Extracto
A pesar de los rápidos avances en la quimioterapia y las estrategias de resección quirúrgica, el cáncer de páncreas sigue siendo la cuarta causa principal de cáncer muertes relacionadas en los Estados Unidos con una tasa de supervivencia a 5 años de menos del 5%. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos agentes terapéuticos para la prevención y el tratamiento de cáncer de páncreas. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto de pristimerina, un compuesto quinonemethide triterpenoides aislado de Celastraceae y Hippocrateaceae, en la inhibición de la proliferación celular y la inducción de apoptosis en tres células de cáncer pancreático, BxPC-3, PANC-1 y AsPC-1, tanto en monoterapia y en combinación con gemcitabina. El tratamiento con pristimerina disminuyó la proliferación de las células de las tres células de cáncer de páncreas de una manera dosis-y dependiente del tiempo. El tratamiento de células de cáncer de páncreas con pristimerina también resultó en la detención de la fase G1, que fue fuertemente asociada con una marcada disminución en el nivel de ciclinas (D1 y E) y quinasas dependientes de ciclina (cdk2, cdk4 y CDK6) con la inducción concomitante de WAF1 /p21 y KIP1 /p27. tratamiento pristimerina también dio lugar a la muerte celular por apoptosis, la escisión de la caspasa-3, la modulación de la expresión de Bcl-2 de proteínas, la inhibición de la translocación y la actividad de unión al ADN de NF-kB. Además, pristimerina potenció la inhibición del crecimiento y la apoptosis efectos de gemcitabina inducir en las tres células de cáncer pancreático, al menos en parte, mediante la inhibición constitutiva así como la activación gemcitabina inducida de NF-kappa B, tanto en su actividad de unión al ADN y la actividad transcripcional . Tomados en conjunto, estos datos proporcionan la primera evidencia de que pristimerina tiene un fuerte potencial para el desarrollo como un nuevo agente contra el cáncer de páncreas
Visto:. Wang Y, Zhou Y, Zhou H, G Jia, Liu J, Han B, et al. (2012) pristimerina provoca paro G1, induce la apoptosis, y mejora la quimiosensibilidad a la gemcitabina en células de cáncer de páncreas. PLoS ONE 7 (8): e43826. doi: 10.1371 /journal.pone.0043826
Editor: Sharmila Shankar, Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de abril, 2012; Aceptado: July 30, 2012; Publicado: 28 Agosto 2012
Copyright: © Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Fundación New Century Soporte para elitista del Ministerio de Educación de china (NCET-07-0248), la Fundación Científica de la prominente Juvenil de la provincia de Heilongjiang, china (JC200717), el Proyecto Científico y Tecnológico de la provincia de Heilongjiang , China (GC09C407-2), la investigación de fondo especial para la industria de la salud pública bienestar de (201202007) y la Fundación Nacional de Ciencia Natural de China (81170431, 81101799). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es uno de los cánceres humanos más agresivos y letales, que ha aumentado de manera constante en la incidencia en las últimas décadas, y actualmente es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos. La supervivencia a 1 año colectiva desde el momento del diagnóstico en cualquier etapa es sólo el 26%, mientras que una supervivencia global a largo plazo (OS) cae a & lt; 5% [1]. En 2010, se estimó 43,140 estadounidenses fueron diagnosticados con cáncer de páncreas y 36.800 murieron de la enfermedad [2]. La razón principal de tal mal pronóstico de cáncer de páncreas se debe principalmente a la falta de un diagnóstico precoz, el comportamiento biológico muy agresivo del tumor y la pobre respuesta a la mayoría de terapias incluyendo quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia y [3]. Actualmente, gemcitabina (2'-desoxi-2 ', 2'-difluorocitidina) es conocido por ser el pilar fundamental en el tratamiento del cáncer de páncreas avanzado y metastásico. Sin embargo, los resultados del tratamiento con gemcitabina en una tasa de respuesta inferior a 20% y se asocia con múltiples eventos adversos y la quimio-resistencia [4], [5]. Por lo tanto, el desarrollo de estrategias quimiopreventivos y quimioterapéuticos alternativos se necesitan con urgencia para el tratamiento de esta enfermedad mortal.
El factor nuclear-kB (NF-kB), que desempeña un papel regulador crítico en la expresión de genes implicados en la inflamación, la proliferación celular, la invasión, la angiogénesis, la metástasis, la supresión de la apoptosis, se activa de forma constitutiva en una variedad de células cancerosas, incluyendo células de cáncer de páncreas [6], [7], [8]. Además, varias líneas de evidencia sugieren que NF-kB desempeña un papel fundamental en el crecimiento y la quimio-resistencia del cáncer de páncreas. En primer lugar, NF-kB se activa constitutivamente en las células de cáncer de páncreas, pero no en tejidos pancreáticos normales o líneas celulares nontumorigenic [7], [9]. En segundo lugar, NF-kB podría promover el crecimiento del cáncer de páncreas debido a su capacidad para inhibir la apoptosis de las células, inducir productos génicos mitogénica (c-myc y ciclina D1), aumentar la expresión del factor proangiogénico incluyendo el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y la promoción de la migración y la invasión de células de cáncer de páncreas [10], [11], [12], [13], [14]. Finalmente, NF-kB desempeña un papel fundamental en la mediación de la quimiorresistencia en cáncer de páncreas [15]. En conjunto, esto evidencia que implica el papel de NF-kB en el cáncer de páncreas y sugiere agentes que pueden bloquear la activación de NF-kappa B tienen potencial para combatir el crecimiento del cáncer de páncreas.
pristimerina (Fig. 1), un origen natural quinonemethide compuestos triterpenoides aislado de Celastraceae y Hippocrateaceae, ha atraído recientemente un interés considerable debido a su potencial quimiopreventivo o propiedades quimioterapéuticos. Tiene antiinflamatorio, antioxidante, antimalárico, y actividades insecticidas y se ha demostrado que poseen efecto inhibidor del crecimiento en una serie de líneas celulares de cáncer humano como el de mama y cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de cuello uterino y tumores de mieloma múltiple [16], [17], [18], [19], [20]. Sin embargo, aún se desconoce la eficacia potencial de pristimerina contra el cáncer de páncreas.
En el presente estudio, hemos utilizado tres líneas celulares de cáncer de páncreas humano, BxPC-3, PANC-1 y ASPC-1, para evaluar el potencial de pristimerina como quimiopreventivo eficaz y agente quimioterapéutico contra el cáncer de páncreas. Demostramos que pristimerina fuertemente suprime el crecimiento de las tres líneas celulares de cáncer de páncreas mediante la inducción de la detención del ciclo celular en fase G1 y apoptosis, y los sensibiliza a la muerte celular inducida por gemcitabina. Por otra parte, nuestros resultados demuestran que los efectos y mecanismos moleculares de acción de pristimerina en las células de cáncer de páncreas están asociados con la inhibición de la activación de NF-kB.
Resultados
pristimerina induce la inhibición del crecimiento celular en el cáncer Pancratic las células
para determinar el efecto de pristimerina sobre el crecimiento celular, las células humanas de cáncer de páncreas (BxPC-3, PANC-1 y AsPC-1) fueron tratados con las concentraciones variables (0 a 1000 nM) de pristimerina para 24 h, 48 h y 72 h, y la supervivencia celular se evaluó mediante el ensayo de CCK-8. Como se muestra en la Fig. 2, el tratamiento pristimerina resultó en una inhibición de la dosis y dependiente del tiempo de crecimiento de las células en las tres líneas celulares de cáncer pancreático probadas. concentración inhibitoria (IC) 50 valores fueron de aproximadamente 652,71 nM, 283,78 nM y 190.54 nM (contra BxPC-3) y 969,86 nM, 343,62 nM y 261.05 nM (contra PANC-1), y 1261,6 nM, 378,46 nM y 304.57 nM (contra AsPC-1) durante 24 h, 48 h y 72 h de tratamiento, respectivamente. Estos resultados indican que pristimerina tiene efectos antiproliferativos potentes en células de cáncer pancreático.
BxPC-3, PANC-1 y AsPC-1 Las células se cultivaron en ausencia o presencia de una concentración creciente de pristimerina durante 24 h, 48 h y 72 h y a continuación, la viabilidad de las células se midió por CCK-8 ensayo como se describe en Materiales y Métodos. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, comparado con el control. ** P & lt;. 0,01, en comparación con el control
pristimerina induce la fase G1 detención del ciclo celular y alteraciones en las proteínas celulares relacionadas con el ciclo de la fase G1 en células de cáncer pancreático
Basado en se seleccionaron los ensayos preliminares en los que se evaluó el efecto de pristimerina sobre el crecimiento de células de cáncer de páncreas, las dosis de 200, 400, y 600 nm de pristimerina para más estudios sobre el mecanismo in vitro. Para explorar el mecanismo subyacente de la inhibición del crecimiento pristimerina inducida de las células, el efecto de pristimerina en la distribución del ciclo celular se estudió por análisis de citometría de flujo del contenido de ADN celular. Como se muestra en la Fig. 3A, el tratamiento de células de cáncer pancreático con pristimerina durante 48 h dio como resultado una detención significativa dependiente de la dosis de células en la fase G1 del ciclo celular. La distribución del ciclo celular en fase G1 era 48,73, 54,75, 63,29 y 73,62% (en BxPC-3) y 67,23, 75,32, 79,41 y 84,29% (en PANC-1) y 70,79, 72,46, 74,95 y 82,97% (en AsPC- 1) a 0, 200, 400 y 600 nM concentraciones de pristimerina, respectivamente. Este aumento de las contribuciones de células en fase G0-G1 fue acompañada con una reducción concomitante en las contribuciones de células en fase S y la fase G2-M del ciclo celular en las tres líneas celulares probadas. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la inducción de la detención G1 en células de cáncer de páncreas en pristimerina podría ser responsable de la inhibición del crecimiento de células inducida por pristimerina.
(A) Efecto de pristimerina en la distribución del ciclo celular en células de cáncer de páncreas. BxPC-3, las células PANC-1 y AsPC-1 se cultivaron en medio completo y se trataron con pristimerina (200, 400 o 600 nM) o DMSO (control) durante 48 h. Después del tratamiento, las células se recogieron por tripsinización, se lavaron con PBS enfriado en hielo, y se digirieron con ARNasa. El ADN celular se tiñó con yoduro de propidio y análisis de citometría de flujo se realizó para la detección del porcentaje de células en las diferentes fases del ciclo celular como se describe en los Materiales y Métodos. * P & lt; 0,05, comparado con el control. ** P & lt; 0,01, comparado con el control. (B) Efecto de pristimerina en el nivel de la proteína ciclina D1, ciclina E, cdk 2, CDK 4, 6 cdk, WAF1 /p21 y KIP1 /p27 en células de cáncer de páncreas. Como se detalla en Materiales y Métodos, células de cáncer pancreático (BxPC-3, PANC-1 y AsPC-1) se trataron con pristimerina (200, 400 o 600 nM) o DMSO (control) durante 48 h y después se recogieron. Total de lisados de células se prepararon y se sometieron a SDS-PAGE seguido de análisis de transferencia Western de las proteínas reguladoras del ciclo celular G1 (ciclina D1, ciclina E, cdk2, cdk4, cdk6, WAF1 /p21 y KIP1 /p27). β-actina se detectó como control de carga de proteínas. Las inmunotransferencias se muestran aquí son representativos de al menos tres experimentos independientes con resultados similares.
Para comprender el mecanismo subyacente de detención de la fase G1 en las células de cáncer de páncreas tratados con pristimerina, el próximo investigó el efecto de pristimerina en los niveles de proteínas que regulan la progresión de las células en la fase G1, incluyendo WAF1 /p21, KIP1 /p27, ciclina D1, ciclina e, cdk2, cdk4, y CDK6. Como se muestra en la Fig. 3B, el tratamiento de células de cáncer pancreático con pristimerina causó una disminución significativa reducción en los niveles de proteína de las ciclinas D1 y E de una manera dependiente de la concentración en las tres líneas celulares de cáncer pancreático probadas. Del mismo modo, se observó una reducción dependiente de la dosis en la expresión de CDK2, CDK4, y CDK6 (Fig. 3B). Además, la exposición a pristimerina resulta en una inducción dependiente de la dosis de p21 y p27 en las tres líneas celulares de cáncer pancreático analizadas (Fig. 3B). Sugerimos que la modulación del ciclo celular proteínas reguladoras por pristimerina puede contribuir a pristimerina mediada por la detención de la fase G1 en las células de cáncer de páncreas.
pristimerina induce la apoptosis en células de cáncer pancreático
Además de la célula la detención del ciclo, la observación morfológica de células de cáncer pancreático tratados con pristimerina indicó que la inhibición del crecimiento inducida por pristimerina también podría estar asociada con la inducción de la apoptosis. Por lo tanto, se evaluó el efecto de la apoptosis pristimerina inducir en las células de cáncer de páncreas. Las células se trataron con concentraciones variables de pristimerina (0-600 nM), se tiñeron con Anexina V /PI, se sometió a citometría de flujo para determinar la tasa de apoptosis. Como se muestra en la Fig. 4A, el tratamiento de células de cáncer pancreático con pristimerina durante 48 h dio como resultado una mejora significativa dependiente de la dosis tanto en las etapas tempranas y tardías de la apoptosis. Los índices apoptóticos fueron 6,3, 17,5, 38,6 y 74,1% (en BxPC-3) y 8,1, 18,7, 29,3 y 49,8% (en PANC-1) y 11,2, 24,5, 34,7 y 52,9% (en AsPC-1) a 0 , 200, 400 y 600 nM concentraciones de pristimerina, respectivamente. El escaneo láser microscopía confocal confirmó el efecto de apoptosis dependiente de la dosis como se muestra en las fotografías representativas (Fig. 4C). Para explorar más a fondo el efecto de pristimerina sobre la apoptosis celular, también se evaluaron las actividades de la caspasa-3 de las tres líneas celulares. pristimerina tratamiento produjo un aumento dependiente de la dosis en la actividad de la caspasa-3 en las tres líneas celulares sometidas a prueba en comparación con el control después de 72 h de tratamiento (Fig. 4D). Posteriormente, se analizó la expresión de pro-caspasa-3 en las tres líneas celulares analizadas por Western Blot. pristimerina tratamiento también redujo regulado la expresión de pro-caspasa-3 en una forma dependiente de la dosis (Fig. 4E). En conjunto, nuestros resultados sugieren que la inhibición del crecimiento inducida pristimerina se debe en parte a la inducción de un mecanismo de apoptosis.
(A) Efecto de pristimerina en la inducción de apoptosis evaluado por el método de Anexina V /PI usando citometría de flujo. BxPC-3, las células PANC-1 y AsPC-1 se cultivaron en medio completo y se trataron con pristimerina (200, 400 o 600 nM) o DMSO (control) durante 48 h. tasa de apoptosis se determinó por citometría de flujo en la anexina V-FITC. (B) representativos punto-parcelas de citometría de estado que ilustra apoptótica en BxPC-3 (panel superior), PANC-1 (panel central) y AsPC-1 células (panel inferior). (C) Efecto de pristimerina en la inducción de apoptosis evaluada por microscopía de fluorescencia. Las células también se observaron bajo un microscopio de fluorescencia. fotografías representativas fueron tomados de las células de cáncer de páncreas Anexina V /PI-manchado bajo determinado tratamiento. (D) Efecto de la pristimerina en la inducción de apoptosis evaluada por ensayo de actividad de caspasa-3. Los lisados celulares se analizaron para la actividad de caspasa-3 como se describe en "Materiales y métodos". (E) Efecto de pristimerina en la escisión de la caspasa-3. Como se detalla en Materiales y Métodos, células de cáncer pancreático (BxPC-3, PANC-1 y AsPC-1) se trataron con pristimerina (200, 400 o 600 nM) o DMSO (control) durante 48 h y después se recogieron. Total de lisados de células se prepararon y se sometieron a SDS-PAGE seguido de análisis de transferencia de Western. β-actina se detectó como control de carga de proteínas. Las inmunotransferencias se muestran aquí son representativos de al menos tres experimentos independientes con resultados similares. * P & lt; 0,05, comparado con el control. ** P & lt;. 0,01, en comparación con el control
pristimerina Modula los niveles de proteínas Bcl-2 la familia en células de cáncer pancreático
Desde proteínas Bcl-2 la familia juegan un papel importante en la apoptosis al funcionar como promotores (por ejemplo, Bax) o inhibidores (por ejemplo, Bcl-2 o Bcl-xL) de proceso de muerte celular, el próximo estudiaron los cambios en los niveles de de Bax, Bcl-2 y Bcl-xL en células de cáncer pancreático . El análisis de transferencia Western mostró que el tratamiento de células de cáncer pancreático durante 48 h con concentraciones crecientes de pristimerina resultó en una disminución dependiente de la dosis en los niveles de las proteínas anti-apoptóticas Bcl-XL y Bcl-2 (Fig. 5). En marcado contraste, el nivel de proteína pro-apoptótica Bax se aumentó significativamente tras el tratamiento con pristimerina de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5). Así, el tratamiento pristimerina puede modular los niveles de Bcl-2 la familia de proteínas de una manera que favorezca incrementos en las proporciones de Bax /Bcl-2 y Bax /Bcl-xL, que puede contribuir al efecto apoptótico observado de pristimerina.
Como se detalla en Materiales y Métodos, células de cáncer pancreático (BxPC-3, PANC-1 y AsPC-1) fueron tratados con pristimerina (200, 400 o 600 nM) o DMSO (control) durante 48 h y luego cosechado. Total de lisados de células se prepararon y se sometieron a SDS-PAGE seguido de análisis de transferencia de Western. β-actina se detectó como control de carga de proteínas. Las inmunotransferencias se muestran aquí son representativos de al menos tres experimentos independientes con resultados similares.
pristimerina inhibe la translocación y el ADN vinculante actividad de NF-kB en células de cáncer pancreático
NF-kB se ha demostrado para ser activado de forma constitutiva en una variedad de células cancerosas, incluyendo células de cáncer pancreático y asociados con la proliferación y la resistencia a apoptosis. Por lo tanto, se investigó si pristimerina media sus efectos a través de la modulación de la actividad de NF-kB. El empleo de Western blot, se analizó el efecto de pristimerina en la expresión constitutiva de NF-kB /p65 y I? B-α en células de cáncer de páncreas. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento pristimerina resultó en una disminución dependiente de la concentración en NF-kB /p65 niveles de proteína en la fracción nuclear, pero no hubo ningún cambio de que en la proteína total (Fig. 6A). De acuerdo con estos hallazgos, una disminución en el nivel de proteína NF-kappa B se asoció con una disminución dependiente de la concentración en fosfo-I? B-α con un aumento dependiente de la concentración concomitante en los niveles citosólicos de la proteína de I? B-α (Fig. 6A). Para apoyar aún más esta observación, hemos examinado el efecto de pristimerina sobre la actividad de unión al ADN de NF-kB /p65 utilizando una específica NF-kB /p65 ELISA y encontramos el tratamiento pristimerina resultó en una reducción significativa dependiente de la dosis en la actividad de unión al ADN de NF-kB /p65 en las tres células de cáncer de páncreas (Fig. 6B). Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que el tratamiento con pristimerina en una supresión significativa de la activación de NF-kappa B constitutiva en las células de cáncer de páncreas.
(A) Efecto de pristimerina en los niveles de proteína de NF-kB /p65 en lisados nucleares y los lisados celulares totales de células de cáncer pancreático. Como se detalla en Materiales y Métodos, células de cáncer pancreático (BxPC-3, PANC-1 y AsPC-1) se trataron con pristimerina (200, 400 o 600 nM) o DMSO (control) durante 48 h y después se recogieron. lisados nucleares y lisados de células totales se prepararon y se sometieron a SDS-PAGE seguido de análisis de transferencia Western para el nivel de proteína de NF-kB /p65, p-I? B-α (S32 /36) y I? B-α. β-actina se detectó como control de carga de proteínas. Las inmunotransferencias se muestran aquí son representativos de al menos tres experimentos independientes con resultados similares. (B) Efecto de pristimerina de encendido /p65 actividad de unión a ADN de NF-kB en las células de cáncer de páncreas. Como se detalla en Materiales y Métodos, células de cáncer pancreático (BxPC-3, PANC-1 y AsPC-1) se trataron con pristimerina (200, 400 o 600 nM) o DMSO (control) durante 48 h y después se recogieron. lisados nucleares se prepararon y se determinó la actividad de NF-kB de unión a ADN utilizando la Trans-Am NF-B Kit ELISA. * P & lt; 0,05, comparado con el control. ** P & lt;. 0,01, en comparación con el control
pristimerina potencia el efecto citotóxico de gemcitabina mediante la reducción de la viabilidad celular y promoción de la apoptosis
La gemcitabina, el mejor agente quimioterapéutico disponibles para el tratamiento de cáncer de páncreas avanzado, por sí solo no es muy eficaz y se asocia con toxicidad sistémica y quimiorresistencia. Debido a que la activación de NF-kB se ha demostrado que promover la resistencia a la gemcitabina en el cáncer de páncreas, se evaluó si pristimerina puede potenciar el efecto de la gemcitabina en estas líneas celulares.
CCK-8 ensayo mostró que el tratamiento con cualquiera pristimerina ( 200 nM) o gemcitabina (500 nM) por sí sola durante 48 horas resultó en solamente 31,5% o 46,7% de pérdida de viabilidad de BxPC-3, y 27,2% o 25,9% de pérdida de viabilidad de PANC-1, y 26,3% o pérdida de 23,6% de viabilidad de AsPC-1, respectivamente. Sin embargo, la combinación de gemcitabina y pristimerina resultó en la pérdida de 68,1%, 61,7% o 57,8% de células viables en cualquiera de los tipos de células investigado, respectivamente (Fig. 7A). La naturaleza de la interacción entre pristimerina y gemcitabina se cuantificó utilizando el método de la ecuación del efecto mediano Chou /Talalay para derivar un índice de combinación. Un CI & lt; 1 indica un efecto sinérgico, y los valores de rango de CI para la combinación de pristimerina y gemcitabina en las tres líneas celulares de cáncer de páncreas humanos fueron 0,5 a 0,9 para el efecto fraccionario correspondiente a 0,3 a 0,9 (Figura 7A), indicando que la combinación de gemcitabina y pristimerina tiene efectos sinérgicos sobre la inhibición del crecimiento de células en todas las líneas celulares ensayadas.
(a) Potenciación de la inhibición del crecimiento celular inducida por gemcitabina pristimerina. Las células se cultivaron en ausencia o presencia de pristimerina (200 nM), gemcitabina (500 nM) o su combinación para 48 h. La viabilidad de las células se midió por CCK-8 ensayo como se describe en Materiales y Métodos. índice de combinación (IC) frente a las parcelas fracción afectada (Fa) obtenidos a partir del análisis del efecto mediana de Chou-Talalay. valores de CI: & gt; 1, el antagonismo; 1, aditividad; & Lt; 1, el sinergismo. (B) La potenciación de la apoptosis inducida por gemcitabina pristimerina. Las células se cultivaron en ausencia o presencia de pristimerina (200 nM), gemcitabina (500 nM) o su combinación para 48 h. tasa de apoptosis se determinó por citometría de flujo en la anexina V-FITC. * P & lt; 0,05, comparado con el control. ** P & lt; 0,01, comparado con el control.
#P & lt;. 0,05, en comparación con el grupo de gemcitabina sola
## P. & Lt; 0,01, comparado con el grupo de gemcitabina sola
ensayo de anexina V mostró que la gemcitabina sola (500 nM) aumentó la tasa de apoptosis de 6,3% a 26,9% en BxPC-3 células y del 8,1% al 17,9% en las células PANC-1 y del 11,2% al 20,8% en las células ASPC-1, mientras que solo pristimerina (200 nM) aumentó la tasa de la apoptosis de desde el 6,3% hasta el 17,5% en BxPC-3 células y del 8,1% al 18,7% en las células PANC-1 y del 11,2% al 24,5% en las células AsPC-1. Además, la gemcitabina en combinación con pristimerina condujo a un aumento de la apoptosis en comparación con el tratamiento con un solo agente en las células respectivas (46,8%, 40,5% y 46,7%, respectivamente) (Fig. 7B). Estos resultados en conjunto indican que pristimerina aumenta el efecto citotóxico de la gemcitabina en las células de cáncer de páncreas.
A continuación, se evaluó el efecto de pristimerina y gemcitabina en la actividad de NF-kB para determinar si este efecto beneficioso del pristimerina y gemcitabina se asocia con la inhibición de la activación de NF-kB. Nuestros datos muestran que BxPC-3, PANC-1 y AsPC-1 células expresan constitutivamente la actividad de NF-kB de unión al ADN y activa la gemcitabina sola más indujo la actividad de NF-kB de unión al ADN en comparación con el control (Fig. 8A y B). Curiosamente, en las tres células, pristimerina fue capaz de reducir la actividad de NF-kB de unión a ADN no importa con, o sin gemcitabina (Fig. 8A y B). Estos resultados indican que pristimerina no sólo reduce constitutivamente activa de unión a ADN de NF-kB actividad en condiciones no estimuladas, pero también inhibe la activación de NF-kB gemcitabina inducida, lo que podría ser responsable del efecto potenciador de la pristimerina en gemcitabina contra las células de cáncer de páncreas.
(a) Efecto de pristimerina y gemcitabina en los niveles de proteína de NF-kB /p65 en lisados nucleares y los lisados celulares totales de células de cáncer pancreático. Como se detalla en Materiales y Métodos, células de cáncer pancreático (BxPC-3, PANC-1 y AsPC-1) se cultivaron en ausencia o presencia de pristimerina (200 nM), gemcitabina (500 nM) o su combinación durante 48 h y luego cosechado. lisados nucleares y lisados de células totales se prepararon y se sometieron a SDS-PAGE seguido de análisis de transferencia Western para el nivel de proteína de NF-kB /p65. β-actina se detectó como control de carga de proteínas. Las inmunotransferencias se muestran aquí son representativos de al menos tres experimentos independientes con resultados similares. (B) Efecto de pristimerina y gemcitabina sobre la actividad de unión al ADN /p65 NF-kB en las células de cáncer de páncreas. Como se detalla en Materiales y Métodos, células de cáncer pancreático (BxPC-3, PANC-1 y AsPC-1) se cultivaron en ausencia o presencia de pristimerina (200 nM), gemcitabina (500 nM) o su combinación durante 48 h y luego cosechado. lisados nucleares se prepararon y se determinó la actividad de NF-kB de unión a ADN utilizando la Trans-Am NF-B Kit ELISA. * P & lt; 0,05, comparado con el control. ** P & lt; 0,01, comparado con el control.
#P & lt; 0,05, comparado con el grupo de gemcitabina sola.
## P. & Lt; 0,01, comparado con el grupo de gemcitabina sola
Discusión
La evaluación de los compuestos naturales de la dieta, pueden indicar nuevos enfoques para el tratamiento de cáncer de páncreas, el cual sigue siendo uno de los cánceres más letales pesar de los tremendos esfuerzos científicos [2]. En nuestro presente trabajo, hemos encontrado que pristimerina ejerce efectos inhibidores del crecimiento significativo sobre las células de cáncer de páncreas (BxPC-3, PANC-1 y AsPC-1) a través de la inducción de la detención en G1 y la muerte celular apoptótica. Además, pristimerina mayor quimiosensibilidad a la gemcitabina en las células de cáncer de páncreas. Nuestros datos indican que el efecto antiproliferativo y quimiosensibilización de pristimerina en las células de cáncer de páncreas puede ser mediada a través de la inhibición de la actividad de NF-kB y la alteración del ciclo-celular y las proteínas relacionadas con la apoptosis.
La modulación del ciclo celular progresión en las células cancerosas es considerado como un objetivo apreciado para el tratamiento de tumores malignos humanos ya que varios estudios han demostrado que la aberración de reguladores del ciclo celular es una característica común del cáncer humano [23], [24], [25]. Nuestros resultados in vitro demostraron que el tratamiento de células de cáncer pancreático con pristimerina resultó en la detención dependiente de la dosis de las células en la fase G1. El paso a través del ciclo celular, en los eucariotas se rige por los complejos que contienen ciclinas, las unidades de regulación, con quinasas dependientes de ciclina (CDKs), las unidades catalíticas [26]. Las ciclinas D y E junto con cdk2, cdk4, cdk6 o juego un papel importante en la progresión de las células a través de la fase G1 del ciclo celular [27]. Se cree que la desregulación de los reguladores del ciclo celular de fase G1 a la promoción de la proliferación aberrante de células cancerosas. La sobreexpresión de ciclinas y cdk puede proporcionar las células cancerosas con una ventaja de crecimiento selectiva [28]. Por lo tanto, los complejos de la orientación de ciclina /cdk se considera que es una estrategia eficaz prometedor para el tratamiento del cáncer. Durante la progresión del ciclo celular, los complejos CDK-ciclina se inhiben a través de la unión a las Cdk inhibidores (CKI), tales como CIP de control y medida INK4 familias /de las proteínas [29]. WAF1 /p21 y KIP1 /p27, las proteínas de la familia Cip /Kip, bloque progresión del ciclo celular mediante la inhibición de la actividad de la ciclina E-Cdk2 complejos que normalmente promueven G1-S progresión de la fase. Los efectos inhibidores observados de pristimerina en ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4 y CDK6, junto con sus efectos sobre la regulación positiva de WAF1 /p21 y KIP1 /p27 en células de cáncer pancreático sugieren su potencial en la interrupción de la progresión del ciclo celular incontrolada. En conjunto, estos datos indican que las detenciones pristimerina células de cáncer pancreático en fase G1 del ciclo celular a través de la modulación de reguladores del ciclo celular que sugiere uno de los mecanismos por los que pristimerina puede actuar para suprimir el crecimiento de células de cáncer e inducir la muerte celular apoptótica.
G1 detención del ciclo celular -Fase crea una oportunidad para que las células se someten a ya sea la reparación o entrar en la ruta apoptótica para mantener la homeostasis del tejido y eliminar el neoplásica mutado y células neoplásicas hiperproliferantes del sistema. En los últimos años, el concepto de ciclo celular de la apoptosis mediada por la regulación ha ganado cada vez más atención, y se ha convertido en una forma ideal de inhibición del crecimiento celular [30], [31]. En este aspecto, pristimerina parece ser un potente agente quimioterapéutico, ya que podría eliminar selectivamente /preferentemente las células de cáncer al causar la detención del ciclo celular y /o inducción de la apoptosis [20]. En el presente estudio, la citometría de flujo de datos mostraron que el tratamiento de células de cáncer pancreático con pristimerina resultó en la inducción de la apoptosis significante, que fue verificado por la escisión de la caspasa-3, microscopía de fluorescencia y la actividad de caspasa-3. En conjunto, estos resultados demuestran claramente que el efecto citotóxico de pristimerina en las células de cáncer de páncreas es mediada a través de la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis.
Miembros de la familia Bcl-2 de proteínas tienen un papel central en el control de la apoptosis camino. Algunas proteínas de esta familia, incluyendo Bcl-2 y Bcl-XL, suprimir la apoptosis, mientras que otros, tales como Bax y Bak promover la apoptosis [32], [33], [34] Las proteínas pro-apoptóticos y anti-apoptóticos proteínas de la familia Bcl-2 podría formar heterodímeros, dando como resultado la neutralización mutua de los efectos pro-y anti-apoptóticos consolidados. Por lo tanto, las alteraciones en los niveles de proteínas anti-apoptóticas y pro-Bcl-2 de la familia son críticos para la inducción de apoptosis. Se encontró que el tratamiento de células de cáncer pancreático con pristimerina resultó en un aumento en la expresión de la proteína Bax y una disminución en la expresión de Bcl-2 y Bcl-xL aumentando de este modo las proporciones de Bax /Bcl-2 y Bax /Bcl-xL en favor de la apoptosis. Por lo tanto, parece lógico postular que la regulación positiva de Bax y modulación negativa de Bcl-2 y Bcl-XL puede ser responsable de la apoptosis efecto observado de pristimerina.
Ciertos compuestos naturales bioactivos con propiedades quimiopreventivos en células de cáncer de páncreas tal como isotiocianato de bencilo, honokiol, la curcumina, la dihidroartemisinina y fisetina han demostrado inhibir la proliferación celular e inducir la apoptosis a través de un NF-kappa B - mecanismo dependiente de [35], [36], [37], [38], [39]. factor kappa B nuclear (NF-kB), que desempeña un papel regulador crítico en la expresión de genes implicados en la inflamación, la proliferación celular, la invasión, la angiogénesis, la metástasis, la supresión de la apoptosis, se activa de forma constitutiva en una variedad de células de cáncer incluyendo el cáncer de páncreas las células [6], [7], [8]. NF-kB es un homo o heterodímero compuesto por miembros de la familia NF-kappa B, incluyendo NF-κB1 (p50), NF-κB2 (p52), de RelA (p65), RelB y c-Rel [40]. La forma más común es un regulador de la de RelA (p65) y NF-κB1 (p50), y es secuestrado en el citoplasma en un estado inactivo mediante la interacción con un inhibidor endógeno de I? B [41]. Después de la estimulación celular, I? B sufre degradación phosphorylation- y ubiquitinación dependiente, permitiendo de este modo activa NF-kB a translocan al núcleo donde se une con los elementos de respuesta específicos en las secuencias de ADN para activar la transcripción de genes incluyendo antiapoptótico (survivina, Bcl-xL, Bcl-2), proliferativa (ciclina D1), proinflamatoria (COX-2), [metaloproteinasa de la matriz 9 (MMP-9)] invasión, y angiogénico [factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)] genes [7], [12], [14], [42], [43].