Extracto
infiltración de macrófagos es un factor pronóstico negativo para la mayoría de los cánceres gastrointestinales, pero los tumores parecen ser una excepción. El efecto de los macrófagos en la progresión del cáncer depende de su fenotipo, que puede variar entre M1 (pro-inflamatoria, defensiva) a M2 (tolerogénico, pro-tumoral). cánceres gastrointestinales menudo se convierten en una fuente ectópica de gastrinas y macrófagos receptores presentes para estos péptidos. El objetivo del presente estudio es analizar si gastrina pueden afectar el patrón de infiltración de macrófagos en tumores colorrectales. Hemos evaluado la relación entre la expresión de la gastrina y el patrón de la infiltración de macrófagos en las muestras de cáncer colorrectal y la influencia de estos péptidos en el fenotipo de los macrófagos diferenciados a partir de monocitos periféricos humanos in vitro. El número total de macrófagos (células CD68 +) fue similar en tejido circundante tumoral y normal, pero el número de macrófagos M2 (células CD206 +) era significativamente mayor en el tumor. Sin embargo, el número de estos macrófagos asociados al tumor M2 correlaciona negativamente con la inmunoreactividad para gastrina péptidos en las células epiteliales tumorales. Los macrófagos diferenciados a partir de monocitos periféricos humanos en presencia de progastrina mostraron niveles más bajos de M2-marcadores (CD206, IL10) con cantidades normales de M1-marcadores (CD86, IL12). Progastrina induce efectos similares en los macrófagos maduros tratados con IL-4 para obtener un fenotipo-M2 o con LPS más IFN para generar M1-macrófagos. Los macrófagos diferenciados en presencia de progastrina presentan una expresión reducida de ligandos Wnt y la disminución de la cantidad y el aumento de la muerte celular de las células epiteliales de cáncer colorrectal co-cultivadas. Nuestros resultados sugieren que progastrina inhibe la adquisición de un fenotipo M2-en los macrófagos humanos. Este efecto se ejerce sobre los macrófagos asociados al tumor puede modular la progresión del cáncer y debe ser tenido en cuenta a la hora de analizar el valor terapéutico de la inmunoneutralización gastrina
Visto:. Hernández C, Barrachina MD, Cosin-Roger J, Ortiz-D Masiá, Álvarez A, Terradez L, et al. (2014) progastrina reprime la activación alternativa de macrófagos humanos y modula su influencia en Colon Las células de cáncer epitelial. PLoS ONE 9 (6): e98458. doi: 10.1371 /journal.pone.0098458
Editor: José Najbauer, Universidad de la Escuela Médica de Pécs, Hungría
Recibido: 4 de diciembre de 2013; Aceptado: May 4, 2014; Publicado: 5 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Hernández et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación y Ciencia /FEDER [número de concesión SAF2007-064201], Ministerio de Ciencia e Innovacion [los números de subvención SAF2010-20231, SAF2010-16030 y RYC-2011 a 09.571], Ministerio de Sanidad y Consumo [número de concesión PI11 /00327], CIBERehd [número de concesión CB06 /04/0071] y la Generalitat Valenciana [número de concesión PROMETEO /2010/060]. Carlos Hernández reconoce el apoyo del programa "Ramón y Cajal" del Ministerio de Ciencia e Innovación de España (RYC-2011 hasta 09571). Jesús Cosin-Roger es apoyado por becas FPU del Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los macrófagos son un componente significativo de los tumores y muestran una variedad de funciones dependiendo del entorno local. Pueden ser pro-inflamatoria y ayudar a generar respuestas inmunitarias adaptativas (macrófagos activados clásicamente, M1) o anti-inflamatorias (macrófagos activados alternativamente, M2) tolerogénicas /[1], [2]. Tumor asociado-macrófagos (TAM) a menudo se parecen a M2-macrófagos y, por lo tanto, en lugar de luchar contra las células cancerosas, estos leucocitos promueven el crecimiento del tumor al reducir la respuesta inmune y a través de la secreción de factores de crecimiento y factores angiogénicos, así como las enzimas necesarias para la célula invasión. Como consecuencia de ello, la presencia de TAM se ha correlacionado con una disminución de la supervivencia en pacientes con, por ejemplo, melanoma, mama, riñón o cáncer de vejiga. La situación parece ser diferente en algunos procesos cancerosos que afectan el tracto gastrointestinal. En pacientes con colorrectal o cáncer gástrico una mayor infiltración de macrófagos se correlaciona con un mejor pronóstico [3]. Las razones de este papel diferencial de los macrófagos en estas enfermedades particulares está lejos de ser clara, pero a partir de los conocimientos actuales se puede inferir que el microambiente colorrectal /gástrico tumor marca un equilibrio diferente en la función de infiltrados macrófagos M1 y M2, con los macrófagos M2 ejerciendo una oposición defectuoso a los adjuntos M1-fagocitos [4], [5]. Sin embargo, se desconocen los mecanismos responsables de este efecto.
La mayoría de los pólipos adenomatosos, colorrectal y tumores gástricos expresan ectópica del gen de la gastrina. Sin embargo, estas células de cáncer no son de naturaleza endocrina y principalmente sintetizar el precursor de la hormona progastrina [6] - [8], que tiene la acción proliferativa en las células del cáncer [9]. Aunque progastrina pueden unirse con baja afinidad a la gastrina CCK-2 receptores y esta interacción pueden contribuir en cierta medida a su actividad biológica [10], el efecto promotor del crecimiento de progastrina parece estar mediada principalmente por un receptor no convencional identificado recientemente como la anexina II [9]. Hemos observado que la gastrina ejerce una actividad pro-inflamatoria a través de CCK-2 receptores [11] - [13], que se expresa en los macrófagos y las células endoteliales, mientras que la anexina II es altamente expresado en la superficie de los macrófagos, donde sirve como una patógeno elemento de reconocimiento y media la activación de los macrófagos [14].
Nuestra hipótesis es que los péptidos de gastrina de producción local en los tumores de colon pueden influir en la función de los macrófagos infiltrados y, de este modo, modular la respuesta inmune a las enfermedades. Se observó que la expresión de péptidos gástricas en las células de tumor colorrectal se correlaciona con una infiltración reducida de M2-macrófagos y demostramos que progastrina modula el proceso de maduración de los macrófagos humanos in vitro, y reprime la adquisición de un M2-fenotipo. Progastrina también redujo la secreción de ligandos Wnt por M2-macrófagos y el aumento de su capacidad de inducir la apoptosis de las células epiteliales de cáncer de colon.
Métodos
Pacientes
Veintiún resección curativa pacientes con carcinoma colorrectal (Tabla 1) fueron seleccionados al azar de los pacientes operados en el hospital de Manises. Ninguno de ellos tenía preoperatoria de radio /quimioterapia. Inmediatamente después de la resección, una pieza que contiene tumor y el tejido normal circundante se fijó en formalina tamponada y embebidos en parafina. patólogos experimentados documentaron las características histopatológicas de los tumores, incluyendo el estadio del tumor, grado de diferenciación, el tamaño, la linfa /invasión vascular, invasión perineural y la afectación de los ganglios linfáticos. El estadio tumoral se define de acuerdo con el sistema de estadificación TNM. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Manises (Valencia). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes.
Inmunohistoquímica
Las secciones seriadas (4 m) de las muestras que contienen tumor y la mucosa normal de cada paciente se tiñeron para la gastrina, Wnt1, como CD68 un marcador de macrófagos, CD86 como marcador M1-macrófago o CD206 como marcador M2-macrófagos. Las muestras se sometieron a diferentes métodos de recuperación de antígeno según el epítopo (Tabla 2). La actividad peroxidasa endógena fue suprimida por inmersión en peróxido de hidrógeno 0,3%. Una vez bloqueado con suero de caballo al 5%, las secciones se incubaron durante la noche (4 ° C) con el anticuerpo primario correspondiente (Tabla 2). Un anticuerpo biotinilado de caballo anti-ratón /conejo (Vector Laboratories, CA, EE.UU., 1:200) se utilizó como anticuerpo secundario. La élite VECTASTAIN ABC Kit de sistema (Vector Laboratories, CA, USA), seguido por el sistema de sustrato líquido DAB mejorada para inmunohistoquímica (Sigma-Aldrich, Missouri, EE.UU.) se utilizaron para el desarrollo. Todos los tejidos se contratiñeron con hematoxilina y la especificidad de la inmunotinción se confirmó si las secciones de tejido análogos mostraron una ausencia de tinción después de usar inmunoglobulina no inmune del mismo isotipo y a la misma concentración que el anticuerpo primario o después de omitir el anticuerpo secundario.
Un área representativa (objetivo 40X, 6 campos, 0,22 mm
2) a partir de tejido tumoral o tejido glandular normal adyacente fue seleccionado para el análisis cuantitativo de la infiltración de macrófagos. tinción de gastrina en cada muestra se evaluó y se le asignó una puntuación de intensidad de 1 a 4. Sólo el cáncer de células epiteliales reaccionaron con el anticuerpo de la gastrina y la intensidad de la tinción fue muy homogénea a través de todo el compartimento de tumor epitelial. Todas las muestras se procesaron en paralelo y un observador, no el número de pacientes y diferente de la persona que procesa y analiza los immunostainings macrófagos, asignó una puntuación a cada paciente en función de la intensidad de la tinción observada en tres cuadros representativos de las diferentes partes de la tumor.
cultivo de células
células mononucleares de sangre periférica humana fueron aisladas de donantes sanos por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll. Los monocitos se sembraron en placas de cultivo de tejido y maduraron a los macrófagos mediante el cultivo en X-Vivo 15 medio (BioWhittaker) suplementado con suero humano 1% y 20 ng /nl de M-CSF humano recombinante (Peprotech) a 37 ° C en 5% CO
2 hasta 6 días. Con el fin de obtener una polarización M1, las células se incubaron con LPS 1 mg /ml (a partir de Escherichia coli 0111: B4, Sigma-Aldrich) más 20 ng /IFN recombinante humano ml (Peprotech) para las últimas 24 horas. M2 polarización se obtuvo por tratamiento de las células con 20 ng /ml de IL-4 recombinante humana (Peprotech) durante los últimos 48 horas del periodo de cultivo. El proceso de maduración, así como los tratamientos de activación se llevaron a cabo en presencia o ausencia de diferentes concentraciones de progastrina (10
-11-10
-7M, Abgent).
células Caco-2 (American Type Culture Collection, VA, EE.UU.) se cultivaron en medio MEM (Sigma-Aldrich), complementado con 20% suero bovino fetal inactivado, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, mM de sodio 100 piruvato y 1% de aminoácidos no esenciales.
Caco-2 células fueron co-cultivadas con macrófagos derivados de monocitos utilizando insertos Transwell (Corning Incorporated, MA, EE.UU.) con una membrana porosa de 0,4 micras [12] . Los monocitos se sembraron en estos insertos y diferenciados a los macrófagos en la presencia o ausencia de diferentes concentraciones de progastrina. En el día 6 después de la siembra, los insertos se colocaron en la parte superior de células Caco-2 (t = 0) y se mantuvieron en co-cultivo durante 24 horas.
La presencia de la moléculas de superficie CD86 (M1) y CD206 (M2) en macrófagos cultivados se analizó mediante microscopía de fluorescencia (microscopio IX81, Olympus, Hamburgo, Alemania). Los macrófagos se incubaron con Hoescht para identificar los núcleos y con anticuerpos marcados con fluorescencia contra estos objetivos (Tabla 2). La fluorescencia se analiza con el software ScanR citometría estática (& gt; 5000 células /pocillo). .La Concentración de las citocinas IL12 (Th1) e IL10 (Th2, antiinflamatorio) en sobrenadantes de células se determinó por ELISA (Diaclone)
El número de células Caco-2 después de co-cultivo se contó en una cámara de NEWBAUER. La apoptosis en estas células fue estudiada por citometría de flujo como Anexina V bivariante /análisis PI (Kit de detección de apoptosis, Abcam).
ARN total a partir de macrófagos o células Caco-2 se aisló utilizando el kit de extracción (Illustra RNAspin Mini , GE Healthcare Life Science) y el ADNc se obtuvo con el Primer Guión RT kit de reactivos (Takara Biotecnología). PCR en tiempo real se realizó con el Prime escritura Reactivo Kit Perfect Tiempo real (Takara Biotecnología) en un LightCycler termo ciclador (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). oligonucleótidos específicos fueron diseñados de acuerdo a las secuencias que se muestran en la Tabla 3. la expresión génica relativa se expresó como se describe anteriormente [15].
El análisis estadístico
Los datos se expresan como media ± E.E.M. y se compararon por análisis de varianza (ANOVA de una manera-) con una corrección post-hoc de Newman-Keuls para comparaciones múltiples o una prueba t cuando proceda. Un valor de P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Las correlaciones clínicas en humanos muestras se analizaron mediante el coeficiente de correlación de Pearson.
Resultados
número de macrófagos M2 se incrementa en la zona tumoral
En primer lugar, analizamos la cantidad y el fenotipo de macrófagos en las zonas no tumorales y tumorales de pacientes con cáncer colorrectal. La inmunohistoquímica para CD68 (marcador de macrófagos), CD86 (M1 marcador de macrófagos) y CD206 (M2 macrófagos marcador) se llevó a cabo en muestras de biopsia de resecciones carcinoma colorrectal. De nota, el número de macrófagos fue similar en el tumor y el tejido normal circundante, pero el número de M1 y M2 macrófagos fue significativamente diferente entre las dos áreas (Figura 1). estroma tumoral contenía un menor número de células que lámina propia del tejido normal CD86 (+). En contraste, se encontró un mayor número de células CD206 (+) en el tejido tumoral en comparación con el tejido normal circundante, lo que sugiere que el desarrollo de tumores favorece la diferenciación de los monocitos a macrófagos M2.
La inmunorreactividad a CD68 (marcador de MF, a-B), CD86 (M1-MF marcador, C-D) y CD206 (marcador de M2-MF, e-F) se analizó en el cáncer colorrectal (B, D, F) y mucosa circundante sanos (a, C, e ). (G) Análisis cuantitativo de células positivas para estas moléculas en un área representativa de 0,22 mm
2 (Escala bar = 0,2 mm). Barras representan la media ± SEM (n = 21). ** P & lt; 0,01 y *** P & lt;. 0.001 vs valor correspondiente en mucosa normal
expresión gastrina se incrementa en el tumor pero se correlaciona negativamente con el número de macrófagos M2
Busca mediadores que podrían modular el fenotipo de los macrófagos en el tumor se estudió el papel de la gastrina péptidos sobre la expresión de diferentes marcadores de macrófagos en las muestras de biopsia. Puesto que el anticuerpo gastrina usado en este estudio reconoce ambos precursores de gastrina y gastrina, como progastrina, no podemos discriminar entre diferentes péptidos de gastrina, pero se observó una amplia inmunorreactividad en células tumorales epiteliales de biopsias analizadas. La tinción en cada muestra se evaluó y una puntuación de intensidad de 1 a 4 fue asignado (Figura 2A). No se observó ninguna correlación entre los niveles de gastrina en los tumores y el número de totales (células CD68 +) o M1 (células CD86 +) macrófagos ya sea en el tumor o en el tejido normal (Figuras 2B y 2C). Sorprendentemente, el número de macrófagos en el tejido M2 tumoral y normal negativamente correlacionada con la expresión de gastrina. Esta correlación fue más significativo en el tumor, donde se sintetiza el péptido. Tomados en conjunto estos datos sugieren que la gastrina péptidos sintetizados por las células tumorales reduce el número de macrófagos M2, sin afectar el número total de macrófagos.
El número de macrófagos totales (células CD68 +, B), M1-macrófagos (CD86 + células, C), y M2-macrófagos (células CD206, d), en el tumor y el tejido normal circundante se analizaron en relación con gastrina expresión en tejido tumoral (a, la puntuación de 1 a 4, la barra de escala = 0,2 mm). Se observa una correlación negativa y significativa entre la intensidad de la tinción de la gastrina y el número de M2-macrófagos en la mucosa normal y tejido tumoral (D).
progastrina disminuye la diferenciación de macrófagos hacia un fenotipo M2
la hipótesis de que progastrina podría ser responsable de los efectos observados en el fenotipo de los macrófagos, las células de cáncer de colon porque carecen de las enzimas necesarias para la maduración completa de gastrina [7]. Para investigar si progastrina puede modular la diferenciación de los macrófagos a un M1-M2-fenotipo o se trataron los monocitos periféricos humanos obtenidos de voluntarios sanos con varias concentraciones de progastrina y los dejó a diferenciarse. experimentos de citometría estáticas realizados con anticuerpos fluorescentes específicos mostraron que progastrina redujo la expresión de la CD206 M2-marcador en los macrófagos derivados de los monocitos, incluso a la concentración más baja analizada. En contraste, no se detectaron cambios en la expresión de la CD86 M1-marcador. Además, se midió la concentración de IL-12 e IL-10 en el sobrenadante de los macrófagos derivados de los monocitos después de 6 días de diferenciación en presencia de dosis crecientes de progastrina. El precursor de la gastrina provocó una reducción significativa de la secreción de IL-10 pero no alteró los niveles de IL-12 (Figura 3). Nuestros datos indican que progastrina inhibe la expresión de M2-marcadores durante la diferenciación de los macrófagos sin afectar a la expresión de M1-marcadores.
monocitos periféricos humanos se derivan de los macrófagos en la presencia o ausencia de progastrina y el fenotipo de la resultante macrófagos evaluados mediante el análisis de los siguientes parámetros: la expresión de CD86 (A, C, n = 3); expresión de CD206 (B, D, n = 3); secreción de IL12 (F, n = 4); y la secreción de IL10 (G, n = 4). Las barras representan la media ± SEM. * P & lt; 0,05 y ** P & lt;. 0,01 vs valor en las células tratadas con vehículo correspondiente
Con el fin de estudiar el efecto de progastrina en la diferenciación mediada por IL-4 de los macrófagos M2 hacia un fenotipo que se incubaron completamente diferenciadas macrófagos derivados de monocitos con IL-4 y diferentes dosis de progastrina durante dos días. macrófagos basales tratados con IL-4 mostraron un aumento significativo en la expresión de CD206, un aumento no significativo de la IL-12 secreción y similares producción de IL-10 que los controles. Progastrina reduce significativamente la inducción de CD206 por la IL-4 y el aumento de IL-12 secreción a niveles significativamente más altos que los observados en las células de control, mientras que la secreción de IL-10 se mantuvo sin cambios. Sin embargo, la diferenciación de los macrófagos hacia una M1-fenotipo no fue afectada por progastrina. El tratamiento con LPS más IFN aumentó la expresión de CD86, y la secreción de IL12 e IL10 tanto en los macrófagos, pero no modificó progastrina cualquiera de estos parámetros (Figura 4).
macrófagos derivados de monocitos humanos fueron estimulados con LPS más IFN para obtener un M1-fenotipo o con IL4 para obtener M2-macrófagos en la presencia o ausencia de progastrina, y el fenotipo resultante evaluado mediante el análisis de los siguientes parámetros: la expresión de CD86 (a, n = 3); expresión de CD206 (B, n = 5); secreción de IL10 (C, D, n = 5); y la secreción de IL12 (E, F, n = 5). Las barras representan la media ± SEM. * P & lt; 0,05 vs valor en las células tratadas con vehículo correspondiente;
+ P & lt; 0,05 y
++ P & lt;. 0,01 vs valor correspondiente en células de control
progastrina regula a la baja ligandos Wnt en los macrófagos y aumenta la muerte celular en células Caco2 co-cultivadas
a continuación se analizó si la modulación del fenotipo de los macrófagos por progastrina podría afectar a las células tumorales circundantes. Recientemente hemos informado de que M2-macrófagos sintetizan y secretan ligandos Wnt que pueden modular co-cultivadas comportamiento de las células epiteliales [16] y en el presente estudio se observó inmunoreactividad para Wnt1 en las células del estroma tumoral. Evaluación cualitativa de la expresión de este ligando Wnt indica que la cantidad de células positivas disminuye a medida que la producción de gastrina en cáncer de células aumenta (Figura 5A). Una relación causal entre ambos factores se señala por nuestros estudios in vitro que muestran que los macrófagos madurados en presencia de progastrina presentar una expresión mRNA significativamente reducido de tres ligandos Wnt diferentes (Wnt1, Wnt3a, y Wnt5, las figuras 5B-5D). relevancia funcional de la regulación a la baja de los tres ligandos Wnt en los macrófagos se demuestra por el hecho de que las células Caco2 co-cultivadas con los macrófagos tratados con progastrina expresaron menos mRNA LGR5 que las células Caco2 co-cultivadas con los macrófagos de control (Figura 5E). Estos datos indican que los efectos de progastrina en ligandos Wnt macrófagos derivados de modular la vía de señalización Wnt en células tumorales circundantes.
inmunorreactividad a Wnt1 en el estroma del cáncer colorrectal en relación con la expresión de la gastrina en el mismo tejido (barra de escala = 0,2 mm) (A); y los efectos de la presencia de progastrina durante la diferenciación de los monocitos periféricos humanos a los macrófagos en la expresión de mRNA de los tres ligandos Wnt diferentes en estos macrófagos (B-D, n = 5) y la expresión de ARNm de LGR5 en co-cultivaron células Caco-2 (E , n = 7). Las barras representan la media ± SEM. * P & lt; 0,05 y ** P & lt;. 0,01 vs valor en las células tratadas con vehículo correspondiente
Además, co-cultivo de Caco-2 con los macrófagos tratados con progastrina resultó en una reducción significativa en el total número de células epiteliales junto con una mayor tasa de apoptosis (Figura 6).
los efectos de macrófagos derivados de monocitos humanos obtenidos en presencia o ausencia de progastrina en el número (a) y la tasa de apoptosis ( B) de células Caco-2 se analizaron en un sistema de co-cultivo (24 h, n = 4). Las barras representan la media ± SEM. * P & lt; 0,05 frente al valor en los macrófagos tratados con vehículo,
+ P & lt correspondiente; 0,05 y
++ P & lt; 0,01 frente a las células incubadas con una inserción vacía (w /o MF) guía empresas
Discusión
Este estudio demuestra que los macrófagos que infiltran los tumores colorrectales tienen un perfil fenotípico diferente de los que están presentes en el tejido normal que rodea la lesión cancerosa, con una mayor proporción de los antiinflamatorios M2-macrófagos y significativamente los números más bajos de clásicamente activados M1-macrófagos. Curiosamente, nuestros resultados indican que la expresión de gastrina en el tejido tumoral ejerce una influencia negativa en el número de tumorales M2-macrófagos.
La expresión de la gastrina en las células epiteliales tumorales se correlaciona negativamente con el número de tumorales M2-macrófagos y nuestra in vitro resultados sugieren una relación causal entre ambos factores. macrófagos humanos obtenidos mediante el cultivo de monocitos periféricos en presencia de progastrina mostraron una expresión reducida de CD206. Además, este péptido impidió significativamente la expresión de CD206 cuando los macrófagos maduros se estimularon con la IL4 de citoquinas Th2 para inducir una M2-fenotipo. Por el contrario, progastrina no afectó a la expresión de la molécula co-estimuladora CD86, ya sea en condiciones de reposo o en los macrófagos estimulados con LPS más IFN para desarrollar un M1-fenotipo. Progastrina también afecta el patrón de secreción de citoquinas. Los macrófagos madurados en la presencia de este péptido liberado cantidades más bajas de la IL10 citoquina antiinflamatoria manteniendo al mismo tiempo la liberación normal de la Th1 inductor IL12. En los macrófagos de IL-4 estimulada, los efectos sobre la secreción de citocinas eran diferentes, pero en la misma dirección. En este caso, la liberación de IL10 no fue afectada, mientras que el péptido facilita la secreción de IL12. Así, es esperable que los macrófagos que se encuentran bajo la influencia de progastrina en el tejido canceroso presentan un anti-inflamatorio, inmunosupresor perfil romo.
Este efecto está en línea con la acción proinflamatoria anteriormente descrito de la gastrina [11 ] - [13]. Hemos observado que la gastrina contribuye a la inflamación inducida por Helicobacter pylori en ratas, probablemente a través de la activación del receptor CCK-2 en los macrófagos, mientras que la estimulación de este receptor activa las células endoteliales humanas para promover la adhesión de los monocitos. CCK-2 receptores se pueden unir todos los péptidos de gastrina, aunque su afinidad por gastrina madura es significativamente mayor que la demostrada por progastrina. Las acciones de estos últimos se pueden transmitir alternativamente por el recientemente caracterizado receptor no convencional anexina-II [9]. Ambos tipos de receptores están presentes en los macrófagos y las dos vías de promover la activación de los macrófagos [14]. Por lo tanto, los presentes resultados refuerzan la idea de que los péptidos de gastrina tienden a contribuir a la inflamación, aunque diferente mecanismo puede estar implicado en cada caso.
La influencia de los macrófagos en la progresión del cáncer se debe a su efecto sobre la respuesta inmune contra el tumor, sino también a un efecto local directo en las células cancerosas epiteliales circundantes. Los macrófagos pueden ser una fuente de ligandos Wnt [17], la vía oncogénico activado en la mayoría de los cánceres colorrectales y un contribuyente importante a stemness de células de cáncer [18], [19]. La secreción de estos factores es especialmente relevante en una subpoblación de TAM que parecen desempeñar un papel particular en la invasividad tumoral mediante la promoción de la angiogénesis y la migración de las células tumorales a través de la señalización de Wnt-[20], [21]. Wnt1 se detectó en las células del estroma tumoral y su presencia tiende a disminuir, como el nivel de gastrina en el tumor aumentado. Hemos observado recientemente que la secreción de ligandos Wnt se aumenta específicamente en los macrófagos M2, que promueven la vía de señalización Wnt /β-catenina y la actividad proliferativa consiguiente en co-cultivaron células de cáncer de colon [16]. Nuestros resultados actuales muestran que los macrófagos madurados en presencia de progastrina expresan cantidades menores de tres ligandos Wnt diferentes y provocan una reducción significativa en el número de co-cultivaron células Caco-2. Este efecto se produce con una disminución concomitante en la expresión en estas células colónicas de LGR5, un objetivo de genes Wnt [22] que potencia Wnt /β-catenina de señalización [18]. Además, los macrófagos madurados en presencia de progastrina tienden a aumentar la tasa de apoptosis en células Caco-2, un efecto que también puede estar relacionada con la señalización de Wnt reducida [23]. Por lo tanto, los cambios fenotípicos inducidos por progastrina en macrófagos modifican su influencia en las células epiteliales de cáncer de colon que resulta en un número menor de estas células, probablemente por una combinación de reducción de la proliferación y el aumento de la muerte celular apoptótica. Además, la reducción de la producción de ligandos Wnt inducida por progastrina puede contribuir también a los cambios fenotípicos descritos inducidos por este péptido desde un efecto autocrino de Wnt5a en los macrófagos para reducir la expresión de IL12 en respuesta a productos bacterianos se ha descrito [24].
a partir de nuestros resultados podemos inferir que gastrina, mediante la inhibición de la adquisición de un fenotipo-M2 en los macrófagos locales, pueden regular la progresión del cáncer. Está claro que los macrófagos M2 estimulan el crecimiento de células epiteliales de cáncer de colon in vitro y los estudios experimentales demuestran que M2-macrófagos en el tumor promueven el cáncer de colon en ratones [25] - [27]. En los cánceres colorrectales humanos, el efecto de M2-macrófagos parece más complicado y afectada por varios factores como su distribución espacial [4], la cantidad relativa de los macrófagos M1 [5] o la etapa de la enfermedad [4]. A pesar de que su presencia ha sido visto como un factor pronóstico negativo por algunos autores [28], otros sugieren que los macrófagos M2 tienen un efecto menos peligrosos en el cáncer colorrectal humano que en otros entornos y apuntan a la idea de que algún factor local específicamente presente en este tipo de los tumores puede ser la regulación negativa de su tumor promoción de la acción [4], [5], [29]. Teniendo en cuenta que M1 y M2 macrófagos no son clonalmente diferentes conjuntos de células, pero los extremos de un amplio espectro de fenotipos intermedios y que la clasificación de una célula como un macrófago M2 pueden estar sesgados por el marcador molecular seleccionado en cada caso, lanzamos la idea de que los macrófagos identificados como M2 en estos estudios pueden ser menos perjudicial a causa de progastrina.
Una función proliferativa directa de progastrina en las células epiteliales se ha demostrado claramente en las células y ratones aislados, y los estudios experimentales con animales transgénicos sugieren que la sobreexpresión de gastrinas en presencia de agentes que dañan el ADN aumenta la carcinogénesis. Esta evidencia ha llevado a varias estrategias farmacológicas para neutralizar la actividad de los péptidos de gastrina, con resultados exitosos en modelos murinos, pero, por desgracia, pocas e indefinidos resultados en los pacientes [30]. Nuestros hallazgos sugieren que, al menos en los seres humanos, progastrina puede desempeñar un papel de múltiples facetas en la progresión de tumores colorrectales, como su actividad proliferativa en las células epiteliales se opondría por una acción potencialmente anti-tumoral que se ejerce sobre los macrófagos. La relevancia de este efecto sobre las células inmunes para la actividad global de progastrina espera la evaluación por la investigación futura.
Conclusiones
Nuestro estudio indica que los péptidos de gastrina sintetizadas por las células de cáncer de colon tienen macrófagos como sus objetivos y probablemente afectará el infiltrado inflamatorio del tumor, que a su vez afecta a la progresión del cáncer. La inhibición de la M2-polarización inducida por progastrina contrarrestaría su actividad proliferativa y, aunque es difícil estimar la magnitud de este efecto, esta observación debe tenerse en cuenta al analizar el valor terapéutico de la gastrina inmunoneutralización [31].
Reconocimientos
agradecemos a Brian Normanly para su edición de idioma Inglés y el Servicio de Hematología del hospital Clínico Universitario de Valencia para la extracción de muestras de sangre.