Extracto
Es bien sabido que B-1 B células son el tipo de célula principal que es responsable de la producción de inmunoglobulinas naturales M (IgM ) y puede responder a la infección mediante el aumento de la secreción de IgM. Sin embargo, hemos encontrado inesperadamente que algunas células epiteliales también pueden expresar transcripción reordenado IgM que tiene características IgM naturales, tales como los patrones de la línea germinal codificada y de reordenamiento restringido. Aquí hemos estudiado la expresión de IgM en células no B humanas y encontramos que la IgM se expresa frecuentemente por muchas células humanas de cáncer epitelial, así como células epiteliales no cancerosas. Por otra parte, CD79A y CD79b, dos moléculas que están físicamente vinculados a membranosa IgM en la superficie de las células B para formar el complejo receptor de antígeno de células B, también se expresaron en la superficie celular de las células cancerosas epiteliales y co-localizan con IgM. Al igual que la IgM natural, la IgM derivada de células del cáncer epitelial de reconocido una serie de antígenos microbianos, como el ADN de una sola hebra, DNA de doble cadena, lipopolisacárido, y el antígeno de células HEp-2. Más importante, la estimulación del receptor de tipo toll 9 (TLR9), que imita la infección bacteriana, aumenta sustancialmente la secreción de IgM en células de cáncer epiteliales humanas. Estos resultados indican que las células humanas de cáncer epitelial, así como células epiteliales no cancerosas pueden producir de forma espontánea IgM con actividad de anticuerpo natural
Visto:. Hu F, Zhang L, Zheng J, Zhao L, Huang J, Shao W , et al. (2012) Producción espontánea de Inmunoglobulina M en células de cáncer epitelial humano. PLoS ONE 7 (12): e51423. doi: 10.1371 /journal.pone.0051423
Editor: Jonas Fuxe, Instituto Karolinska, Suecia |
Recibido: 27 Agosto, 2011; Aceptado: 7 de noviembre de 2012; Publicado: December 12, 2012
Derechos de Autor © 2012 Hu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas 30973389 y 30772470 de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
es bien sabido que a medida que una molécula de inmunidad clásico, la inmunoglobulina (Ig) juega un papel esencial en el sistema inmunológico [1]. Se puede unir a sustancias extrañas como las bacterias y ayudar en la destrucción de ellos [2]. Ig se pensaba previamente su producción solamente por los linfocitos B y células plasmáticas. Durante la última década, sin embargo, este concepto ha sido cuestionada por una serie de estudios [3], [4], [5], [6],. En 2003, se informó de la primera expresión de IgG en las células cancerosas epiteliales humanos [3]. Desde entonces, nuestro grupo y otros han confirmado que muchas células cancerosas no-B humano y algunas células normales pueden producir Ig, especialmente IgG o IgA [4], [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. IgG otra parte, estos derivados de células de cáncer no-B o IgA está implicado en la supervivencia y la proliferación de células de cáncer [3], [4], [18]. Sin embargo, la expresión de IgM en células no B humanas rara vez se estudió [8]. Recientemente, hemos encontrado que la cadena pesada de IgM (Ig μ) de genes con un repertorio distinto se transcribió en las células cancerosas epiteliales humanos [8], lo que sugiere que la IgM podría ser también expresada en estas células de linaje epiteliales.
Hay dos clases de IgM, naturales e inmunológico. IgM natural ha sido pensado para ser producido solamente por 1 B-B células en ausencia de encuentros patógenos innata parecidos, e IgM inmunológico está producida por ambas células B innata-como B-1 y B-2 adaptativa células B después de un antígeno o encuentro patógeno. IgM natural constituye la mayoría del total de IgM circulantes. La mayor parte de la IgM natural, se codifica y polirreactivo línea germinal, y se une con baja afinidad a un número de diferentes antígenos, tales como los patógenos microbianos, lo que contribuye a la inmunidad temprana antes de la aparición de la respuesta humoral adaptativa y juega un papel fundamental en antimicrobiana temprano inmunidad [19]. Sin embargo, estudios recientes realizados por Zhou et al. mostraron que no todas las células de unión al antígeno IgM productoras naturales polireactivos B expresan B-1 B marcadores de superficie celular (por ejemplo, IgM
hola, IgD
lo, B220
lo, Mac-1
hi , CD23
lo y CD5
hi) [20], lo que sugiere que, además de B-1 B células, otros tipos de células también pueden estar involucrados en la producción de IgM natural.
Toll-like receptores (TLR) son una clase de proteínas que desempeñan un papel fundamental en el sistema inmune innato. Reconocen "patrones moleculares asociados a patógenos", que son estructuralmente conservadas moléculas derivadas de microbios y se pueden distinguir de las moléculas anfitrionas, y activan la respuesta inmune innata [21]. Más de 13 miembros de la familia TLR se han identificado en los mamíferos. TLR9 reconoce específicamente secuencias de CpG no metilados en ADN microbiano [21], [22]. oligodesoxinucleótidos sintéticos (ODN) con motivos CpG no metilados, que pueden imitar los efectos de ADN microbiano, también son reconocidos por TLR9 [23], [24], [25], [26]. Una vez activado, TLR9 y sus adaptadores asociados, tales como antígeno de diferenciación mieloide 88 (MyD88) [27], [28], reclutan mediadores de señalización intracelular e inducen la activación del factor nuclear kappa B (NF-kB) y la proteína quinasa activada por mitógenos vías, lo que resulta en la producción de citoquinas y Ig, principalmente IgM [29].
en los seres humanos, TLR9 se expresa preferentemente en las células B, células dendríticas plasmacitoides, monocitos, y células asesinas naturales [22]. TLR9 funcional también se han encontrado en muchas células cancerosas epiteliales humanas tales como cáncer de pulmón, cáncer de mama y cáncer de próstata [30], [31], [32], [33], [34]. Más importante, CpG ODN, e incluso no CpG ODN, puede activar TLR9 expresa en líneas celulares de cáncer de mama y las líneas celulares de cáncer de próstata, que resulta en aumento de la invasión celular [32], [33], [34]. Cuando es activada por CpG no metilado, TLR9 induce la secreción de muchas citoquinas, tales como interleuquina -1α (IL), IL-6, y IL-8 [31], [35]. Todavía no está claro si TLR9 en las células de cáncer epitelial puede mediar en la producción y secreción de IgM.
En este estudio, se evaluó la expresión de IgM en células no humanas B, y demostraron que las células cancerosas epiteliales humanas, así como la no las células epiteliales cancerosas pueden producir de forma espontánea IgM natural. agonistas TLR9 estimulan la secreción de IgM en células de cáncer epiteliales humanas. Al igual que la IgM natural derivado de células B-1 B, la IgM derivada de células del cáncer epitelial de reconocido una serie de antígenos microbianos y algunos autoantígeno. Estos resultados indican que las células humanas de cáncer epitelial, así como células epiteliales no cancerosas pueden producir de forma espontánea IgM con la actividad de los anticuerpos naturales.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y Cultura y
la línea celular de cáncer cervical humano HeLa MR, un
O
6-metiltransferasa-ADN metiltransferasa derivado deficiente de HeLa S3 [36], [37], [38], [39], [40 ], [41], fue un regalo del doctor Shouping Ji (Academia de Ciencias Médicas Militares, Pekín, china). Todas las otras líneas celulares, incluyendo la línea celular de cáncer cervical humano HeLa, líneas celulares de cáncer de colon HT-29 y SW480, línea celular de cáncer hepático HepG2, línea celular de osteosarcoma U-2 OS, líneas de células embrionarias de riñón 293 y 293T y células de leucemia B linfocítica línea Raji se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). HeLa MR, HT-29, SW480, HepG2, U-2 OS, 293 y 293T se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de antibióticos, mientras que HeLa y Raji fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de antibióticos a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. Se utilizaron las células en fase de crecimiento logarítmico de los experimentos.
Muestras de Tejido
microarrays de tejidos se compraron de la Departamento de Patología, Hospital de la Amistad Beijing. Se estudiaron un total de 202 muestras, que incluye 26 tipos diferentes de tumores, 19 muestras de contrapartida de una enfermedad benigna, y los tejidos normales. Cortamos 4 micras secciones de los bloques de microarrays de tejidos multitumor resultantes y se monta cada sección en un tobogán cubierto con adhesivo (Instrumedics Inc., Hackensack, NJ, EE.UU.). cáncer de los tejidos congelados, incluyendo el cáncer de mama (2 casos), el cáncer de colon (2 casos), el cáncer de pulmón (2 casos) y el cáncer de ovario (1 caso) eran del banco de muestras de tejido tumoral del Hospital del Cáncer de la Universidad de Pekín. Se prepararon 4-micras secciones congeladas y se fijaron con acetona.
Inmunohistoquímica
secciones de microarrays de tejidos se desparafinaron, se rehidrataron mediante lavados de etanol de concentraciones distintas, colocado en 10 mM de tampón de citrato (pH 6,0), y después se calentó dos veces en un horno microondas durante 5 minutos cada uno. Los portaobjetos se incubaron a continuación con peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se bloquearon en PBS más suero normal de cabra 10% durante 10 minutos. Después de eliminar el exceso de tampón de bloqueo, se realizó la tinción inmunohistoquímica indirecta con el ratón monoclonal anti-Ig humana μ (1:100, Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.). Los portaobjetos se incubaron en una cámara humidificada a 37 ° C durante 45 minutos, se lavó a fondo, y después se incubaron con peroxidasa de cabra anti-IgG de ratón-rábano picante (HRP) (1:100, Dako) a 37 ° C durante 30 minutos. Las láminas fueron lavadas de nuevo, y los anticuerpos unidos se detectaron usando 3,3 '-Diaminobencidina tetrahidrocloruro (DAB, Dako). Las secciones de control se tiñeron con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-HRP solo.
Inmunofluorescencia La tinción
Para confirmar la expresión de IgM en células epiteliales humanas, la tinción de inmunofluorescencia de dos colores se realizó en portaobjetos de tejido congelado . Brevemente, los portaobjetos de tejido congelado se bloquearon con suero de cabra normal 10% y, a continuación los portaobjetos se incubaron con Ig de ratón anti-humano μ (Mabworks Biotech Co., Pekín, China), así como de conejo pan-citoqueratina anti-humano o de conejo CD19 anti-humano (Santa Cruz, CA, EE.UU.) a 37 ° C durante 1 hora, seguido de incubación con anticuerpo de cabra conjugado con TRITC-anti-IgG de ratón y Alexa Fluor® 488 conjugado con IgG de cabra anti-conejo (Santa Cruz) en 37 ° C durante 30 minutos. Después de la contratinción con Hoechst 33342, se observaron las diapositivas directamente bajo un microscopio de fluorescencia invertido (Olympus IX71-141, Tokio, Japón).
Análisis de citometría de flujo
Se realizó el análisis de citometría de flujo para evaluar la expresión de IgM y TLR9 en células de cáncer epiteliales humanas. Para la detección de IgM y TLR9 en la superficie celular, se recogieron las células, se lavaron dos veces con PBS, se bloquearon con 2% de FBS en PBS a 4 ° C durante 30 minutos, se tiñeron con anticuerpos monoclonales de ratón (mAb) contra Ig humana μ (Mabworks) o TLR9 (IMG-305A, imgenex, San Diego, CA, EE.UU.) a 4 ° C durante 40 minutos. Después de dos lavados con PBS, se incubaron las células en 100 l de PBS que contiene isotiocianato de fluoresceína (FITC) de cabra conjugado con anti-IgG de ratón (Santa Cruz) a 4 ° C durante 30 minutos. Las células se lavaron dos veces con PBS, y se analizaron 10.000 células en un citómetro de flujo FACSCalibur usando el software CellQuest (Becton Dickinson, San Diego, CA, EE.UU.). La fluorescencia de fondo se determinó usando células incubadas con el anticuerpo secundario pero sin el anticuerpo primario.
Para la evaluación de intracelular IgM y TLR9, las células recogidas fueron fijadas en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 30 minutos, se lavó con PBS y permeabilizadas dos veces con 1 x tampón de permeabilización (eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.). Las células se centrifugaron a 1500 rpm a 4 ° C durante 5 minutos. Se desechó el sobrenadante, y las células se marcaron con anticuerpos primarios y secundarios apropiados como se describe anteriormente.
Para excluir la posibilidad de contaminación de las líneas celulares de cáncer de los linfocitos B, se recogieron las células, se lavaron dos veces con PBS, bloqueados con 2% de FBS en PBS durante 30 minutos, y se tiñeron con anticuerpos monoclonales CD19-ficoeritrina anti-humano (PE) (Becton Dickinson) a 4 ° C durante 40 minutos. Después de dos lavados, se evaluaron las células para la expresión CD19 en un citómetro de flujo FACSCalibur. El CD19
+ línea de células Raji se utilizó como control positivo. La fluorescencia de fondo se determinó usando células incubadas con PE-conjugado IgG de ratón (Becton Dickinson).
transcripción inversa-polimerasa Reacción en Cadena de análisis (RT-PCR) y PCR en tiempo real
ARN total fue extraído de células o muestras de tejido utilizando reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se trató con DNasa Turbo (Ambion, Austin, TX, EE.UU.) para eliminar la contaminación de ADN genómico. La transcripción inversa se realizó con el kit de síntesis de ADNc de la primera cadena RevertAid (Fermentas, Glen Burnie, MD, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. El ADNc resultante se sometió a PCR en tiempo real y análisis de PCR.
PCR se realizó para analizar la expresión de Ig μ, κ Ig, CD79A, CD79b, TLR9 y MyD88 en las líneas celulares de cáncer epithelical humanos (cebadores mostrados en las Tabla S1). Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel en 1% de agarosa. La identidad de los productos de PCR se confirmó mediante secuenciación de ADN.
de dos pasos en tiempo real PCR se realizó para cuantificar la expresión de IgM y CD19 en los tejidos de cáncer epiteliales humanas utilizando SYBR Green Mix Master (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante (cebadores que se muestran en la Tabla S2). La reacción se ejecuta en el sistema de PCR en tiempo real Fast 7300 (Applied Biosystems). La expresión génica se cuantificó con respecto a la expresión del gen constitutivo GAPDH, y se normalizaron con el control positivo (células mononucleares de sangre periférica humana) por
2 estándar -. △△ cálculo CT
extracción de proteínas y Western Blot análisis
para extraer las proteínas citoplasmáticas, los gránulos de las células cosechadas fueron lisadas en el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) de tampón de lisis (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, EE.UU.), y se incubó en hielo durante 30 minutos. Los lisados se centrifugaron a 16.000 rpm a 4 ° C durante 30 minutos. Los sobrenadantes se recogieron para el análisis de transferencia Western.
Para obtener proteínas secretadas, se recogió el sobrenadante del cultivo celular sin restos de células, se precipitó durante la noche con sulfato de amonio saturado 100% (1:01), y se centrifugó a 16.000 rpm durante 20 minutos a 4 ° C. El sobrenadante se descartó. El sedimento se resuspendió en 100 l de PBS, se dializa dos veces con 0,05 M PBS durante 24 h, y después se utiliza para el análisis de transferencia Western.
Se realizó análisis de transferencia de Western usando reducida (con β-mercaptoetanol) o no reducido ( sin β-mercaptoetanol) muestras de proteínas que se han separado por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Amersham Pharmacia, Little Chalfont, UK). Las membranas fueron bloqueadas con solución salina tamponada con Tris que contenía 0,1% de Tween-20 y 5% de leche sin grasa o 5% de albúmina de suero bovino (para la detección de fosfoproteínas) a temperatura ambiente durante 2 horas, y se incubaron con anticuerpos primarios, tales como anti-ratón Ig humana μ mAB (Mabworks), Ig de cabra anti-humano mu anticuerpo policlonal (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), ratón CD79A anti-CD79b humana y anticuerpos monoclonales (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.), de ratón anti-humano TLR9 mAB (imgenex), anti-fosfo-PKC mAb, anti-fosfo-Akt mAb, anti-fosfo-ERK mAb, anti fosfo-I? B-mAb, y anti-I? B mAb (todos de Señalización celular, Danvers, MA, EE.UU. ), anticuerpo de conejo policlonal anti-ERK (Kangcheng Biotech Co., Shanghai, china), y mAb anti-actina (Sigma), a 4 ° C durante la noche. Las membranas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1% de Tween-20 durante 10 minutos cada uno, y se incubaron con IRDye 800 o anticuerpos secundarios conjugados (700-LI-COR Bioscience Inc., Lincoln, NE, EE.UU.) a la habitación la temperatura en la oscuridad durante 1 hora. La señal se detectó usando el sistema de imágenes Odyssey (LI-COR Bioscience).
calcio intracelular Flujo Medición
Medición de flujo de calcio intracelular se realizó como se describió anteriormente [42]. Brevemente, las células HeLa fueron cultivadas en platos de RM de pocillos con fondo de cristal especializados (MatTek Corp., Ashland, MA, EE.UU.) y se cargaron con 5 mM de Fluo-3 /AM en solución salina tamponada con HEPES a 37 ° C en la oscuridad durante 30 minutos . Las células se lavaron con solución salina tamponada con HEPES y se estimularon con 20 mg /ml de cabra anti-IgM humana o IgG de cabra. La fluorescencia se controló a 488 nm (excitación) y 530 nm (emisión) usando un microscopio de fluorescencia confocal Leica TCS-NT (Leica MicroImaging, Mannheim, Alemania) con una lente de inmersión 40 × aceite (Wetzler, Heidelberg, Alemania). Las imágenes se recogieron en 5 segundos por cinco veces antes de la estimulación, y cada 1,5 segundos durante 60 segundos, y luego cada 5 segundos durante otros 120 segundos. La medición se completó a temperatura ambiente, y cada campo de las células fue seleccionada al azar. Las imágenes se analizaron para la fluorescencia relativa usando software confocal Leica (Wetzler). Todos los ensayos de flujo de calcio se llevaron a cabo en la presencia de calcio extracelular y en ausencia de EDTA o EGTA en los tampones de ensayo. Por lo tanto, se analizaron tanto la liberación de calcio intracelular y la entrada de calcio extracelular.
El tratamiento de la célula con ODN Estimulación
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MyD88 ensayo desmontables se realizó utilizando sintetizado MyD88 siRNAs tal como se describe anteriormente [43]. El siRNA se transfectó en la línea celular HeLa mediante electroporación MR. El estímulo antes mencionados (CpG 2006, CpG 2078, o GPC) se añadió en el cultivo celular 24 horas después de elecroporation, y las células se recogieron después de otros 3 días para RT-PCR, citometría de flujo y análisis de transferencia de Western.
análisis de microscopía confocal
células HeLa MR se estimularon con o sin Ig de cabra anti-humano mu anticuerpo policlonal (20 mg /ml) durante 5 minutos, y se tiñeron con doble PerCP /Cy5.5 conjugado ratón anti-Ig humana μ (Biolegend, San Diego, CA, EE.UU.) y el ratón conjugado con FITC anti-humano CD79A (ABD SEROTEC, Kidlington, Reino Unido) o conjugado con FITC de ratón anti-Ig humana μ y anti-ratón conjugado con PE CD79b humano (eBioscience). Las células se sometieron a análisis de microscopía confocal y las imágenes se recogieron con un Axioskop-2 microscopio (Olympus, Tokio, Japón), un 63 × NA objetivo 0.75 Plan de Apochromat de inmersión en aceite y conjuntos de filtros estándar (Leica MicroImaging), un 1300 × 1030 pixel-enfriado cámara del dispositivo de carga acoplada (CCD-1300-y; Princeton Instruments, Trenton, Nueva Jersey, EE.UU.), y el software MetaVue (Visitron Systems, Puchheim, Alemania) |
Análisis de anticuerpos naturales Actividad de epitelial. cáncer de células derivadas de IgM
Para analizar si derivado de células de cáncer epitelial de IgM tiene una actividad natural de anticuerpos contra los antígenos microbianos tales como el ADN de cadena sencilla (ssDNA), el ADN de doble cadena (dsDNA), o lipopolisacárido (LPS ), se realizó un ensayo de antígeno específico de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) usando HeLa MR sobrenadante de cultivo celular que contiene IgM. Las placas de microtitulación se recubrieron con 10 g /ml ssDNA, dsDNA, o LPS (todos de Sigma). Ig de ratón anti-humano μ mAb y de cabra marcado con HRP anti-IgG de ratón se utilizaron para detectar IgM, con tetrametilbencidina como sustrato. OD450 se midió utilizando un lector de microplacas (Bio-Tek, Winooski, VT, EE.UU.).
También se realizó la tinción de inmunofluorescencia indirecta para analizar la actividad de autoanticuerpos de IgM derivada de células de cáncer epitelial. Incubamos diapositivas de células HEp-2 (EUROIMMUN, Lübeck, Alemania) con HeLa MR sobrenadante del cultivo celular que contiene IgM. Después de lavar con PBS, ratón anti-Ig humana μ MAB y de cabra conjugado con FITC anti-IgG de ratón se utilizaron para detectar señal positiva.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron con la estadística el software SAS versión 8.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.). Las diferencias entre los distintos grupos se calcularon por t
ensayo o prueba de chi-cuadrado
de Student. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando
P
era. & Lt; 0,05
Resultados
IgM se expresa principalmente en las células epiteliales humanas
Se analizaron microarrays de tejidos de 202 muestras de tejido para la expresión de IgM por inmunohistoquímica, incluyendo el cáncer o en los tejidos normales de epitelial, mesenquimal, y el origen neuroglial, así como las células germinales (Tabla S3). Se encontró que el IgM se expresó con más frecuencia en las células epiteliales, incluyendo 17 de 34 (50%) de las células epiteliales de cáncer, especialmente los carcinomas de pulmón, mama, hígado y páncreas (Figura 1A-D), y 23 de 66 (34,8% ) las células epiteliales no cancerosas (Figura 1E, F). En contraste, no o de baja frecuencia IgM se encuentra en las células neoplásicas mesenquimales (1 de 47, [2,1%], que contiene los lipoma, fibroma, y las células leiomioma [Figura 1I]) y en las células mesenquimales normales (1 de 34, [2.9 %]; incluyendo lipocitos, fibroblastos y células de músculo liso). Ninguna de las células neurogliales evaluados expresa IgM (0 de 13, [0%]). Es interesante que la expresión de IgM se detectó a niveles elevados en células de seminoma y en algunas células germinales normales en el testículo (Figura 1K, L). Dos casos de linfoma de células T no tenían expresión IgM detectable, como se esperaba (Figura 1J). Estos resultados sugieren que deriva no de células B IgM se encuentra principalmente en las células epiteliales
, células de cáncer de pulmón A.; B, las células del cáncer de mama; C, las células de cáncer de hígado; D, las células de cáncer de páncreas; E, células epiteliales del túbulo renal; F, las células epiteliales del endometrio; G, las células epiteliales de los túbulos renales, teñidas con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-HRP solamente, como control negativo; H, las células epiteliales del endometrio, teñidas con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-HRP solamente, como control negativo; I, células leiomioma; células de linfoma J, T; K, células de seminoma; L, espermatocitos.
Para confirmar aún más que la IgM se expresa por las células cancerosas epiteliales, pero no las células B infiltrado, la tinción de inmunofluorescencia de dos colores se realizó en portaobjetos de tejido de cáncer epiteliales congelados, incluyendo el cáncer de colon , cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de ovario, con anticuerpos anti-pan-citoqueratina anti-IgM e. Como se muestra en la Figura 2A, un importante co-localización se reveló bewteen la IgM y citoqueratina; solamente la infiltración de células B pocos se detectó en estos tejidos como se demuestra por IgM y CD19 doble tinción (Figura S1). Por otra parte, en tiempo real el análisis de PCR demostró que no había correlación entre los niveles de transcritos de IgM y de células B transcripciones específicas CD19 en estos tejidos, ya que expresan niveles más altos de IgM que las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), pero expresaron niveles bastante bajos de CD19 de PBMC (Figura 2B). Todos estos resultados sugieren que la señal de IgM positivo se deriva de las células cancerosas epiteliales.
A, co-localización en cánceres epiteliales humanos de IgM y citoqueratina. cánceres epiteliales humanas, incluyendo el cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de ovario, fueron teñidas con doble IgM anti-humano (rojo), pan-citoqueratina anti-humano (verde), y Hoechest 33342 (azul). La colocalización de IgM y citoqueratina se demostró (amarillo). El cáncer de colon teñidas con TRITC conjugado IgG de cabra anti-ratón y Alexa Fluor® 488 de cabra conjugado con IgG anti-conejo solamente se utilizó como control negativo. B, no hubo correlación entre los niveles de transcritos de IgM y transcripciones CD19 específicos de células B en los cánceres epiteliales humanos. cánceres epiteliales humanas, incluyendo el cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de ovario se sometieron a análisis QRT-PCR de la expresión de IgM y CD19. Se utilizaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) como control positivo para la expresión de IgM y CD19.
IgM se expresa ampliamente en varias líneas celulares de cáncer epitelial humano
Hemos encontrado previamente el expresión de monoclonal, reordenado Ig μ en HeLa S3 y células HT-29 [8]. Para determinar si IgM se expresa ampliamente en células no B, especialmente líneas celulares de cáncer epitelial, se evaluó la expresión de Ig mu e Ig genes kappa en cuatro líneas celulares de cáncer epiteliales humanas (líneas celulares de cáncer cervical HeLa y HeLa MR, de células de cáncer de colon la línea SW480, y la línea celular de cáncer hepático HepG2), una línea celular de osteosarcoma (U-2 OS), y dos líneas celulares embrionarias humanas de riñón (293 y 293T) por RT-PCR. células Raji se utilizaron como control positivo. Los resultados revelaron que Ig mu y kappa de Ig transcripciones se detectaron en todas estas líneas celulares (GenBank nº de acceso FJ197674, Figura 3A). El análisis de secuencia reveló que los κ Ig tenían un patrón de recombinación Vκ4-1 /Jκ3 predominante (datos no mostrados)
.
A, la detección de Ig mu y kappa de Ig transcripciones en múltiples líneas celulares de cáncer por RT- semi-anidada PCR. HeLa y HeLa MR, líneas celulares de cáncer de cuello uterino; SW480, línea celular de cáncer de colon; U-2 OS, línea celular de osteosarcoma; HepG2, línea celular de cáncer hepático; 293 y 293T, las líneas celulares de riñón embrionario humano. Raji, la línea celular de leucemia linfocítica B humana, como control positivo; GAPDH, el control interno. B, citometría de flujo estudio utilizando Ig de ratón anti-humano μ mAb IgM mostraron que fue localizado no sólo en la membrana plasmática, pero también en el citoplasma de las células cancerosas epiteliales, especialmente las células HeLa de RM. línea roja, IgG1 isotipo de control; línea azul, IgM anti-humano. C, análisis de microscopía confocal de células HeLa MR usando ratón anti-humano Ig μ mAb IgM mostró que estaba presente tanto en la membrana celular y en el citoplasma. IgG de ratón, como control de isotipo. D, toda IgM se detectó en las células HeLa por MR no reductor SDS-PAGE (sin β-mercaptoetanol) y transferencia Western con Ig de cabra anti-humano mu anticuerpo policlonal. IgM humana, como control positivo. E, se detectó la expresión de IgM en células HeLa de RM mediante la reducción de SDS-PAGE (con β-mercaptoetanol) y transferencia Western con Ig de ratón anti-humano μ mAb. IgM humana, como control positivo; ß-actina, el control interno. F, IgM también se detectó en el sobrenadante de células HeLa cultural de RM mediante la reducción de SDS-PAGE y transferencia de Western usando ratón anti-humano Ig μ mAb. IgM humana, como control positivo; Medio, como control negativo.
La citometría de flujo análisis reveló la expresión de la membrana citoplasmática y de IgM en células HeLa MR, y poca o ninguna expresión de IgM membranosa con baja expresión de IgM frente al citoplasma de las células HeLa y HepG2 ( Figura 3B). A continuación, la HeLa MR fue elegido como un modelo de células para su posterior análisis. La microscopía confocal confirmó la localización de IgM para estar en la membrana y en el citoplasma (Figura 3C). La reducción y no reductoras Western blot reveló la expresión de IgM en las células, así como el sobrenadante de cultivo de células (Figura 3D-F).
Como uno de los controles más importantes, se encontró que ninguna de las líneas celulares de cáncer evaluadas expresan CD19 de superficie celular Raji excepto que se utilizó como control positivo (Figura S2). Estos resultados excluyen la posibilidad de contaminación de las líneas celulares de cáncer por los linfocitos B.
Expresión de BCR-Complex como en las células cancerosas epiteliales humanas
CD79A y CD79b, dos moléculas específicas de células B, son físicamente vinculado a membranosa IgM en la superficie de las células B, que forma el receptor del antígeno de células B (BCR) complejo. Para resolver si CD79A y CD79b también están vinculados a epitelial IgM derivada de células de cáncer, formando un complejo BCR-como, primero analiza si estas moléculas pueden ser expresadas por estas células. Por RT-PCR y análisis de Western blot, hemos demostrado la expresión de CD79a y CD79b en las células de cáncer epitelial (Figura 4A, B). El uso de células HeLa MR como modelo celular, se confirmó, además, que estas moléculas fueron co-localizada con la IgM membranosa (Figura 4C). Más importante, se observó que antes de la estimulación, el complejo BCR-como se distribuyó uniformemente sobre las células cancerosas epiteliales. Después de la estimulación, el anticuerpo anti-IgM reticulado complejo BCR-como en pequeños y grandes parches (Figura 4C) e indujo un aumento del flujo de calcio (Figura 4D). Por otra parte, el BCR aguas abajo vías de señalización, fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) -Akt y fosfolipasa C (PLC) -γ2-PKC, se activa después de la estimulación con anti-IgM humana (Figura 4E). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que CD79A y CD79b están vinculados a membranosa IgM en la superficie de las células cancerosas epiteliales, formando un complejo BCR-similares, que pueden mediar las señales que conducen a crecimiento y la supervivencia de las células cancerosas epiteliales.
a, RT-PCR mostró que CD79A y CD79b se detectaron en las líneas celulares de cáncer humano, U-2 OS, HT-29, HeLa y HeLa MR, y que había dos isoformas tanto para CD79A y CD79b. Raji, como control positivo; GAPDH, el control interno. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel en 1% de agarosa y se confirmaron adicionalmente por secuenciación del ADN. B, análisis de transferencia Western demostró la presencia de la isoforma más grande de CD79A y CD79b. ß-actina, el control interno. C, análisis de microscopía confocal demostró co-localización (amarillo) CD79a (FITC, verde) e Ig M (PerCP /Cy5.5, rojo) (dos paneles superiores), o CD79b (PE, rojo) e Ig M (FITC, verde) (dos paneles inferiores) en las células HeLa de RM con o sin estimulación con anti-IgM. D, el análisis de flujo de calcio por microscopía confocal en células HeLa MR cargadas con Fluo-3 /AM y se estimularon con anticuerpo de cabra anti-IgM humana (a) o IgG de cabra como controle isotipo (b). Las imágenes fueron capturadas después de la estimulación de 0, 1, 15, 30, 60 y 150 segundos. Se muestra la evolución en el tiempo correspondiente del flujo de calcio. La fluorescencia relativa de las imágenes se estimó con software confocal Leica. Cada línea representa la señal derivada de una sola célula. E, la fosforilación de PKC y Akt aguas abajo de la PLC-γ2 y PI3K vías de señalización, respectivamente, se detectó en las células HeLa de MR después de la estimulación con 20 mg /ml de cabra anti-IgM humana de 5 y 15 minutos, respectivamente.
Análisis de anticuerpos naturales Actividad de cáncer epitelial humano secretada por células IgM
la expresión espontánea de IgM en las células de cáncer epitelial humana sin evidencia de infección u otra estimulación nos instó a detectar si tienen la actividad de IgM natural. Para este propósito, hemos probado la capacidad de HeLa MR derivado de células IgM a reconocer ssDNA, dsDNA, y LPS. Por ELISA, descubrimos que secretada de células HeLa MR IgM reconoce todos estos tres antígenos (Figura 5A-C). Además, este IgM tuvo actividad de los autoanticuerpos y reconoció los autoantígenos bien definidos en el núcleo, el citoplasma, y el citoesqueleto de células HEp-2 (Figura 5D).
A-C, ELISA mostró que IgM secretada en cultivo