Extracto
Cáncer (CSC) son un pequeño subconjunto de células cancerosas capaces de auto-renovación y el tumor mantenimiento. La erradicación de las células madre del cáncer, la raíz de origen tumoral y la recurrencia, ha emergido como una estrategia prometedora para mejorar la supervivencia del cáncer de pulmón. se informan células madre de cáncer de residir en la población lateral (SP) de las células de cáncer de pulmón cultivadas. Presentamos aquí la coexistencia de una población distinta de células no-SP (PNA) que tienen la capacidad de auto-renovación equivalente en comparación con células SP en un ensayo esfera tumor de pulmón. En comparación con las células correspondientes en cultivos en monocapa, esferas de tumores de pulmón, formados a partir de no pequeñas de pulmón de células líneas celulares de carcinoma humano A549 o H1299, mostraron marcadas diferencias morfológicas y aumento de la expresión de los marcadores de células madre CD133 y Oct3 /4. esferas de tumores de pulmón también exhiben una mayor potencial tumorigénico, ya que sólo se requieren células esfera tumor 10000 pulmonares para producir tumores xenoinjertos en ratones desnudos, mientras que el mismo número de células en monocapa no inducir tumores. También demostramos que las esferas de tumores de pulmón mostraron una disminución de la actividad del proteasoma 26S en comparación con monocapa. Mediante el uso de la ZsGreen-CODC (secuencia C-terminal que dirige la degradación de ornitina descarboxilasa) reportero de ensayo en las líneas celulares de NSCLC, sólo menos del 1% cultivos monocapa fueron ZsGreen positivo que indica bajo proteasoma 26S, mientras que de pulmón esfera tumor mostró números aumentó de ZsGreen- células positivas, lo que sugiere el enriquecimiento de células madre cancerosas en cultivos esfera
Visto:. Pan J, Q Zhang, Wang Y, Usted M (2010) proteasoma 26S actividad es el regulado en el cáncer de pulmón de células madre-al igual que propagan
in vitro
. PLoS ONE 5 (10): e13298. doi: 10.1371 /journal.pone.0013298
Editor: Xinwei Wang, Instituto Nacional del Cáncer, NIH, Estados Unidos de América
Recibido: 18 de abril de 2010; Aceptado: September 17, 2010; Publicado: 11 Octubre 2010
Derechos de Autor © 2010 Pan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por el NIH subvención R01CA134682. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las células madre del cáncer (CSC) son una pequeña reserva de células autosostenibles con la capacidad exclusiva para la auto-renovación y mantenimiento del tumor [1]. Sólo un pequeño subconjunto de células cancerosas dentro de un tumor tiene las características de las células madre, y por lo tanto puede iniciar un tumor cuando se trasplantan [3], [4]. Los CCC putativos en la leucemia mielógena aguda (LMA) fueron aislados por primera vez en 1994 [5]. Con los avances en células activadas por fluorescencia (FACS), y marcadores de superficie celular recientemente identificados como Sca-1 y CD133, CSC pueden aislarse no sólo de cánceres de la sangre, sino también de los tumores sólidos [1].
células madre cancerosas en el carcinoma de mama humano se han identificado como una población rara de CD44
+ /CD24
- /baja /ESA
+ células [6]. 100 de estas células fueron capaces de formar nuevos tumores, mientras que otras células tumorales no lograron formar tumores en ratones SCID. Células madre cancerosas en el seno están identificadas fueron como CD44
+ /CD24
- /Oct-4
+ por Ponti
et al
. en 2005 [7]. Células madre cancerosas en el cáncer de colon se han encontrado para ser una menos del 2,5% de la población con la expresión positiva CD133 [8], y recientemente se definen como CD44
+ /CD166
+ /ESA
+ [9]. Las células madre broncoalveolar (BASCs) han sido recientemente identificados como la población de células madre putativa para el adenocarcinoma de pulmón, y podrían ser aislado como CD45
-
/PECAM - /Sca-1
+ /CD34
+ células por FACS [10]. Células madre cancerosas en células pequeñas y cáncer de pulmón de células no pequeñas también se informaron como una población rara de indiferenciado CD133
+ células [11]. Estos fueron capaces de auto-renovarse como esferas tumorales en medio libre de suero, y generar los xenoinjertos tumorales fenotípicamente indistinguibles del tumor original, cuando se inyectan en ratones SCID.
Un enfoque alternativo para aislar poblaciones de células madre es a través del enriquecimiento de la población lateral (SP) células [2]. células SP se identifican por la capacidad de flujo de salida de colorante Hoechst, un proceso mediado por la proteína de unión a ATP de resistencia de cáncer de mama casete transportador (BCRP-1) [12]. Desde Goodell
et al
. primero informó de que la SP está enriquecida en células madre hematopoyéticas (HSC) [13], las células SP se han identificado en una variedad de tejidos normales y malignos, incluyendo el pulmón [14]. BCRP-1 ratones deficientes carecido de la SP en la médula ósea todavía no tenía anomalías sustanciales hematopoyéticas [15]. Por lo tanto, la relación funcional precisa entre el fenotipo SP y la función de células madre sigue siendo poco clara. Ambos SP y NSP fracciones de la línea celular de meduloblastoma DAOY eran capaces de reconstituir la población original de los padres, y sólo una ligera enriquecimiento clonogénico se observó en la fracción SP [16]
.
Las células madre hematopoyéticas (HSC) son reportados a residir en la fracción SP de médula ósea de ratón adulto (BM), sin embargo, un informe reciente mostró la coexistencia de las CMH NSP que no difieren significativamente de las CMH SP en número y capacidad de auto-renovación [17]. Además, el CD34
- /lowc-Kit
+ Sca-1
+ linaje marcador
- población celular, que está altamente enriquecida en células madre hematopoyéticas de ratón, se dividió casi por igual en el SP y NSP Células. Estos se encontraban en un estado de reposo y mostraron una cinética del ciclo celular uniforme, independientemente de si estaban en el SP o NSP [17]. Por lo tanto, se requiere una mayor caracterización de la SP en células de cáncer para evaluar plenamente el papel que estas células juegan en el cáncer de pulmón.
Los resultados recientes mostraron que los fármacos quimioterapéuticos, tales como doxorrubicina y cisplatino, podrían inducir a la propagación de las células madre cancerosas
in vitro
[18]. Estas células mantenido su capacidad de auto-renovación como se demuestra por el crecimiento de las esferas tumorales
in vitro
, y tenía un alto potencial después de la inoculación tumorigénico y metastásico en ratones SCID. fármacos quimioterapéuticos, tales como cisplatino y ifosfamida, son también conocidos para deprimir la expresión de subunidades de proteasomal [19], y regular a la baja la ubiquitina-proteasoma dependiente de proteólisis [20]. Se encontró que la actividad del proteasoma 26S reducidos a ser una característica única de los AIC (células que inician el cáncer) en el glioma y cáncer de mama, que se podría utilizar para realizar un seguimiento de los CAC
in vivo
[21]. Sin embargo, Benzyloxicarbonyl-Leu-Leu-Nle-CHO (LLNle), un inhibidor de la γ-secretasa, se informó a matar con eficacia las células iniciadoras de tumores de glioblastoma humano (GBM TIC)
in vitro fotos: por la inhibición del proteosoma 26S . Por lo tanto, se requiere una aclaración adicional de la actividad del proteasoma 26S con el fin de determinar totalmente su papel en la CSC y la terapia contra el cáncer. En última instancia, esto puede ayudar en la identificación de nuevas dianas para la intervención terapéutica futuro.
En el presente estudio, se investigó si las células madre cancerosas de pulmón exclusivamente residen en la población lado y si las esferas de tumores de pulmón con capacidad de auto-renovación de NSCLC líneas celulares podrían ser una fuente para el enriquecimiento de células madre cancerosas de pulmón.
Métodos
Cell Cultura y
NSCLC humano líneas celulares A549 y H1299 se adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA), y se cultivaron en medio RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco) y penicilina y estreptomicina (Gibco cóctel). Células 293 FT se compraron de Invitrogen (Carlsbad, CA), y se cultivaron en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco) con 10% de FBS y penicilina y estreptomicina cóctel. Todas las células se cultivaron en un incubador humidificado a 37 ° C en 5% de CO
2.
La tinción de las células con Hoechst 33342
Los métodos para la identificación de los SP fueron adaptadas de los informes anteriores [ ,,,0],22], [23]. Brevemente, las células fueron trpsinized y se resuspendieron a 1 x 10
6 células /ml en DMEM con alta glucosa, 2% (v /v) FBS, y mM N- 10 (2-hidroxietil) piperazina-N '- (2 ácido etanosulfónico) (HEPES)), se incubaron con 5 mg /ml de colorante Hoechst 33342 (con o sin Fumitremorgina C (MP Biomedicals, Eschwege, Alemania) durante 90 min en un baño de agua C 37 °, y los tubos se invirtieron suavemente cada 20 min para desalentar sedimentación celular y la formación de grumos. Las células se centrifugaron a 375 xg durante 6 min a 4 ° C, y se resuspendieron en un volumen apropiado de solución salina equilibrada de Hank fría (HBSS) con 2% (v /v) de FBS. Las células mantenido a 4 ° C para el resto del experimento. para la discriminación de células muertas, se añadieron 2 g /ml de yoduro de propidio (PI) inmediatamente antes de citometría de flujo. las muestras celulares se analizaron en un MoFlo clasificador de células (Beckman Coulter), y la emisión se recogió a través de un espejo dicroico nm pase largo 610 (DCLP) a un filtro de 620 nm de largo pasa (LP) para la colección rojo Hoechst y un pase 424/44 nm banda (BP) filtrado para la colección azul Hoechst. La población lado "SP" fue identificado como un grupo de células capaces de excluir el colorante Hoechst, una característica abolida con 10 mM Fumitremorgina C de tratamiento [22].
Esfera Formación Ensayo
tumoral
pulmón esferas se aislaron mediante cultivo a baja densidad en condiciones de cultivo libre de suero como se describió anteriormente, lo que permitió la selección de células madre y progenitoras de cáncer indiferenciado, mientras que las células tumorales diferenciada suero dependiente y células accesorias no transformadas se seleccionaron negativamente [8], [11], [24]. células de cáncer de pulmón A549 y H1299 se sembraron a una densidad clonal en medio libre de DMEM-F12 suero suplementado con, mM HEPES 5, bicarbonato de sodio 0,1%, 0,4% de BSA, glutamina y antibióticos (Gibco-Invitrogen), y que contiene 20 ng /ml EGF y 10 ng /ml bFGF. frascos de cultivo de tejido no tratadas se utilizaron para reducir la adherencia celular y el crecimiento de apoyo como esferas tumorales indiferenciadas. El medio se sustituye o complementa con factores de crecimiento fresco dos veces a la semana hasta que las células comenzaron a crecer y formar agregados flotantes. esferas tumorales se recogieron con un colador de 100 micras de células (BD, Bedford, MA), y expandido en enzimática y disociación mecánica, seguido de re-recubrimiento tanto de las células individuales y pequeños agregados residuales en medio fresco completo.
citometría de flujo
para citometría de flujo, esferas tumorales o cultivos en monocapa se disociaron mecánicamente a las células individuales, se lavaron y se incubaron con la dilución adecuada de control o anticuerpo específico. Los anticuerpos utilizados fueron PE conjugado anti-CD133 /1 de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania), conjugado con FITC anti-CD44 (eBioscience, San Diego, CA), y anti-OCT3 /4 (Santa Cruz Biotechology, CA). Para PE conjugado anti-CD133 /1, las células se bloquearon primero con reactivo de bloqueo durante 5 min, a continuación de una incubación de 20 min con el anticuerpo. Para OCT3 /4 expresión, las células se fijaron y se permeabilizaron con FIX & amp; reactivos PERM® (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del la fabricación, y se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón contra Oct3 /4 (Santa Cruz Biotechnology) durante 20 min en la oscuridad, después se lavaron con PBS, las células fueron incubadas en la oscuridad con un anticuerpo secundario conjugado con FITC ( Invitrogen). Como control negativo, las células se tiñeron con el control de isótopo apropiado. Para FITC conjugado anti-CD44, las células se incubaron con anticuerpos durante 20 min en la oscuridad. Después de lavado con PBS, las células se analizaron en un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson).
Los ensayos de función del proteasoma
quimotrıptico, trípticos, y las actividades del proteasoma caspasa se midió como se describe anteriormente [25] con algunas modificaciones de menor importancia. A549, H1299 y sus células esfera de tumor de pulmón primario se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se sedimentaron por centrifugación. Los sedimentos celulares se sometieron a ultrasonidos en tampón de homogeneización (Tris 25 [pH 7,5], NaCl 100 mM, ATP 5, 0,2% (v /v) de Nonidet P-40 y 20% de glicerol, y los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 4 ° C. la concentración de proteína en los extractos celulares brutos resultantes se determinó por el protocolo de Micro (ácido bicinconínico) (Bio Rad, Rockford, IL) con BSA (Sigma) como estándar. Para medir la actividad del proteasoma 26S, 100 g de proteína de los extractos celulares crudos de cada muestra se diluyó con tampón I (Tris 50 mM [pH 7,4], ditiotreitol 2 mM, MgCl 5
2, ATP 2 mM) hasta un volumen final de 1 ml (ensayada por cuadruplicado). Los sustratos del proteasoma fluorogénicos Suc-LLVY-AMC (sustrato quimotríptica; Biomol International, Plymouth Meeting, PA), (sustrato tríptico; Calbiochem) Z-ARR-AMC y Z-LLE-AMC (sustrato de la caspasa-similares; Biomol International) se disolvieron en DMSO y añaden a una concentración final de 80 mM. actividades proteolíticas se monitorizaron de forma continua en 2 horas a 37 ° C midiendo la liberación del grupo fluorescente, 7-amido-4-metil-cumarina (AMC), en un lector de placas de fluorescencia (Spectramax M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) con excitación y emisión de longitudes de onda 380 y 460 nm, respectivamente.
Alamar Blue Ensayo
la viabilidad celular se midió por Alamar Blue [26]. células A549 y H1299 se sembraron en placas de 96 pocillos (BD Falcon) a una densidad de 2 x 10
3 células por pocillo. Para cultivos esfera tumorales, de una sola célula era enzimática y mecánica disociado. 24 h después de la siembra, las células fueron expuestas a diferentes concentraciones de cisplatino o doxorrubicina como se indica para 48 h. se añadió Alamar Blue (BioSource, Camarillo, CA) directamente a los medios de cultivo a 10% del volumen de los medios de comunicación durante el último 10 h del período de exposición 48 h. Emite fluorescencia con una excitación de 544 nm y emisión detectada a 590 nm se midió utilizando un lector de microplacas.
Generación de líneas celulares estables que expresan ZsGreen-CODC proteínas de fusión Usando retroviral Transducción
El vector de expresión retroviral pQCXIN-ZsGreen-CODC fue una especie de regalo del Dr. Frank Pajonk (División de Oncología Molecular y celular, Departamento de Oncología Radiológica, la Escuela David Geffen de Medicina en la Universidad de California, los Ángeles, los Ángeles, CA), en la que el carboxilo terminal de la degron murino ornitina descarboxilasa (CODC), la secuencia que dirige el lugar a partir de la degradación, se fusionó con el reportero ZsGreen [21]. pQCXIN-ZsGreenc-ODC se co-transfectaron con pVSV-G en células GP2-293 pantrópicas retrovirales de embalaje (Clontech) y el sobrenadante retrovirus se utilizó para infectar células A549 y H1299. 48 h después de la infección, las células se seleccionaron con G418 (Invitrogen). La acumulación de la proteína ZsGreen-CODC se controló mediante microscopio de fluorescencia y citometría de flujo (FL-1 canal).
Generación de pulmón subcutánea xenoinjertos de cáncer en ratones desnudos
En xenoinjertos de ratones, tanto monocapa y el tumor células esfera se tripsinizaron y se disociaron mecánicamente para obtener suspensiones de células individuales antes de la inyección subcutánea. Se utilizaron seis semanas de edad ratones desnudos hembra (Harlan Lab, Indianapolis, IN). esfera del tumor (1 × 10
4) y monocapa (1 × 10
4) las células fueron por vía subcutánea se inyecta en los flancos izquierdo y derecho de la misma ratón para evaluar la actividad tumorigénico. Los ratones se monitorizaron diariamente para la aparición de tumores subcutáneos. Los ratones fueron sacrificados en el día 60 y se recogió el tejido tumoral. El volumen del tumor se calculó mediante la fórmula 0,52 x longitud x anchura
2. tinción con hematoxilina y eosina seguido por el análisis IHC se realizó para analizar la histología del tumor. Las secciones también fueron teñidas con anticuerpos contra la β-catenina por el protocolo estándar IHC.
Análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± SD. Las diferencias se determinaron mediante la prueba t de Student de dos colas. Un valor de P & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
células SP y NSP forman esfera tumor con la misma frecuencia en las líneas celulares de adenocarcinoma humano
han sido
células SP. implicado como células madre cancerosas putativas, ya que muestran elevada tumorigenicidad en ratones desnudos /scid en comparación con las células de NSP [27]. Para determinar si las células SP tienen una mayor capacidad de auto-renovación de las células de NSP en cultivo, las células SP y NSP de dos líneas celulares de cáncer de pulmón humano se ordenan en función de la capacidad de flujo de salida Hoechst 33342 para generar un perfil de azul-rojo Hoechst. Un inhibidor selectivo ABCG2, Fumitremorgina C (FTC), se co-incubaron con Hoechst 33342 para bloquear la actividad del transportador, y la puerta de SP se define como la región disminuida en presencia de FTC. Las líneas celulares de adenocarcinoma humano A549 y H1299 contenían células SP 17,7% y 0,2%, respectivamente (Fig. 1A). El cultivo de células SP y NSP en la esfera tumor que forma los medios de comunicación, que sólo permite la selección de clones no diferenciadas o madre de cáncer y células progenitoras [11], como resultado de pulmón formación esfera tumor de ambas subpoblaciones sin diferencia en la tasa de formación (Fig. 1B y datos no presentados). SP células suelen dar lugar a células SP y NSP a través de la división celular asimétrica, mientras que las células de NSP no tienen este potencial [28]. Al volver a la tinción de la SP ordenados y células de NSP de A549 y células H1299 una semana después, el análisis FACS reveló que las células SP dieron lugar a una proporción significativa de células NSP. Además, las células aisladas de NSP también dieron lugar a proporción similar de células SP (Fig. 1C).
A. Característica Hoechst 33342 perfil tinción de colorante que demuestra la existencia de SP (polígono cerrado) y NSP (elipse cerrada) en células A549 y células de adenocarcinoma humano H1299. Porcentaje de células SP se indica. Las células se tiñeron con 5 mg /ml Hoechst33342 (HO), y el control de las células fueron también co-teñidas con 10 mM Fumitremorgina C (FTC) para especificar las células SP. Las células fueron ordenados usando un citómetro MoFlo Beckman y los datos fueron anotados utilizando FCS Express. B. fotografías de contraste de fase de las esferas de tumores de pulmón obtenidas a partir de células SP y NSP. SP y células NSP (1000 células /ml) se sembraron en frascos de baja adherencia de ultra en medio libre de suero suplementado con factores de crecimiento y cultivadas como se describe en Materiales y Métodos. C. Re-tinción de células SP y NSP del A549 y H1299 con Hoechst 33342. Porcentaje de células SP está etiquetado.
pulmonares características de células madre de cáncer esferas tumorales exhiben
Dado que las células capaces de auto-renovación residen en las poblaciones de ambos laterales y no laterales, se investigó si las células tumorales mostraron esfera funciones de CSC, tales como la expresión de marcadores de células madre, tales como CD44, CD133 y OCT3 /4. En primer lugar, para descartar el efecto de los medios de comunicación CSC en la expresión, se comprobaron las células en monocapa se cultivan en los medios de comunicación de CSC, y no se encontraron diferencias entre las células crecen en medios de CSC y medios de cultivo regular (datos no mostrados). Las células de monocapa y esfera culturas de A549 y las células H1299 se recogieron a continuación, y se analizaron para CD44 y CD133. Más del 90% de las células A549 y H1299 en monocapas eran CD44
+, mientras que sólo una porción muy pequeña de las células eran CD133
+ (0,2% en las células A549, y 0,55% en células H1299.). Sin embargo, en esferas de tumores de pulmón, CD133
+ células se enriquecieron en gran medida a más del 10% en A549, y 1,7% en H1299 (Fig. 2A). El factor de transcripción OCT3 /4 se considera un regulador central de la capacidad de pluripotencia de células madre y de auto-renovación de embriones humanos. Su expresión parece ser importante en el mantenimiento del estado no diferenciado de carcinoma embrionario, así como en otros tipos de cáncer [29], [30]. Oct3 /4
+ en las células A549 y H1299 monocapas fueron menos de 4%, mientras que los números fueron significativamente hasta reguladas en esferas tumorales al 36% y el 50%, por separado.
A. esferas de tumores pulmonares mostraron un incremento en la expresión de CD133. La expresión de CD44 y CD133 en células monocapa y la esfera tumor, determinado por flujo de dos colores análisis de citometría. Isotipo de anticuerpos monoclonales y un segundo antisuero preinmune se utilizaron como controles negativos. El porcentaje de células de uno y dos positivos se indican. B. esferas tumorales de pulmón mostraron una mayor OCT3 /4 expresión. se muestra una intensidad media de fluorescencia de OCT3 /4 en el control (área gris), las células en monocapa (línea de puntos) y esferas tumorales (línea continua). Los porcentajes de células positivas se indican en la tabla.
esferas tumor de pulmón tienen un alto potencial tumorigénico
Para determinar si las esferas de tumores de pulmón de células A549 y H1299 difieren en su potencial tumorigénico en comparación con las células cultivadas en una monocapa, se inyecta por vía subcutánea 10.000 células de cada una de estas poblaciones en los flancos de ratones desnudos. El crecimiento del tumor se observó en todos los ratones inoculados con células tumorales derivadas de esfera A549, mientras que no se observó crecimiento del tumor después de la inoculación con células monocapa A549 (Tabla 1). células esfera tumorales de células H1299 crecieron en 2 de cada 3 ratones desnudos, mientras que el mismo número de células en monocapa no dio lugar a ninguna tumor incluso con un ampliada 4 más semanas de observación (Tabla 1 y los datos no presentados). H & amp; E tinción reveló una masa altamente celular con grandes núcleos y nucleolos prominentes (Fig. 3). secciones tumorales de esferas de tumores xenoinjertados se tiñeron utilizando un anticuerpo contra β-catenina, que es un regulador clave de la vía Wnt que funciona en el control de células madre de auto-renovación. La translocación de β-catenina en el núcleo conduce a la mayor expresión de β-catenina genes diana que promueven la creación tumor, el crecimiento y la invasión [31]. Hemos observado que la β-catenina se expresó principalmente en el citoplasma, mientras que se observó expresión en los núcleos en secciones de tumores inducidos esfera tumor (Fig. 3). Translocación de β-catenina en el núcleo conduce a la mayor expresión de β-catenina genes diana que promueven el establecimiento del tumor, el crecimiento y la invasión [31].
tumor extirpado quirúrgicamente se fijó en formalina tamponada y posteriormente analizada por inmunohistoquímica (IHC) por el protocolo estándar.
esferas de tumores de pulmón son más resistentes a los agentes quimioterapéuticos
Las células en monocapa y la esfera del tumor fueron expuestas a diferentes concentraciones de fármacos quimioterapéuticos actualmente en utilizar en el ámbito clínico, tales como cisplatino y doxorrubicina. La viabilidad celular se midió mediante el ensayo Alamar Blue 2 días después de someter las células en monocapa y esfera tumor a cisplatino o doxorrubicina. Como se muestra en la figura 4, la viabilidad de cultivos en monocapa disminuyó significativamente después de ambos tratamientos agentes quimioterapéuticos en comparación con la de las células esfera tumor. La viabilidad relativa fue de alrededor de 20% para los dos cultivos monocapa H1299 A549 y cuando se tratan con 12,5 M de doxorrubicina, mientras que más del 50% de las células tumorales esfera (50,4% para H1299, y 64,8% para A549) sobrevivió. Cuando se trata con 25 M de cisplatino, la viabilidad relativo fue de 11,7% para A549 y 25,3% para el cultivo en monocapa H1299, mientras que 65,4% de la esfera tumor A549 y 79,3% de las células esfera tumor H1299 sobrevivido este tratamiento, lo que indica un cultivo monocapa puede ser más sensible al cisplatino y doxorrubicina en comparación con las esferas de tumores, como se demuestra por la menor porcentaje de células viables después de la exposición in vitro a la droga.
a. cisplatino, se analizaron B. resistencia a la doxorubicina de cultivo en monocapa y esferas tumorales. Las células disociadas a partir de esferas de tumores pulmonares o monocapas se sembraron en placa de 96 pocillos a 2 x 10
4 células /ml, 24 h después, se añadieron los medios que contienen diferentes concentraciones de cisplatino o doxorrubicina. Después de 48 h de cultivo, se añadió 10% de Alamar azul y se leyó a 544/590 nm, el porcentaje de viabilidad se calculó con relación a las células no expuestas a ningún fármacos quimioterapéuticos. Los resultados representan las medias ± SD.
pulmón esferas tumorales exhiben reduce la actividad del proteasoma
El descenso de regulación de la proteolisis ubiquitina-proteasoma dependiente se observó en respuesta a varios agentes quimioterapéuticos, tales como cisplatino [19], ifosfamida [19] y Bortezomib [32]. Hallazgos recientes mostraron que los fármacos quimioterapéuticos, tales como cisplatino, también puede conducir a la propagación de las células madre cancerosas [18]. Para investigar si se observa la actividad del proteasoma reducida en células madre cancerosas de pulmón, se realizaron ensayos de la función del proteasoma fluorogénicos utilizando cultivos monocapa y la esfera de la A549 y células de NSCLC humano H1299. El proteasoma 26S tiene al menos tres tipos distintos de actividades proteolíticas incluyendo quimotripsina, tripsina, y las actividades de caspasa-similares. Para supervisar las actividades de proteasas específicas del proteasoma 26S, tres sustratos fluorogénicos: Suc-LLVY-AMC para quimotripsina, Z-ARR-AMC de tipo tripsina, y Z-LLE-AMC para la actividad de la caspasa-como, se incubaron con células lisados de cualquiera de las culturas esfera tumor de pulmón monocapa o. actividades de tipo quimotripsina de monocapas caspasa-como y el aumento de más de 2 horas de incubación con sustratos, pero se mantuvo sin cambios en lisados esfera del tumor. actividades de tipo quimotripsina se incrementaron de manera similar en cultivos monocapa y menos en las esferas de tumor de pulmón (Fig. 5A, B). actividad similar a la tripsina no fue significativamente diferente en ambos grupos (Fig. 5C). actividad similar a la quimotripsina, la actividad predominante del proteasoma 26S, se redujo a aproximadamente 30% en los cultivos de esfera en relación con cultivos en monocapa. Actividad de la caspasa-como se redujo a aproximadamente 20%, mientras que la actividad similar a la tripsina no fue significativamente diferente (Fig. 5D). Este resultado indica que las culturas esfera tumor de pulmón tienen 26S inferiores actividad del proteasoma de cultivos en monocapa.
A. caspasa-como, BC actividad similar a la tripsina de cultivo en monocapa y esferas de tumores de células A549 y H1299 tipo quimotripsina, y fue measued durante los tiempos indicados. D. Análisis del punto final (120 minutos) del proteasoma 26S actividades en cultivos en monocapa y esferas tumorales. Media ± desviación estándar y se traza deriva de tres experimentos independientes. de Student para datos apareados, y dos de cola t-se realizaron pruebas, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 y *** p & lt; 0,001 (tres repeticiones por experimento)
esferas de tumores de pulmón. están enriquecidas con células con baja actividad del proteasoma
Proteasomal degradación de la mayoría de las proteínas deben pasar primero a través de la ruta de ubiquitinación antes de ser degradada por el proteasoma. Sin embargo, la ornitina descarboxilasa (ODC) es una proteína bien caracterizada sujeto celular a la degradación proteasomal ubiquitina-independiente, y una vez reconocido por proteasoma 26S, conduce a la degradación inmediata de las proteínas que lo contienen [21]. Retrovirus expresar ZsGreen-CODC (fusión es decir, de una proteína fluorescente ZsGreen, y el C-terminal de la degron murino ornitina descarboxilasa (CODC)) permite la identificación de células con una reducción de la actividad del proteasoma 26S debido a la fluorescencia ZsGreen. Esto ha sido previamente informado para realizar un seguimiento de los AIC en el glioma y cáncer de mama
in vitro
basado en su capacidad para marcar las células vivas con baja actividad del proteasoma 26S [21]. Para confirmar que las células del tumor esfera están enriquecidas en células madre cancerosas de pulmón, se infectaron células A549 y H1299 con el retrovirus que expresan ZsGreen-CODC. Hemos observado que los cultivos monocapa de A549 y H1299 mostrado escasa fluorescencia de fondo en más del 98% de las células, y sólo muy pocas células (2%) presentaron altos niveles de ZsGreen (Fig. 6A y datos no mostrados). Curiosamente, las esferas de tumores de pulmón derivados de ZsGreen-CODC infectaron células A549 y H1299 se enriquecieron en gran medida para las células ZsGreen-positivos, lo que indica la actividad del proteasoma baja y por lo tanto una fuente altamente enriquecido para los CAC (Fig. 6B). Para confirmar aún más que los CAC se enriquecen en la población con baja actividad del proteasoma, las células ZsGreen-positivos y negativos también fueron ordenados en placas de 96 pocillos, y el número de esferas formadas de 100 células clasificadas, se contaron las células positivas de ZsGreen tanto A549 y líneas celulares H1299 tenían una capacidad estadísticamente significativamente mayor de formación de esferas en comparación con las células ZsGreen-negativos (Fig.6C).
a. Frecuencia de las células A549 y ZsGreen en cultivos monocapa H1299. B. Frecuencia de las células A549 y ZsGreen en esferas tumorales derivadas-H12199 con acumulación de ZsGreen-CODC, y por lo tanto la actividad del proteasoma baja se indica. C. Número de esferas formadas a partir de la ZsGreen positivo y las células negativas ZsGreen después de la clasificación con citometría de flujo en placas de 96 pocillos. células ZsGree-positivos y negativos fueron ordenados en placa de 96 pocillos (100 células /pocillo), después se cultivan en medios esfera tumor durante 2 semanas; Se contó el número de esferas formadas. de Student para datos apareados, y se realizaron dos colas pruebas t, *** p & lt; 0,001 (tres repeticiones por experimento)
Discusión
En el presente estudio, hemos demostrado. que: 1) consistente con la evidencia anterior [11], existen células CSC-como en el cáncer de pulmón; 2) Las células NSP SP y forman esferas tumorales con la misma frecuencia que indican la existencia de auto-renovación de células CSC-al igual que en ambas poblaciones; 3) células de pulmón CSC-como se pueden propagar en medio libre de suero; y 4) la actividad del proteasoma 26S baja se asocia con células pulmonares CSC-como. La hipótesis de las células madre de cáncer predice que la fracción SP debe ser capaz de regenerar tanto la SP y fracciones de NSP mientras que la fracción NSP sólo debe ser capaz de regenerarse a sí mismo [28]. Curiosamente, los resultados presentados aquí demuestran que tanto la SP y las fracciones de NSP tienen la capacidad de regenerarse completamente ambas fracciones. El mismo hallazgo se ha observado también en el glioma y de meduloblastoma DAOY líneas celulares C6 donde ambas fracciones eran capaces de reconstituir la población celular parental [16], [33]. En el presente estudio, las células SP muestran el crecimiento del tumor en forma de esfera, la clásica
in vitro
ensayo del potencial de auto-renovación, lo que confirma los hallazgos previos que muestran actividad de células SP tallo-como [34]. Sin embargo, las células de NSP también fueron capaces de formar esferas de tumor a una frecuencia comparable a la de células SP.
CD133 (prominin-1 humana), un dominio transmembrana glicoproteína cinco, fue identificado originalmente como un antígeno de superficie celular presente en CD34
+ células madre hematopoyéticas. Recientemente, CD133 se muestra como un marcador de superficie putativa de células madre de cáncer en muchos tumores sólidos, tales como tumor cerebral [35], cáncer de próstata [36], cáncer de colon [8], el cáncer de ovario [37] y el cáncer de pulmón [11] . La extremadamente baja abundancia de CD133
+ o Oct3 /4
+ células en los tumores, hace que sea difícil aislar estas poblaciones. En nuestro estudio demostramos que el enriquecimiento de CD133
+ /Oct 3/4
+ células por
in vitro
cultivo libre de suero es posible.
Desde hace tiempo se conoce que no todas las células tumorales es una célula de iniciación de tumor, y por lo tanto a menudo se requieren millones de células tumorales de trasplantar un nuevo tumor de uno existente. En el presente estudio, el crecimiento del tumor de xenoinjerto en ratones desnudos se produjo con la inyección de células tumorales 10000 esfera, pero no mediante la inyección de un número igual de células de la monocapa. Estos tumores tenían grandes núcleos con nucleolos prominentes y tinción nuclear de β-catenina, lo que indica la posible activación de la vía Wnt. acumulación nuclear de β-catenina [38] se ha demostrado que desempeñan un papel en el control de células madre auto-renovación [31], [39].
Los medicamentos quimioterapéuticos, tales como cisplatino e ifosfamida [19], son sabido para matar la mayor parte de los tumores mediante la ubiquitina-proteasoma dependiente de proteólisis abajo de la regulación [20]. Sin embargo, ellos también conducen a la propagación de las células madre cancerosas [18].