Extracto
andographis lineata
es una planta medicinal a base de hierbas se utiliza en la medicina tradicional como un sustituto de
andrographis paniculata
. En este caso, el uso de explantes de hojas maduras de
Un
.
lineata
hemos demostrado por primera vez que la inducción de callo establecido en medio MS que contiene 1,0 mg l
-1 IAA. callo secado se sometió a extracción con disolvente con acetona. Además, el residuo de acetona se separó por cromatografía en columna de gel de sílice, cristalizó y se caracteriza sobre la base de la resonancia magnética nuclear (protón y c13) y espectroscopia de masa de cromatografía líquida. Este análisis reveló la presencia de dos flavonas conocidos a saber, 7-
O
-methylwogonin (MW) y Echioidinin (ED). Además, estos compuestos se ensayaron para determinar su citotoxicidad contra la línea celular leucémica, CEM. Identificamos que la disfunción eréctil y la citotoxicidad inducida MW de una manera tiempo y dependiente de la concentración. Nuevo aumento de la liberación de LDH después del tratamiento con ED y MW confirmó aún más nuestros resultados de citotoxicidad contra la línea de células leucémicas. Sorprendentemente, MW fue más potente que ED cuando se compara mediante ensayos de MTT azul y de tripano. Nuestros resultados recapitulan la utilidad de los cultivos de callo para la producción de plantas específico metabolitos secundarios bioactivos en lugar de utilizar las plantas silvestres. En conjunto, nuestros
in vitro
estudios proporcionan nuevos conocimientos de
Un
.
lineata
callo culturas que sirven como fuente de agentes quimioterapéuticos contra el cáncer
Visto:. Mohammed A, Chiruvella KK, Rao YK, Geethangili M, Raghavan SC, Ghanta RG (2015)
En vitro
Producción de Echioidinin, 7-
O
-Methywogonin a partir del callo Los cultivos de
andographis lineata
y su citotoxicidad en las células cancerosas. PLoS ONE 10 (10): e0141154. doi: 10.1371 /journal.pone.0141154
Editor: Brett Neilan, Universidad de Nueva Gales del Sur, AUSTRALIA
Recibido: 26 de mayo de 2015; Aceptado: 3 de octubre de 2015; Publicado: 21 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Mohammed et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Abreviaturas: MS, Murashige y Skoog; BA, benciladenina; IAA, indol 3 acético; NAA, ácido acético naftaleno; 2,4-D, el ácido 2,4-diclorofenoxiacético; TLC, cromatografía en capa fina; RMN, resonancia magnética nuclear; LC /MS, cromatografía líquida /espectrometría de masas; UV, espectroscopia ultravioleta visible; IR, espectroscopia de infrarrojos; MTT, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio; MW, 7-
O
-methylwogonin; ED, echoidinin; DMF, dimetilformamida; DMSO, dimetilsulfóxido; nm, nanómetros; MHz, hertz Mega
Introducción
Entre todos los tipos de cáncer, la leucemia es considerado uno de los más agresivo que amenaza la vida neoplasias hematológicas con millones de pacientes diagnosticados cada año. La leucemia se encuentra para ser muy sensibles a los agentes quimioterapéuticos [1]. El cribado de productos naturales derivados de plantas medicinales han sido prometedores como fuentes valiosas para los fármacos antitumorales. Productos naturales ejercen potenciales contra el cáncer mediante la inhibición de la proliferación celular y la inducción de apoptosis [2,3]. Los extractos de plantas que exhiben actividad contra el cáncer es una mezcla de todos los compuestos presentes en el extracto en lugar de especial compuesto [4,5]. Se aboga por la búsqueda de compuestos aislados con propiedades farmacológicas bien definidas.
in vitro
culturas que emplean la tecnología de cultivo de tejidos vegetales es ventajoso con respecto a la planta intacta para producir metabolitos secundarios sin destruir hábitat natural [6,7,8]. Esto es debido al hecho de que la tasa de crecimiento celular y la biosíntesis en cultivo iniciado a partir de una pequeña cantidad de material de la planta es bastante alta, un producido considerablemente en un corto período de tiempo. La manipulación de las condiciones de cultivo, fitohormonas es una herramienta valiosa para aumentar el nivel de metabolitos bioactivos [9]. Esto está en contraste con gran número de
in vivo
plantas que se utilizan para obtener una pequeña cantidad de droga.
La producción de compuestos medicinales de origen vegetal es un tema de gran importancia socioeconómica. Esto ha llevado a las industrias, así como a los científicos a considerar el uso de
in vitro
culturas como un suministro alternativo. La producción de productos secundarios de las plantas que crecen por tejidos indiferenciados
in vitro
grandes cantidades hace tiempo se reconoce como un medio en el que se eluden tanto la estacionalidad y la especificidad momento de la producción. cultivos de callos son prometedores para obtener valiosos metabolitos específicos de las plantas explotadas para mejorar el rendimiento de los compuestos bioactivos, para acelerar el ritmo de la conservación y propagación de plantas en un importante etno-medicinales [10]. Estudios anteriores han tenido éxito en la producción de metabolitos secundarios a través de
in vitro Francia culture [11,12,13,14,15,16]. Por ejemplo, prenylated flavanonas como sophoraflavanone G y lehmanin se obtuvieron de
Sophora flavescens
cultivo de callo [17]. El callo de
Hypericum perforatum
yeilded luteolina 6-C-prenil, junto con luteolina-5,3'-dimetil éter, luteolina-5-glucósido y luteolina-3'-glucósido [18]. Es importante destacar que el compuesto contra el cáncer tal como taxol también se obtuvo de cultivos de callos de especies de Taxus [19,20,21]. Sorprendentemente, el contenido de isoflavonas a partir de cultivos de callos de especies Genista eran más de los
in vivo
plantas [22,23].
andographis gratis (Acanthaceae) comprende de 250 géneros y 2500 especies. Entre todos los géneros, andographis
paniculata
es de potencial importancia en la medicina tradicional para el tratamiento de diversas enfermedades debido a su amplio espectro de actividades biológicas [24,25]. Las actividades farmacológicas de
andographis
se deben a la presencia de flavonoides, terpenoides y glucósidos flavonoides como andrographolide, echiodinin y echiodinin 5-
o
-β-D-glucopiranósido. Andrografólido y sus derivados poseen propiedades contra el cáncer potenciales [26]. 7-
O
metil dihydrowogonin, 5-hidroxi-3,7,8,2'-tetrametoxi flavona y flavona 7-
O
-methylwogonin de las raíces de
A
.
paniculata
han sido identificadas [27]. cultivos de callos de
Un
.
fueron reportados paniculata
ser 7-
O
-methylwogonin, solideo flavona I y 5-hidroxi-7,8,2'-trimetoxi flavona [28]. La ocurrencia de 7-
O
-methylwogonin constituye el primer informe de un 2'-deoxyflavone
.
andographis lineata y usados en el presente estudio es una planta medicinal que sirve tribal como buen sustituto para el
Un
.
paniculata
. Del mismo modo esta planta es utilizado por los médicos para tratar las mordeduras de serpientes, diabetes, enfermedades de la piel, fiebre, estreñimiento, bronquitis, cáncer, inflamación y estomacales. También posee antihelmíntico, antiinflamatorias, antipiréticas y antiperiódicas [29,30]. hoja de pasta se utiliza para curar infecciones respiratorias mientras decocción de la raíz como antídoto. Los flavonoides junto con andrographolide se han registrado en los extractos de hojas [31]. Los estudios farmacológicos con extractos de hojas muestran antibacteriano, diurético y hepatoprotector actividades antidiabéticos [32,33,34].
Estudios anteriores con
Un
.
paniculata
han demostrado la utilidad de cultivos de callo para la producción de metabolitos secundarios en lugar de utilizar las plantas silvestres. Esto nos llevó a desarrollar la inducción de callos para
in vitro
la producción de metabolitos secundarios en un período relativamente corto de tiempo al pasar la presión de temporada durante todo el año. Aquí mostramos por primera vez el establecimiento de cultivos de callos a partir de explantes de hojas de
Un
.
lineata
. Se demuestra el aislamiento y caracterización estructural de echioidinin (ED) y 7-
O
-methywogonin (MW) por cromatografía en columna de gel de sílice seguido de resonancia magnética nuclear (protón y c13) y espectroscopia de masas de cromatografía de líquidos. Además se demuestra la citotoxicidad inducida por la DE y MW contra las células leucémicas en un tiempo-y de manera dependiente de la concentración.
Materiales y Métodos
Reactivos y productos químicos
Los productos químicos tales como NAA, 2,4-D, IAA se obtuvieron de Sigma. HgCl
2 era de E.Merck, sacarosa de Sisco, gel de sílice de Acme productos químicos sintéticos y Agar desde CDH, Mumbai, India. DMSO, DMF, acetona, hexano, acetato de etilo y metanol se obtuvieron de Sigma.
material vegetal y Cultivo de Tejidos Condiciones para la inducción de callos
maduro hojas recogidas de las plantas cultivadas en el campo de
.
lineata
se utilizaron como explantes. Las hojas se esterilizaron superficialmente en etanol al 70% durante 30 segundos seguido de un enjuague en agua destilada estéril, después se trataron con 0,1% HgCl
2 (w /v) (Merck) durante 2 min y seguido de lavado en agua destilada estéril. Los extremos cortados de los explantes fueron recortados con cuchillas quirúrgicas estériles borde afilado. Además, los explantes se transfirieron sobre discos de papel de filtro estéril antes de la inoculación. Los medios nutrientes usados en el presente estudio fue Murashige y Skoog, 1962. Los medios de comunicación se congelaron con agar (0,8%), y sacarosa 3% se utilizó como una fuente de hidratos de carbono. El pH del medio se ajustó a 5.6 hasta 5.8 y el medio se hizo finalmente a un volumen conocido. Agar se añadió a los medios de comunicación antes de la dispensación en los recipientes (15 ml de 25 x 150 tubos de ensayo mm), que se trataron en autoclave durante 15 minutos a 15 lbs /in
2. Los tubos de ensayo que contienen medios estériles se colocaron en una posición inclinada con el fin de aumentar el área superficial de los medios de comunicación. Todos los cultivos se incubaron en una sala de cultivo a 25 ± 2 ° C con una humedad relativa de 50 a 60% y 16 h de fotoperiodo a una densidad de flujo de fotones de 15 a 20 μ E m
2 s
-1 de tubos fluorescentes blancos fríos
medio MS con diferentes concentraciones de auxinas (2,4-D, IAA y NAA) que van desde 0,1-1,0 mgl
-. l se utilizaron para estudiar sus efectos sobre la inducción de callos en concentraciones variables (Tabla 1). Posteriormente, el callo bien establecida obtenido en medio MS fortificada con 1,0 mg l
-1 IAA se subcultivó 4-5 veces para la producción óptima de callo a intervalos regulares de 20 días después de la inoculación. Esta técnica de inducción de callo para la producción de metabolitos secundarios ha sido descrito anteriormente por diversos grupos [10,14,23,35].
Extracción, aislamiento e identificación de compuestos purificados de
A
.
lineata
Calli
Los callos adquiridos se secó primero a temperatura ambiente durante unos días y luego el material se tritura hasta obtener un polvo fino (750 g). El polvo obtenido se sometió a extracción con disolvente utilizando acetona caliente en un soxhlet Appartus [10]. la extracción en caliente mejora la solubilidad de solutos de productos naturales y, extrae la mayoría de los metabolitos secundarios. Con el fin de obtener el máximo número de compuestos a partir de
andographis lineata
callos, que utiliza acetona para soxhlation bajo condiciones de calor. Además, el uso de acetona como disolvente de extracción no es extraer los lípidos con la misma eficacia que lo haría para metabolitos secundarios. La evaporación del extracto
a vacío
daba un residuo de color marrón oscuro, extracto de acetona (30 g) (Fig 1B). El extracto de acetona en suspensión en H
2O, se repartió con hexano para dar hexano fracciones soluble e insoluble. Además, se realizó un fraccionamiento hexano, ya que elimina a cabo la clorofila y los constituyentes no polares.
(A) El callo fue inducida a partir de explantes de hojas en medio MS suplementado con 1,0 mg l
-1 IAA (Barra = 2,5 mm) después de 4 semanas. (B) Representación esquemática del análisis fitoquímico de callo de
andographis lineata
para el aislamiento de compuestos bioactivos.
El residuo insoluble en hexano (20 g) se sometió a cromatografía sobre gel de sílice utilizando hexano eluyente gradiente de acetato de etilo, y las fracciones similares se combinaron para producir cuatro sub-fracciones (Fr. I de Fr. IV). Las fracciones II se separó adicionalmente usando una columna de gel de sílice eluyendo con un gradiente de hexano-acetato de etilo para dar un sólido amarillo (24 mg) que fue designado como ALC-1. Esto le dio un color verde con Fe
3+ un color rojo naranja, tanto en Mg-Zn-HCl y HCl. Por otro lado, que se repite CC gel de sílice (5 x 90 cm) de la fracción soluble en hexano con polaridad creciente usando mezclas de acetato de etilo /hexano dio tres sub-fracciones (F1-F3). Fracción F2 se volvió a cromatografiar en una columna de gel de sílice usando hexano /EtOAc (60:40) para proporcionar un sólido blanco (20 mg). Aún más esta en la cristalización a partir de metanol dio agujas incoloras (19 mg). Esto fue designado como ALC-2. Se dio un color verde con cloruro férrico alcohólico y un color rosa con ácido Mg-HCl.
La purificación adicional de las subfracciones de hexano insoluble (P. I, P. III-IV), y hexano soluble (F1 y F3) fracciones no dió ningún principio cristalina. Todos los eluatos que contenían "residuo" o "residuos cero" se examinaron mediante TLC como se describe a continuación mediante pulverización 8% de ácido sulfúrico metanólico. Esto es seguido por calentamiento en una placa caliente a 100 ° C durante 4 min para el desarrollo de color óptimo. Las placas se visualizaron y se calcularon los valores de Rf. A continuación, los compuestos purificados se eluyeron en los sistemas de disolventes correspondientes y los eluidos se conservaron para el análisis espectral.
ultra violeta (UV) espectros se registraron en Beckman 25 y Shimadzu UV-240 espectrofotómetros y los valores fueron dados en nm. Infrarrojos (IR) se registraron en Perkin-Elmer modelo 283B y 297 espectrofotómetros de doble haz y
ν
valores fueron expresados en cm
-1. Resonancia magnética de protones (
1H RMN) se registraron en Varian, 200, JEOL FX-90Q y Bruker-AM-300 espectrofotómetros con TMS como patrón interno. resonancia magnética nuclear (
13C RMN) de carbono-13 se registraron en JEOL FX-90Q espectrofotómetro. Los desplazamientos químicos se dan en ppm δ. Los espectros de masas (MS) se registraron en LC-MSD-Trap-SL (Agilent Technologies) en el Centro Nacional para la espectroscopia de masas en el Instituto Indio de Tecnología Química, Hyderabad.
Cromatografía en capa fina (TLC)
las placas de vidrio de (20 x 20 cm) se lavaron a fondo con agua corriente del grifo y después con agua destilada y las placas se mantiene listo para la aplicación de gel de sílice. El gel de sílice 25 g (ACME) se disolvió en 50 ml de agua bidestilada, se agitó bien y luego la suspensión se hace pasar en el esparcidor. El esparcidor se tiró suavemente a lo largo de las placas, (2-3 mm de espesor) para conseguir una aplicación uniforme. Las placas se activan a 100 ° C durante aproximadamente 45 min, se dejó enfriar, se retiró del horno y se sometieron a utilizar.
Los eluatos se aplicaron en forma de mancha con micropipeta, 2 cm por encima de la base de la placa y se dejaron secar con secador de pelo. A continuación, las placas se revelaron en hexano: acetato de etilo 9: 1 (v /v) y en hexano: acetato de etilo 8: (v /v) 2. El disolvente se dejó subir a 15 cm, a continuación, se separaron, se deja secar. Las placas se rociaron con ácido sulfúrico metanol 8%, allí después se someten a calentamiento en un horno de aire caliente a 100 ° C durante 5 min. A continuación, los compuestos se visualizaron y se calcularon los valores de Rf. placas recubiertas de gel de sílice mismo modo antes de hecho se desarrollan en diferentes sistemas de disolvente con hexano, acetato de etilo y extractos de metanol. Las placas fueron opuestos a los cromatoplacas recibieron el reactivo de pulverización. El contorno de los compuestos fue marcado con una aguja en las placas de gel de sílice sin pulverizar.
Cell Cultura y
línea celular de leucemia humana CEM se adquirió en el Centro Nacional para la Ciencia de la célula, de Pune, India. Las células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 (LAB SERA, EE.UU.) que contiene 10% de FBS (GIBCO BRL, EE.UU.), 100 U de penicilina G /ml y 100 mg de estreptomicina /ml a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. Las células se dividieron en una proporción de 1:10 cada 3-5 días.
Echioidinin (ED) y 7-
O
-methywogonin (MW) que se utiliza en el presente estudio se purifican flavonoides naturales a partir de callos de hoja de
Un
.
lineata
. Los compuestos ED y MW se disolvió en DMF (Sigma, EE.UU.). La concentración máxima de DMF (dimetilformamida) utilizada en los experimentos era igual a 0,05% y la misma cantidad se utilizó como control del vehículo. En todos los experimentos descritos en el presente documento echioidinin y 7-O-methywogonin se añadió 24 h después del cultivo.
viabilidad celular por exclusión con azul de Trypan
ensayo de exclusión de azul
Trypan se realizó para evaluar el efecto de ED y MW en la viabilidad de las células CEM. Aproximadamente 0,75 × 10
5 células /ml se trataron con diferentes concentraciones de ED y MW. Después de 24 h de crecimiento celular, diferentes concentraciones de ED y MW (10, 50, 100, o 250 mM) o vehículo (DMF) se añadieron a las células. Las células fueron retiradas del cultivo después de cada 24 horas y se tiñeron con azul de tripano como se describe [2,36]. El número de células (viables sin mancha y no viables-azul) se contaron usando un hemocitómetro. Cada experimento se realizó tres veces independientes con buena concordancia.
proliferación celular por MTT ensayo
La supervivencia celular se evaluó adicionalmente por 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, ensayo de 5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) reducción del colorante, que se basa en la capacidad de células viables para metabolizar una sal de tetrazolio amarillo a violeta producto de formazano que se puede detectar espectrofotométricamente. células CEM en crecimiento en fase logarítmica fueron tratados con diferentes concentraciones de ED y MW (10, 50, 100, 250 mM) y se incubaron en 5% de CO ambiente
2 con alta humedad. Las células se recogieron después de 48 y 72 horas y se trataron con MTT (0,5 mg /ml) como se ha descrito anteriormente [36,37]. Se midió la absorbancia a 570 nm en un lector de múltiples pocillos de placas de ELISA. La absorbancia media de los controles fue el medio en blanco y se restó. La concentración de compuesto que causa 50% de inhibición del crecimiento celular (IC
50) se estimó después de 72 horas de exposición. La absorbancia de células de control se toma como 100% de viabilidad y los valores de las células tratadas se calculó como un porcentaje del control. Los datos mostrados se obtuvieron a partir de tres lotes independientes de experimentos.
LDH Release ensayo
La liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) es un indicador de integridad de la membrana y por lo tanto, la lesión celular. LDH ensayo se realizó para evaluar la liberación de LDH en el cultivo después de la disfunción eréctil y el tratamiento MW (10, 50, 100 y 250 mM) en células CEM de 48 y 72 horas según los protocolos estándar [37]. La LDH intracelular se determinó después de la lisis de las células por congelación y descongelación rápida. La liberación de LDH se midió a una absorbancia de 490 nm. El porcentaje de liberación de LDH se calculó como: (actividad de LDH en los medios de comunicación) (actividad de LDH en los medios de comunicación + actividad LDH intracelular) /× 100. Cada experimento se realizó tres veces independientes con buena concordancia.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± error estándar. Todos los análisis se realizaron con el software GraphPad usando ANOVA de una vía seguido por prueba de comparación múltiple de Tukey-Kramer. Se consideró estadísticamente significativo en p. & lt; 0,05
Resultados
in vitro de inducción de callo
De Hoja explantes maduro
Hemos establecido cultivos de callos a partir de explantes de hojas maduras en medio MS fortificado con auxinas como NAA, 2,4-D y IAA. La naturaleza del callo varió con la concentración de diferentes auxinas utilizadas (Tabla 1). Blanco, se obtuvo callo blando y friable en medio MS suplementado con 2,4-D (0,1 hasta 0,5 mg l
-1). Se encontró que la frecuencia de formación de callos de color verde claro amarillento, dura, organogénica en términos de crecimiento de la biomasa a ser máxima (75%) en presencia de 1,0 mg l
-1 IAA (figura 1A) después de 4 semanas (Tabla 1).
Sin embargo, 1,0 mg l
-1 NAA y 2,4-D aumentado considerablemente la frecuencia de formación de callo. La edad del explante de hoja era crítico para la continuación de la proliferación de callos. El uso de las hojas más viejas bajó la formación del callo. Se observó la inducción óptima de callo en presencia de 1,0 mg l
-1 IAA y se utilizó para el aislamiento de compuestos bioactivos (Fig 1A). callo organogénica se incrementó en su volumen mediante subcultivo segmentos de callo en medio MS fortificada con 1,0 mg l
-1 IAA por cada veinte días. El callo fue saludable durante todas las subculturas y subcultivos de callos proporcionado cantidad a granel para la extracción de metabolitos secundarios. Como era de esperar, después de la transferencia de los medios de comunicación que contiene una citoquina, BA mostró disparar la respuesta morfogenética (datos no mostrados).
Estructura Identificación de Echioidinin y 7-
O
-methylwogonin
Caracterización y determinación estructural de echioidinin (ED) y 7-
O
-methywogonin (MW) se establecieron principalmente sobre la base de estudios de RMN 1D y de espectro de masas. El compuesto ALC-1 se cristalizó en metanol en forma de cristales de color amarillo (20 mg) con el punto de fusión, 264-265 ° C. Se analizó por su fórmula molecular de C
16H
12O
5 con un peso molecular de 285 [M + H]
+. Era de color púrpura bajo UV y UV /NH
3. Los datos espectrales del compuesto se dan a continuación
UV (S1 A la Fig.):
λ
max (MeOH) (ε log) 265 (4.40), 335 (4,19) nm . IR (Figura S1B):
v
max (KBr) 3416 (-OH), 2980, 1662 (& gt; C = O), 1614, 1504, 1452, 1350, 1245, 1159, 865 , 831 cm
-1.
1 H RMN (figura 2A): (300 MHz, DMSO-
d
6) δ 12,88 (1H, s, 5-OH, intercambiable con D
2O), 10.90 ( 1H, s, 2'-OH, intercambiable con D
2O), 7,90 (1H, dd,
J
= 2,0, 8,0 Hz, H-6 '), 7,40 (dt, 1H,
J
= 2,0, 8,0 Hz, H-4 '), 7,10 (s, 1H, H-3), 6,99-7,05 (m, 2H, H-3', 5 '), 6,75 (d, 1H,
J
= 2,5 Hz, H-8), 6,35 (d, 1H,
J
= 2,5 Hz, H-6), 3,90 (s, 3H, OMe-7) .
13C RMN (figura 2B): (300 MHz, DMSO-
d
6) δ 182,0 (C-4), 165,1 (C-7), 161,4 (C-2), 161.0 (C-5), 157,3 (C-8a), 156,7 (C-2 '), 132,8 (C-4'), 128,4 (C-6 ') 119,3 (C-5'), 117,0 (C-1 '), 116,9 (C-3'), 109,1 (C-3), 104,6 (C-3a), 97,8 (C-6), 92,4 (C-8), 55,9 (OMe-7). LC-MSD (figura 2C):.
m
/
z
= 284 [M]
+, 285 [M + H]
+
(A)
espectros 1H NMR (B)
13C NMR espectros (C) la cromatografía líquida espectros de masas (D) Estructura de echioidinin.
Así, a partir de lo anterior por encima de los estudios espectrales ALC -1 se caracterizó como 5, 2'-dihidroxi-7-metoxiflavona (Echioidinin, ED) (Fig 2D) como sus datos físicos y espectrales estaba en buen acuerdo con valores de la literatura [38].
a continuación, el compuesto ALC-2 se cristalizó en hexano como agujas de color amarillo pálido (20 mg) con punto de fusión, 181-182 ° C. Se analizó por su fórmula molecular de C
17 H
14O
5 con un peso molecular, 298. Era de color púrpura bajo UV y UV /NH
3. Los datos espectrales del compuesto se dan a continuación
UV (S2A Fig.):
λ
max (MeOH) nm (log
ε
) 272 (4,52 ), 345 (3,78) nm. IR (S2B figura):
ν
max (KBr) 3416 (-OH), 29.38 (OMe), 1661 (& gt; C = 0), 1605, 1510, 1447, 1376, 1274 , 1225, 1125, 1030, 970, 833, 767, 686 cm
-1.
1 H RMN (Figura 3A): (300 MHz, DMSO-
d
6) δ 12,65 (1H, s, OH-5), 8,10 (2H, m, H-2 ' , 6 '), 7,61 (3H, m, H-3', 4 ', 5'), 7,01 (1H, s, H-3), 6,60 (1H, s, H-6), 3,98 (3H, s , OMe-7), 3,87 (3H, s, OMe-8).
13C RMN (figura 3B): (300 MHz, DMSO-
d
6) δ 183,5 (C-4), 164,7 (C-2), 160,0 (C-7), 159.4 (C-5), 150,3 (C-8a), 132,8 (C-4 '), 132,3 (C-8), 130,0 (C-1'), 130,1 (C-3 ', 5'), 127,2 ( C-2 ', 6'), 105,8 (C-3), 105,4 (C-4a), 96,7 (C-6), 61,6 (OMe-8), 56,8 (OMe-7). LC-MSD (figura 3C):.
m
/
z =
299,1 [M + H]
+
(A)
1H NMR espectros (B)
13C NMR espectros (C) la cromatografía líquida espectros de masas (D) Estructura de 7-
O
metil wogonin.
Así, desde los estudios espectrales anteriores, la estructura de ALC-2 fue identificado como 5-hidroxi-7, 8-dimetoxiflavona (7-
O
-methylwogonin) (Fig 3D) y también fue confirmada por comparación de valores de la literatura [39].
Echioidinin (ED) y 7-
O
-Methylwogonin (MW) citotoxicidad inducida en células leucémicas de la dosis y dependiente del tiempo Manner
a continuación, se examinó el efecto citotóxico de ED y MW (Figs 4A y 5A) en la proliferación y la supervivencia de la línea celular leucémica, CEM (leucemia de células T). Tripán azul ensayo fue la primera línea de nuestra investigación, donde CEM se trató con 10, 50, 100 o 250 mM de ED y MW. Las células sin la adición del compuesto sirvió como control. Puesto que el compuesto se disolvió en DMF (dimetilformamida), se utilizaron las células con DMF como control del vehículo. La concentración máxima de DMF usado en los experimentos era igual a 0,05% y la misma cantidad se utilizó como control del vehículo. Después de la adición del compuesto, se contaron las células a intervalos de 24 h hasta que las células de control alcanzado la fase estacionaria. Los resultados mostraron que el crecimiento celular se vio afectada con aumento en el tiempo (figuras 4B y 5B). El efecto fue limitado cuando se usó 10 M ED y MW. Sin embargo, las concentraciones de 100 y 250 mM consecuencia un aumento de la muerte celular (figuras 4B y 5B). El IC
50 de la disfunción eréctil y MW fue de aproximadamente 100 mM, a las 72 h de tratamiento.
(A) Estructura de la disfunción eréctil. (B) Evaluación de la viabilidad celular usando el ensayo de azul de tripano después de 10, 50, 100 y 250 mM de ED o tratamiento DMF (control). Las células fueron cosechadas, manchado azul de tripano y se contaron cada 24 h hasta que alcanzó la fase estacionaria. (C) Determinación de la viabilidad celular mediante el ensayo de MTT% en células CEM. Las células se cultivaron con 10, 50, 100 y 250 mM de ED o control del vehículo para 24, 48 y 72 h. El% de viabilidad celular se calcula considerando DMF células tratado como 100% y se representó con representación de las barras de error. (D) La medición de la liberación de LDH después del tratamiento con la disfunción eréctil. Después de la exposición de las células CEM con ED a diferentes concentraciones (10, 50, 100 y 250 mM) de 24, 48 y 72 h, se midió la liberación de LDH en 490 nm. Los resultados se presentan como porcentaje de liberación de LDH. Cada experimento se realizó tres veces independientes con buena concordancia.
Estructura
(A) de PM. (B) Evaluación de la viabilidad celular usando el ensayo de azul de tripano después de 10, 50, 100 y 250 mM de MW o DMF tratamiento (control del vehículo). Las células fueron cosechadas, manchado azul de tripano y se contaron cada 24 h hasta que alcanzó la fase estacionaria. (C) Determinación de la viabilidad celular mediante el ensayo de MTT% en células CEM. Las células se cultivaron con 10, 50, 100 y 250 mM de control del vehículo MWor para 24, 48 y 72 h. El% de viabilidad celular se calcula considerando DMF células tratado como 100% y se representó con representación de las barras de error. (D) La medición de la liberación de LDH después del tratamiento con MW. Después de la exposición de las células CEM con MW a diferentes concentraciones (10, 50, 100 y 250 mM) de 24, 48 y 72 h, se midió la liberación de LDH en 490 nm. Los resultados se presentan como porcentaje de liberación de LDH. Cada experimento se realizó tres veces independientes con buena concordancia.
La citotoxicidad inducida por ED y MW sobre la proliferación de las células leucémicas fue verificado mediante el ensayo de MTT. células CEM tratadas con 10, 50, 100 y 250 mM de ED y MW se recogieron después de 24, 48 o 72 h y se sometieron a ensayo de MTT (Figs 4C y 5C). Los resultados mostraron que la viabilidad celular se vio afectada por tratamiento con ED y MW a 100 y 250 mM, especialmente después de 72 h. Estos resultados sugieren además que ED y MW inducen la citotoxicidad
.
Además, el ensayo de LDH se llevó a cabo para determinar la integridad celular después ED y tratamiento MW (10, 50, 100 y 250 mM). Los resultados mostraron un aumento de la concentración y dependiente del tiempo en la liberación de LDH después del tratamiento con ED y MW, además de confirmar los resultados anteriores (figuras 4D y 5D). En general, nuestros resultados sugieren que la disfunción eréctil y MW fueron capaces de inducir la citotoxicidad en la línea celular de cáncer.
Discusión
Ha habido un interés creciente para identificar productos vegetales como agentes terapéuticos que pueden interferir con la eficacia proliferación de células cancerosas. Una planta medicinal sorprendente en este registro es
Un
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lineata
con una amplia gama de efectos farmacológicos. En el presente estudio, en primer lugar, se describe el establecimiento de cultivos de callos a partir de explantes de hojas maduras. En segundo lugar, se demuestra el aislamiento y caracterización estructural de echioidinin, 7-
O
-methywogonin de cultivos de callos. En tercer lugar, la utilización de ensayos basados en células que mostramos tratamiento de echiodinin, 7-
O
-methywogonin en células de leucemia abolió su proliferación celular. Las conclusiones extraídas anteriormente se basan en varios análisis diferentes, como se describe en nuestro documento. Estos resultados son importantes debido a las realizaciones de los seres humanos como la búsqueda de nuevos compuestos farmacológicamente activos de las plantas ha llevado al descubrimiento de muchos fármacos clínicamente útiles.
Varias líneas de evidencia sugiere que en el pasado los reguladores del crecimiento vegetal papel estimulando la biosíntesis de metabolitos secundarios importantes medicinalmente en planta
in vitro
cultivos de tejidos [10,22,35,40]. Tal producción de metabolitos secundarios
in vitro
se basa en la premisa de que el producto valioso producido en la naturaleza en cualquier órgano u otro tejido de una planta puede ser estimulado a acumularse en células indiferenciadas. Tales cultivos de callos son capaces de producir metabolitos en cantidades muy por encima del límite de detección, dependiendo de medio nutriente, la concentración de sacarosa, la edad de la línea de callos y células. Wewetzer [40] informó de que la diferenciación morfológica no es un requisito previo para la producción de azadiractina; Sin embargo se detectaron las mayores concentraciones en las células completamente diferenciadas. Se presenta por primera vez IAA acumulación de los flavonoides en el cultivo de callo de
Un
.
lineata
. Recientemente, se ha informado de la influencia de IAA en el aumento del contenido de isoflavonas en cultivos de callos de
Genista tinctoria
junto con citoquinina [22]. Aún más nuestra observación de las manchas verdes sobre el callo indican la alta tasa de crecimiento del callo así la capacidad de producir brotes de callo. Los investigadores han tenido éxito en la producción de varios fitoquímicos secundarias valiosas en cultivos de callos no organizados [14,35,41,42,43,44,45].
En el presente estudio, una investigación sistemática de las fitoquímico
A
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lineata
callo culturas conducen al aislamiento y caracterización de dos compuestos: 5, 2'-dihidroxi-7-metoxiflavona (echioidinin) y 7-
O
-methylwogonin. El aislamiento de los flavonoides de 2'-oxigenados, que ocurren raramente en la naturaleza, de
Un
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