Extracto
Diferencial homeostasis redox en las células normales y malignas sugiere que indujo pro-oxidante-regulación al alza especies reactivas del oxígeno de celulares (ROS) deben atacar selectivamente las células cancerosas sin comprometer la viabilidad de las células no transformadas. En consecuencia, una desviación pro-oxidante bien tolerado por las células no malignas podría llegar rápidamente a un umbral de la muerte celular en las células malignas ya en un punto de ajuste alto de estrés oxidativo constitutiva. Para probar esta hipótesis, nos aprovechamos de un número seleccionado de complejos basados en amina-piridina Fe (II) que operan como catalizadores de oxidación eficiente y robusto de sustratos orgánicos en la reacción con peróxidos. Cinco de estos Fe (II) y los ligandos -complexes aminopiridina correspondientes fueron seleccionados para evaluar sus propiedades contra el cáncer. Se encontró que los complejos de hierro no pudieron mostrar ninguna actividad relevante, mientras que los correspondientes ligandos exhiben actividad antiproliferativa significativa. Entre los ligandos, ninguna de las cuales eran hemolítica, los compuestos 1, 2 y 5 fueron citotóxico en el rango micromolar bajo contra un panel de molecularmente diversas líneas celulares de cáncer humano. Es importante destacar que el perfil de la actividad citotóxica de algunos compuestos se mantuvo inalterada en epitelio-mesenquimal (EMT) inducida por las poblaciones estables de células madre, como el cáncer, que adquirieron resistencia a la conocida doxorrubicina inductor ROS. Los compuestos 1, 2 y 5 inhibieron la clonogenicidad de las células cancerosas y la muerte celular apoptótica inducida por la caspasa 3/7 acompañados de activación. los análisis de citometría de flujo indicó que los ligandos eran fuertes inductores de estrés oxidativo, que conduce a un aumento de 7 veces en los niveles de ROS intracelulares. inducción ROS se asoció con su capacidad para unirse de hierro intracelular y generar complejos de coordinación activos dentro de las células. Por el contrario, la formación de complejos de hierro extracelular inhibe la actividad de los ligandos. complejos de hierro mostraron un alto grado de perfeccionamiento para escindir el ADN a través de mecanismos oxidativos-dependiente, lo que sugiere un posible mecanismo de citotoxicidad. En resumen, nos informan de que, tras la quelación del hierro intracelular, la actividad pro-oxidante de los complejos de hierro-amina a base de pirimidina mata eficazmente las células madre, como el cáncer y el cáncer, proporcionando así pruebas funcionales para una familia eficiente de redox-dirigida anti metallodrugs cáncer
Visto:. González-bártulos M, Aceves-Luquero C, Qualai J, O Cussó, Martínez MA, Fernández de Mattos S, et al. (2015) pro-oxidante Actividad de amina-piridina-a base de hierro Complejos Veces eficientemente cáncer y células madre similares. PLoS ONE 10 (9): e0137800. doi: 10.1371 /journal.pone.0137800
Editor: Sujit Kumar Bhutia, Instituto Nacional de Tecnología Rourkela, India
Recibido: 5 de Mayo, 2015; Aceptado 21 de agosto de 2015; Publicado: 14 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 González-bártulos y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la española Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), CONSOLIDER-INGENIO 2010 CSD2010-00065, y de la Innovación Ministerio de Ciencia e (MICINN) , SAF2012-38914, el plan Nacional de I + D + I
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las células cancerosas se someten metabólica adaptaciones para mantener su crecimiento y proliferación incontrolada. mecanismos moleculares intrínsecos y extrínsecos Diversos contribuyen a esta reprogramación metabólica para suministrar las células cancerosas con suficiente energía y la capacidad de biosíntesis en el ambiente del tumor [1,2]. metabolismo alterado junto con la señalización oncogénica activada y la desregulación de la función mitocondrial típicamente resulta en un aumento en la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células de cáncer [3,4]. Curiosamente, este fenómeno lleva a una homeostasis diferencial redox en las células normales y malignas que está ganando terreno como un objetivo prometedor para el diseño de agentes contra el cáncer más selectivos y eficaces [5-8].
ROS altamente reactivas se producen en las células por la reducción incompleta de oxígeno molecular a agua durante el metabolismo aeróbico. ROS están normalmente regulada por antioxidantes de defensa celulares [9,10] y participar en múltiples funciones celulares incluyendo la transducción de señales, la activación de la enzima, la expresión de genes y proteínas modificaciones post-traduccionales [11]. Cuando generada en exceso o cuando la eficiencia del sistema antioxidante celular es submáxima, ROS acumularse y causar daño celular irreversible a través de la oxidación de biomoléculas tales como membranas de lípidos, enzimas o ADN que generalmente conduce a la muerte celular [12]. ROS también puede promover la iniciación y progresión del cáncer mediante la inducción de mutaciones en el ADN y las rutas de señalización pro-oncogénicos [13,14]
.
El aumento de ROS en células de cáncer upregulates la respuesta antioxidante, lo que resulta en un nuevo equilibrio redox que permite a estas células para mantener mayores niveles de ROS que las células normales. En consecuencia, las células cancerosas exhiben estrés oxidativo persistente, lo que promueve la proliferación celular, pero no es suficiente para causar la muerte celular [4,13]. Esta homeostasis alterada hace que las células de cáncer vulnerables a los agentes oxidantes exógenos que generan ROS adicional, que son propensos a aumentar los niveles de estrés oxidativo por encima del umbral citotóxico. Esta susceptibilidad es mayor por la capacidad limitada de las células cancerosas para reforzar la respuesta antioxidante para neutralizar el insulto oxidativo [15]. En contraste, las células normales pueden tolerar mayores niveles de estrés ROS exógena ya que presentan niveles de ROS constitutivos inferiores junto con una capacidad de respuesta superiores de los sistemas antioxidantes. De hecho, es bien describe que, además de sus efectos directos sobre el ADN y la división celular, el mecanismo de acción de muchos agentes quimioterapéuticos tales como 5-fluorouracilo, bleomicina, cisplatino, doxorrubicina o paclitaxel también implica la apoptosis mediada por ROS [13 , 16-19].
Mientras que los efectos biológicos de los ROS y los mecanismos que regulan los niveles de ROS están bien establecidos en las células cancerosas, se sabe poco sobre el papel de ROS en el cáncer de células madre (CSC) subpoblación, que muestra una alta capacidad de auto-renovación y diferenciación, así como el potencial de generar tumores con una marcada resistencia a la quimioterapia /radio [20,21]. Los CCC contienen niveles más bajos de ROS que no células madre cancerosas, probablemente como consecuencia de sistemas mejorados de barrido de radicales libres [22]. Los bajos niveles de ROS pueden estar relacionados con la situación privilegiada de este subconjunto de células, la preservación de la integridad del ADN y la función de las proteínas, lo cual es crítico para mantener el potencial de auto-renovación y stemness [23,24]. Por lo tanto, la elevación exógena ROS podría ser un enfoque para matar a la subpoblación de CSC, que normalmente se enriquece después de la quimioterapia convencional. De hecho, la niclosamida y el trióxido de arsénico (As
2O
3), que son inductores potentes ROS, se ha demostrado que promover la muerte CSC [25].
Un número de agentes contra el cáncer que se dirigen a los celulares equilibrio redox están en diferentes fases de desarrollo preclínico y clínico [5,6]. Mecánica, estos agentes inhiben cualquiera de los sistemas de defensa antioxidantes de las células [27-29] o generan ROS [30-32]. Además de estos agentes, compuestos basados en metales de transición pueden ser candidatos prometedores para terapias pro-oxidantes. Cuando acumulado en las células, metales tales como hierro, manganeso y cobre, se someten a reacciones redox ciclismo que generan altos niveles de ROS, principalmente las especies de radicales hidroxilo altamente perjudiciales a través de la reacción de Fenton. Esta forma mediada por metal del estrés oxidativo es una causa bien conocida de muerte celular [33], y por lo tanto, un número creciente de las investigaciones están explorando el potencial de metallodrugs en terapias contra el cáncer basadas en redox [34-37].
los complejos de metales de transición con andamios orgánicos que contienen aminopiridina-han surgido como potentes catalizadores para la oxidación de sustratos orgánicos. Estos complejos también se consideran como catalizadores bioinspiradas ya que reproducen las propiedades estructurales y de reactividad de las enzimas oxidativas. Un aspecto clave de su actividad es su fuerte unión a iones hierro y manganeso, generando oxidantes poderosos después de reaccionar con peróxidos [38-43]. Estos compuestos oxidantes funcionan como catalizadores para promover la oxidación de moléculas inertes tales como alcanos, alquenos e incluso la molécula de agua desafiante. El mecanismo de acción consiste en especies férrico-peróxido, que recuerdan a la bleomicina químicamente activado. Además, estos compuestos son altamente resistentes a la auto-oxidación. Con estos antecedentes, que aquí evaluaron los perfiles de actividad citotóxica antiproliferativos y de Fe basado-amino-piridina cinco (II) -complexes que han sido previamente demostrado ser particularmente activos en reacciones de activación peróxido de [38-43], y el metal- correspondiente ligandos libres, frente a un panel de diversas líneas celulares humanas incluyendo epitelio-mesenquimal (EMT) inducida por las poblaciones estables de células madre, como el cáncer y las células no malignas. Los compuestos más activos se analizaron adicionalmente por su capacidad para inhibir la clonogenicidad de las células cancerosas, modular el ciclo celular e inducir la muerte celular. La capacidad de los complejos de hierro a base de amina-pirimidina para generar ROS y causar daño en el ADN se evaluó junto con la influencia de la quelación de hierro intracelular en su perfil citotóxico. Sobre la base de la interrupción letal en el equilibrio redox causados por estos complejos en el cáncer y las células madre, como el cáncer de ROS-resistentes, nos proporcionan la prueba funcional para una familia fuerte eficiente de metallodrugs contra el cáncer redox-dirigida.
Materiales y Métodos
Materiales
3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT), sulfóxido de dimetilo (DMSO), yoduro de propidio (PI) , sal deferoxaminemesylate (DFO), N-acetil-L-cisteína (NAC), calceína-acetoximetiléster (calceína-AM), tampón de cacodilato, Tris-EDTA (ácido tetraacético de etileno-diamino), tiron, azida de sodio, verde de metilo, Hoechst , bromuro de etidio, azul de bromofenol, cianol xileno, glicerol y RNasa A fueron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). El azul de metileno, peróxido de hidrógeno 35% (w /v) y etanol eran de Panreac (Barcelona, España). HEPES fue de ICN (Madrid, España). Triton-X100 era de PlusOne (Amersham Bioscience, Uppsala, Suecia). 2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (H
2DCFDA) era de Molecular Probes (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Agarosa fue de Ecogen (Barcelona, España). El cisplatino (Pharmacia, Pfizer Inc., Kalamazoo, MI, EE.UU.) fue proporcionado amablemente por la farmacia del Instituto Catalán de Oncología (ICO, Hospital Dr. Josep Trueta, Girona, España). medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio RPMI-1640, solución salina tamponada con fosfato (PBS), suero bovino fetal (FBS), penicilina-estreptomicina y la tripsina se obtuvieron de GIBCO BRL (Grand Island, NY, EE.UU.). DMEM /F12, suero de caballo y la insulina fueron de Invitrogen. La hidrocortisona, la toxina del cólera y el factor de crecimiento epidérmico fueron de Sigma-Aldrich. Mamaria de la célula epitelial de Medio de Crecimiento (MEGM) era de Lonza (Berkshire, UK). El plásmido pUC18 fue de Thermo Scientific (Waltham, MA, EE.UU.). Los compuestos seleccionados para este estudio (1, 1-Fe, 2, 2-Fe, 3, 3-Fe, 4, 4-Fe, 5 y 5-Fe) se sintetizaron siguiendo los procedimientos reportados [38-41].
Las líneas celulares
MCF-7 humana línea celular de cáncer de mama, CAPAN-1 línea celular de cáncer de páncreas, PC-3 línea celular de cáncer de próstata, Z-138, Jeko-1, Granta y SP53 no Hodgkin líneas celulares de linfoma, células Jurkat de células T leucemia linfoblástica aguda, líneas celulares de glioma LN229 y U87MG y MCF 10A inmortalizados línea de células epiteliales mamarias se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.). La línea celular de fibroblastos de colon humano CCD-18Co se obtuvo de EucellBank (Universidad de Barcelona, Barcelona, España). 1BR3G transformado fibroblastos de piel humana se obtuvieron de la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC, Porton, Reino Unido). MCF-7, Capan-1, PC-3, LN229 y U87MG se mantuvieron en DMEM. líneas celulares hematológicas se mantuvieron en RPMI-1640. Todos los medios se complementaron con 10% de FBS y 100 U /ml de penicilina-estreptomicina. Medio para JURKAT, las células Jeko-1 y Z-138 fue suplementado con 25 mmol /l HEPES. células MCF 10A se mantuvieron en DMEM /F12 suplementado con 5% de suero de caballo, 500 ng /ml de hidrocortisona, 100 ng /ml de toxina de cólera, 10 mg /ml de insulina y el factor de crecimiento epidérmico 20 ng /ml. células HMLE (inmortalizado células epiteliales mamarias humanas), células HMLER (células HMLE sobreexpresan hTERT, /t y H-RasV12 SV40 T) y células madre, como el cáncer HMLERshEcad (células HMLER transforman a través de ARN de horquilla corta para inhibir la expresión del gen CDH1, que codifica para la E-cadherina) [44], se mantuvieron en una mezcla 1: 1 de medio de HMLE (DMEM /F-12, más el 5% de suero de caballo, penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG), 10 mg /ml de insulina, 10 ng /ml de factor de crecimiento epidérmico y 0,5 g /ml de hidrocortisona) y MEGM. Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C bajo una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2
Ensayos de citotoxicidad
La actividad citotóxica de los compuestos se determinó mediante ensayo de reducción de MTT como se describe [ ,,,0],45]. Los compuestos se diluyeron en agua Milli-Q para obtener /L de soluciones madre de 1 mmol. alícuotas apropiadas de estas soluciones se diluyeron en medio de cultivo celular correspondiente para obtener las concentraciones de trabajo finales. Alícuotas de 5000 células 1BR3G, 6000 MCF-7, 6000 células PC-3, 10 000 Capan-1 células, 4000 células MCF 10A, 4000 células HMLE o 4000 células CCD-18Co se sembraron en placas de 96 pocillos, 24 h antes de la los tratamientos. líneas celulares hematológicas se sembraron a 400 000 células /ml. Las células fueron tratadas con el compuesto correspondiente en concentraciones que van de 0 a 100 mmol /L para 48 h. Se utilizaron tres réplicas para cada compuesto. El IC
50 se estableció para cada compuesto por regresión no lineal estándar y ajuste de curvas utilizando GraphPad Prism (Graph Pad Software Inc., La Jolla, CA, EE.UU.).
ensayo hemolítico
La actividad hemolítica de los compuestos a 100 mmol /L se evaluó mediante la determinación de la liberación de hemoglobina a partir de suspensiones de eritrocitos de la sangre humana fresca (5% vol /vol) como se describe [46].
ensayo de formación de colonias
MCF-7 células fueron sembradas en placas de 12 pocillos. Veinticuatro horas más tarde, las células se trataron con cisplatino, el compuesto 1, 2 o 5 a 10 mol /L, o vehículo solo como control, durante 3 y 24 horas a 37 ° C. Además, las células se expusieron al compuesto 1 de 3, 6, 12 y 24 horas. Posteriormente, las células se lavaron con PBS, se recogieron con tripsina y se sembraron en placas a baja densidad (3000 células en una placa de 360-mm). Las células se dejaron de dividirse y formar colonias durante 7-10 días; después de lo cual, las colonias se fijaron y se tiñeron con 2% de azul en 50% de etanol de metileno. Se determinó el número de colonias en cada placa usando el sistema Alpha Innotech Imaging (Alpha Innotech, San Leandro, CA).
Se determinó la actividad caspasa análisis
actividad de la caspasa enzimática después de exponer las células a compuesto 1, 2 y 5 a 10 mol /L durante 48 h. Caspasa 3/7 actividad se midió con el luminométrica caspasa-Glo 3 /7assay (Promega, Madison, WI, EE.UU.) utilizando un lector de microplacas de detección múltiple Synergy HT (Bio-Tek).
Análisis del ciclo celular
perfiles del ciclo celular se analizaron mediante citometría de flujo de células teñidas con PI. Brevemente, las células se recogieron por centrifugación, se lavaron en PBS enfriado con hielo y se fijaron durante 30 min a 4 ° C en 70% de etanol. Después de lavar dos veces con PBS, el ADN se tiñó con 50 mg /ml PI en presencia de 50 mg /ml de RNasa A. Las células teñidas se procesaron utilizando un citómetro de flujo FACScan (Coulter Epics XL-MSL; Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.) y el software WinMDI.
ROS mesurement
se determinó el contenido celular ROS utilizando la 2 ', 7'-diacetato sonda dichlorodihydrofluorescein (H
2DCFDA). Las células se sembraron en placas de 24 pocillos (50 000 células /pocillo) en DMEM libre de fenol rojo 24 h antes de los tratamientos. Las células se trataron con diferentes concentraciones de compuesto 1, 2 y 5 (2,5, 5 o 10 mmol /L) o vehículo solo como control, durante 5 o 24 horas a 37 ° C. En algunos experimentos, las células fueron co-tratadas con los compuestos más 5 mmol /L NAC. Después de los tratamientos, las células se lavaron con PBS y se incubaron con 1 mol /L H
2DCF-DA en PBS durante 30 minutos en la oscuridad. Después del lavado, se recogieron las células con tripsina y se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un flujo FACS Calibur citómetro-(Becton-Dickinson®, Sistemas Immunofluorometry, Mountain View, CA, EE.UU.). La intensidad de fluorescencia media geométrica de 10 000 células se estableció usando el software CellQuestTM (Becton Dickinson). Se determinó la fluorescencia plegable aumento en comparación con las células no tratadas para cada tratamiento.
Determinación de hierro celular lábil piscina
La piscina de hierro lábil celular se determinó con calceína-AM. células Capan-1 (125 000 células /pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos y se incubaron durante 24 h. Luego, las células fueron tratadas durante 24 h con 10 mmol /L de compuesto 1, 2 o 5 a 37 ° C. En algunos experimentos, las células se incubaron durante 2 h con 100 mmol /L de DFO o 100 mmol /L FeCl
2. Las células expuestas al vehículo solo se utilizaron como control. Después de los tratamientos, las células se lavaron con PBS y se incubaron con calceína-AM (0,25 mmol /L) durante 30 min a 37 ° C en la oscuridad. Posteriormente, las células se lavaron y se recogieron con tripsina y la intensidad de fluorescencia media geométrica de 10 000 células se determinó por citometría de flujo como se describe.
análisis daño en el ADN celular
daño del ADN se evaluó mediante el seguimiento de la intensidad de la fluorescencia p-H2A.X usando citometría de flujo. En resumen, se recogieron las células con tripsina, se lavaron en PBS y se fijaron en 3,7% de formaldehído durante 15 min en hielo. Las células fueron entonces permeabilizaron con 0,2% v /v Triton-X100 para 10 min y se incubaron con 1: 400 de conejo anti-p- (S139) de anticuerpos -H2A.X (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) durante 30 min en hielo. Después de lavar en 0,1% de Triton-X100 en PBS, las células se incubaron con 1: 400 anti-conejo Alexa 555 anticuerpo conjugado (Jackson ImmunoResearch, Newmarket, Reino Unido) durante 20 min en hielo. El análisis se llevó a cabo en un citómetro de flujo FACScan con software que fluye.
Análisis de escisión de ADN
escisión de ADN se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa. Una solución madre de ADN pUC18 estaba recién preparada en agua Milli-Q a una concentración de 0,5 mg /ml (1,512 mol /L de nucleótidos; 756 mmol /L bp). Las reacciones se realizaron mediante la mezcla de 0,5 l de pUC18 con alícuotas adecuadas de los compuestos y 1 l de solución de agente de activación (35% peso /volumen H
2O
2 en H
2O). Se añadió tampón de cacodilato (0,1 M, pH 6,0) a la mezcla para dar un volumen final de 20 l. La concentración final de ADN pUC18 fue 37,8 mol /L en los nucleótidos (18,9 mmol /L bp). Las muestras se incubaron durante 1 h a 37 ° C; reacciones se inactivaron mediante la adición de 6 l de una solución tampón que consiste en azul de bromofenol (0,25%), cianol xileno (0,25%), y glicerol (30%). Posteriormente, las muestras se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 0,8% en 0,5 x tampón TBE (0,045 mol /L Tris, ácido bórico /L 0,045 mol, y 1 mmol /L EDTA) a 100 V durante 1 h y 40 min. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio (10 mg /ml en TBE) durante 15 min y se visualizaron mediante transiluminación UV. Las bandas de ADN fueron capturados utilizando el 2.7 sistema de ProgRes CapturePRO y la intensidad de cada banda se cuantificó con el software versión GelQuant 2,7 (DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalén, Israel), utilizando un factor de corrección de 1,31 para compensar la absorción de bromuro de etidio reducido de plásmido superenrollado de ADN pUC18 [47]. Se estableció la proporción de las diferentes formas de ADN de plásmido para cada tratamiento. Para probar la implicación de los ROS en la escisión de cadena y los posibles sitios de interacción compleja de ADN, se añadieron varios captadores de ROS y de unión al surco de las mezclas de reacción. Los eliminadores utilizados fueron Tiron (10 mmol /L), azida de sodio (0,4 mol /L), y dimetilsulfóxido (DMSO, 3 l). Los aglutinantes utilizados fueron surco verde de metilo (20 mmol /L) y Hoechst (40 mmol /L)
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el paquete estadístico SPSS para Windows (versión 15.0.; SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Las variables cuantitativas se expresan como media y desviación estándar (DE) de al menos tres experimentos independientes. La normalidad de los datos se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Se analizaron las diferencias entre los datos con distribución normal y varianzas homogéneas usando la prueba t de Student paramétrico. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
Selección de compuestos
Los complejos de coordinación de hierro Fe-1, 2-Fe, 3-Fe, 4-Fe. y 5-Fe se seleccionaron para ensayar su actividad antitumoral frente a diferentes líneas celulares humanas en base a su capacidad para formar especies altamente oxidantes al reaccionar con peróxidos [38-43]. Cuatro Fe (II) a base de complejos de Fe-1, 2-Fe, 3-Fe-Fe y 4 contienen ligandos tetradentados aminopiridina y son conocidos por su actividad superior en la catálisis de oxidación [38-40,42,43]. Complejo 5-Fe contiene un ligando pentadentado y es conocido para estabilizar los estados altos de oxidación de hierro [41]. compuestos Además, la libre de hierro orgánicos 1, 2, 3, 4 y 5 se ensayaron para evaluar el efecto de la ligadura de metal para su actividad citotóxica (Fig 1).
Los compuestos 1, 2 y 5 son altamente citotóxica contra las células madre, como el cáncer y el cáncer
actividad antiproliferativa de los complejos de hierro (Fe-1, 2-Fe, 3-Fe, 4-Fe-Fe y 5) y la correspondiente hierro libre ligandos (1, 2, 3, 4 y 5) se ensayó inicialmente contra dos líneas de células de cáncer de tumor, MCF-7 y Capan-1. Los compuestos se ensayaron en diferentes concentraciones que variaban de 0 a 100 mmol /L para determinar la concentración requerida para inhibir el crecimiento celular en un 50% (IC
50). Los compuestos con IC
50 valores mayores de 100 mmol /L se consideran inactivos. Sólo tres de los cinco complejos de hierro (1-Fe, 3-Fe, 4-Fe) demostraron un efecto antiproliferativo medible en células MCF-7, mientras que ninguno de complejos de hierro eran activos contra células Capan-1 (Tabla 1). La actividad antiproliferativa de 3-Fe y 4-Fe era más bien modesta (IC
50 = 73,5 ± 0,7 mmol /L y 63,5 ± 2,1 mmol /L, respectivamente). Por el contrario, todos los ligandos libres de hierro eran citotóxicos en ambas líneas celulares analizadas, con IC
50 valores que van de 3,7 ± 0,4 a la 88,5 ± 0,7 mmol /L en células MCF-7 y de 6,0 ± 0,7 a la 32,0 ± 10,4 mol /L en células Capan-1. Estos valores están dentro de la gama de agentes contra el cáncer bien establecidos tales como el cisplatino se ensayó en las mismas condiciones (Tabla 1). Dada la actividad antiproliferativa débil de los complejos de hierro, nos centramos en los compuestos orgánicos libres de metal y se evaluó su citotoxicidad contra una selección de tumor (PC-3, Z-138 y Jurkat) y no maligno (HMLE, MCF 10A, 1BR3G líneas celulares y CCD-18Co) (Tabla 2). Compuesto 2 fue el ligando más activos contra las células tumorales, con IC
50 valores que van desde 3,8 ± 0,2 a 7,2 ± 1,9 mmol /L. Los compuestos 1 y 5 también mostraron bajos IC
50 valores (de 4,8 ± 1,2 a 15,1 ± 3,1 mmol /L y de 2,9 ± 0,4 a 7,7 ± 0,3 mmol /L, respectivamente), mientras que se obtuvo una actividad antitumoral más moderado para ligandos 3 y 4. Sólo en la línea normal de las células de colon CCD-18Co la actividad de los compuestos fue menor que en las líneas de células tumorales. Es importante destacar que, ninguno de los ligandos se hemolítica, incluso a 100 mmol /L (Tabla 2). Las propiedades antitumorales de los ligandos se evaluaron adicionalmente en un panel de líneas celulares, incluyendo las células de leucemia humana, linfoma y cáncer de glioma, mediante el análisis de sus efectos citotóxicos en 10 mmol /L. Como era de esperar, los compuestos 1, 2 y 5 también muestran alta actividad antiproliferativa contra estas líneas celulares (Fig 2A), lo que demuestra su capacidad de ser agentes antitumorales ampliamente activos.
(A) La actividad citotóxica de los compuestos 1, 2, y 5 contra las células cancerosas. Las líneas celulares indicadas se trataron durante 48 h con ligandos (10 mmol /L) y la viabilidad celular se midió con el ensayo de MTT. Los datos representan el porcentaje de células viables con respecto a las células no tratadas (control). (B) Citotoxicidad de la doxorrubicina y compuestos 1, 2 y 5 contra las células CS-similares. CS-como las células HMLER-shEcad y células parental isogénica no-CS-como HMLER fueron tratados durante 48 h con concentraciones graduadas de doxorrubicina, 1, 2 y 5. La viabilidad celular se midió con el ensayo de MTT. Para cada tratamiento, el porcentaje de células viables con respecto a las células no tratadas se indica. Los datos representan la media ± DE de 3 experimentos independientes realizados por triplicado.
Para obtener una perspectiva de la potencia citotóxica de los ligandos 1, 2 y 5, se evaluó su actividad antiproliferativa in una línea estable madre de cáncer de mama (CS) -como celular (HMLER-shEcad). Esta línea celular se estableció originalmente a partir de células transformadas y triples oncogénicos inmortalizadas humanas epiteliales mamarias (HMLER), en la caída de la E-cadherina activa una transición epitelio-mesenquimal (EMT) que dio lugar a células con características de células madre cancerosas característica [44,48]. Como era de esperar, las células HMLER-shECad CS-como eran más resistentes a la conocida agente de quimioterapia doxorubicina que las células HMLER de control isogénica no-CS-como [48] (IC
50 = 0,3 ± 0,02 mmol /l frente a 0,10 ± 0,02 mmol /L, respectivamente, lo que representa un aumento de ~ 3 veces en la IC
50) (figura 2B). En contraste, el perfil citotóxico de los ligandos 1 y 2 se mantuvo en gran medida inalterados en CS-como las células HMLER-shECad (IC
50 = 5,3 ± 0,7 mmol /L y 6,8 ± 0,1 mmol /L, respectivamente) con respecto a HMLER células ( IC
50 = 6,5 ± 0,4 mmol /L y 6,6 ± 0,3 mmol /L, respectivamente) (figura 2B), lo que indica que estos ligandos inducen la muerte celular a través de un mecanismo que no puede por reprimidos por el fenotipo quimiorresistente-CS-similares. Por otra parte, el compuesto 1 mostró algo citotoxicidad selectiva hacia células HMLER-shECad. Por el contrario, HMLER-shECad exhibió cierta resistencia a la citotoxicidad inducida por el ligando 5-(IC
50 = 8,6 ± 0,5 mmol /L en comparación con 5,1 ± 0,1 mmol /L en las células HMLER) (figura 2B).
la actividad a largo plazo de los ligandos se determinó mediante la medición de su capacidad para inhibir el potencial clonogénico de las células cancerosas. Por lo tanto, MCF-7 células fueron tratadas durante 3 ó 24 h con 10 mmol /L de ligando 1, 2 o 5, o cisplatino como control positivo, seguido por chapado a baja densidad. Análisis de los números de colonias después de 10 días revelaron un marcado efecto inhibidor del compuesto 2 en la formación de colonias y el número de colonias se redujo significativamente en un 39% en comparación con células de control después de 3 h de exposición al ligando (Fig 3A). Además, la clonogenicidad de células MCF-7 fue casi abolida después de la exposición 24 h en el compuesto 2, revelando una mayor actividad inhibidora que el cisplatino. En este punto de tiempo, los compuestos 1 y 5 también redujo significativamente el número de colonias por 57% y 53%, respectivamente, aunque su actividad fue menor que la del compuesto 2, que está de acuerdo con la actividad antiproliferativa de los ligandos (Tabla 2). En contraste con el tratamiento con cisplatino, la inhibición del crecimiento celular por los ligandos era dependiente del tiempo. La exposición de las células MCF-7 a ligando 1 de 3, 5, 12 y 24 h redujeron el número de colonias por 0%, 18,7%, 40,5% y 56,6%, respectivamente (figura 3B). Estos resultados indican que los ligandos desencadenan un mecanismo de muerte celular retardada que requiere de varias horas a tener lugar.
(A) La formación de colonias de las células MCF-7 después de la exposición a los compuestos 1, 2 y 5 (10 mmol /L ) durante 3 ó 24 h. El cisplatino se incluyó como un control positivo. (B) La formación de colonias después de la exposición al compuesto 1 (10 mmol /L) para 3, 5, 12 y 24 h. Los gráficos de barras muestran el porcentaje de colonias contadas en relación con el control de las células no tratadas y representan la media ± DE de 3 experimentos independientes. * P & lt; 0,05 frente a las células de control.
compuestos 1, 2 y 5 Promover la detención del ciclo celular y la apoptosis
Para determinar si los ligandos inducen la muerte celular a través de la activación de la muerte celular programada (apoptosis) , se analizó la activación de las caspasas verdugo, caspasa-3 y -7, utilizando un ensayo luminométrico en un panel de líneas celulares de cáncer humano. Las células se trataron con los ligandos a 10 mol /L y se monitorizó la actividad de caspasa después de 48 h. Todos los tres ligandos activan la caspasa 3/7 en cierta medida (Fig 4). tratamiento con compuesto 2 aumentó claramente la actividad de caspasa 3/7 en todas las líneas celulares en comparación con los controles no tratados. Curiosamente, el tratamiento con el compuesto 1 dio lugar a significativa activación de la caspasa 3/7 en el linfoma (Z-138, Jeko-1, Granta y SP-53), pero no en la leucemia (Jurkat) o glioma (LN229 y U87MG) líneas celulares. Compuesto 5 indujo un amplio efecto pro-apoptótico, la activación de la caspasa 3/7 en la mayoría de las líneas celulares excepto las células PC-3, y fue el compuesto más eficaz contra células Jurkat (Fig 4). Es importante destacar que estos resultados se correlacionan fuertemente con el perfil de efectos citotóxicos inducidos por los compuestos 1, 2 y 5 (Fig 2A), y sugieren que los compuestos 2 y 5 promover la muerte celular principalmente mediante la inducción de apoptosis. Estos resultados se confirmaron mediante el análisis del efecto de la inhibición de caspasas sobre la actividad citotóxica de los compuestos. Como se muestra en la figura 4B, el inhibidor pan-caspasa QVD-Oph revertido significativamente la citotoxicidad de los compuestos 1 y 5 en las células Capan-1 MCF-7 y la inducción de un aumento de la viabilidad de las células que van desde 2,5 hasta 4 veces. Digno de mención, de acuerdo con nuestras observaciones anteriores, el compuesto 2 muestra una muy alta actividad citotóxica, lo que puede explicar la falta de reversión en presencia del inhibidor de caspasa en estas condiciones experimentales. Estos resultados apoyan que la actividad citotóxica de estos compuestos implica la apoptosis dependiente de caspasa.
(A) Las líneas celulares indicadas se trataron durante 48 h con los compuestos 1, 2 y 5 (10 mmol /L) y la caspasa 3 /7 se midió la actividad como se indica en Materiales y Métodos. Los gráficos de barras muestran el aumento veces en la actividad de la caspasa en relación con sin tratar (control) y representan la media ± SD de tres experimentos independientes realizados por triplicado. (B) MCF-7 y Capan-1 células fueron tratadas durante 48 h con los ligandos (10 mM) en ausencia (-) o presencia (+) del inhibidor de pan-caspasa QVD-Oph (20 m) y la viabilidad celular se midió con el ensayo de MTT. Los datos muestran el porcentaje de células viables con respecto a las células no tratadas (control). Los datos representan la media ± DE de 3 experimentos independientes realizados por triplicado. Las diferencias entre la ausencia y la presencia de tratamiento QVD-OPh fueron estadísticamente significativas a * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 y *** p & lt;. 0.001
Para explorar el efecto de ligandos en las células la progresión del ciclo, la distribución del ciclo celular de las células MCF-7 y LN229 células se examinó por citometría de flujo después de 24 y 48 h de exposición a los compuestos 1, 2 y 5 (10 mmol /L).