transducción de señal, una vía activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK), juega un papel esencial en la regulación de muchos procesos celulares, incluyendo la inflamación, la diferenciación celular, el crecimiento celular y la muerte. Además, p38 también transduce señales a otros componentes celulares para la ejecución de diversas respuestas celulares. ATF2, un sustrato para la p38, puede formar heterodímeros con los miembros de la familia de junio de factores de transcripción y por lo tanto se puede asociar directamente con el sitio de unión de AP-1 [24]. CHOP, un miembro de la familia C /EBP de factores de transcripción, también se refiere como la detención del crecimiento y daño en el DNA inducible gen 153 (GADD153) y está implicado en la regulación del crecimiento y la diferenciación celular [25]. Como se muestra en la Fig. 4B, la expresión de p38 fosforilada se incrementó significativamente después · · · tratamiento con Ad (ST13) CEA E1A (Δ24). Mientras tanto, p38 activada aumentó el nivel de ATF2 fosforilado y la expresión de CHOP. Estos resultados indican que p38 puede estar implicado en una ruta apoptótica que fue inducida por el adenovirus específico albergar ST13 oncolítico CRC (CTGVT-CRC). Los resultados similares acerca de las proteínas relacionadas con la apoptosis se detectaron en el cáncer colorrectal líneas de células HCT116 humano. (Fig. S1).
antitumoral Eficacia del anuncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) en ratones desnudos
El modelo de xenoinjerto de SW620 para los tumores colorrectales humanos se estableció en ratones desnudos atímicos para evaluar el potencial eficacia antitumoral de Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24)
in vivo.
Como se muestra en la Fig. 5A, los tumores crecieron rápidamente en el grupo tratado con PBS, mientras que se observaron varios grados de supresión del crecimiento del tumor en el ONYX-015-, Ad · (EGFP) · · CEA E1A (Δ24) - y Ad (ST13) · · CEA E1A (Δ24) tratados con grupos. El volumen medio del anuncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) tratados con SW620 tumores fue de aproximadamente 170 mm
3 a 30 días después del tratamiento, lo que representó un aumento de sólo 40-70 mm
3 en comparación con el volumen tumoral inicial de 100-130 mm
3. El volumen final del tumor del grupo tratado con PBS era de aproximadamente 2500 mm
3, que indica que hubo aproximadamente una tasa de inhibición del crecimiento tumoral del 98% en estos animales, lo que sugeriría que una inhibición casi completa se observó en los animales tratados experimentalmente . hasta ahora no se había informado esta inhibición potente y específico de CRC usando la estrategia CTGVT-CRC.
Además, la supervivencia de los animales se controló hasta 54 días después del tratamiento, y todos los ratones sobrevivieron en Ad · (ST13) · CEA · E1A grupo (Δ24). En los otros grupos, las tasas de supervivencia se redujo significativamente en diferente medida, ya que el anuncio · (EGFP) · CEA · E1A grupo (Δ24) fue del 50% de supervivencia, el grupo ONYX-015 fue del 37,5% de supervivencia, y el PBS tratos grupo sólo tenía una tasa de supervivencia 12,5% (Fig. 5B). Estos resultados sugieren que la estrategia CTGVT-CRC usando anuncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) podría mejorar de manera eficiente las tasas de supervivencia de los ratones.
Para estudiar el mecanismo de anuncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) la acción, el estudio inmunohistoquímico para la expresión hexón del adenovirus y el nivel de expresión del gen ST13
in vivo
se llevaron a cabo. Como se muestra en la Fig. 5C, en el anuncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) grupo tratado, el nivel de proteína hexón fue mayor que en los grupos tratados con el virus de tipo salvaje, y de manera similar se ST13 altamente expresado. Como se muestra en la Fig.