PLOS ONE: proteasoma inhibidor natural celastrol Suprime andrógeno-independiente del cáncer de próstata mediante la modulación de la progresión apoptóticos proteínas y NF-kappaB

Extracto

Antecedentes

celastrol es un inhibidor del proteasoma natural que exhibe anti prometedora efectos tumorales en tumores malignos humanos, especialmente el cáncer de próstata independiente de andrógenos (AIPC) con la activación de NF-kappa B constitutiva. Celastrol induce la apoptosis por medio de la inhibición del proteasoma y suprime el crecimiento del tumor de próstata. Sin embargo, el mecanismo detallado de acción sigue siendo difícil de alcanzar. En el estudio actual, nuestro objetivo es poner a prueba la hipótesis de que celastrol suprime la progresión a través de AIPC la inhibición de la actividad de NF-kB constitutiva, así como la modulación de las proteínas de la familia Bcl-2.

Metodología /Principales conclusiones

Se examinó la eficacia de celastrol tanto
in vitro

in vivo y
, y evaluamos el papel de NF-kB en la regresión AIPC celastrol mediada. Hemos encontrado que inhibe la proliferación celular celastrol en las tres líneas celulares AIPC (PC-3, DU145 y CL1), con IC
50 en el rango de 1 a 2 mM. Celastrol también suprimió la migración celular y la invasión. Celastrol inducida significativamente la apoptosis como se evidencia por el aumento de la población sub-G1, la activación de la caspasa y PARP división. Por otra parte, celastrol promueve la escisión de la proteína anti-apoptótica MCL-1 y se activa la proteína pro-apoptótica Noxa. Además, celastrol bloqueado rápidamente la degradación de I? B? Citosólica y la translocación nuclear de de RelA. Del mismo modo, celastrol inhibió la expresión de múltiples genes diana NF-kB que están implicados en la proliferación, la invasión y anti-apoptosis. Celastrol suprimió la progresión tumoral mediante la inhibición de la proliferación AIPC, el aumento de la apoptosis y la disminución de la angiogénesis, en PC-3 modelo de xenoinjerto en ratón desnudo. Además, el aumento de I? B? Celular y la expresión inhibida de varios genes diana NF-kB se observaron en los tejidos tumorales.

Conclusiones /Importancia

Nuestros datos sugieren que, a través de la orientación del proteasoma, celastrol suprime la proliferación, la invasión y la angiogénesis mediante la inducción de la maquinaria apoptótica y atenuar la actividad de NF-kB constitutiva en tanto AIPC
in vitro
y
in vivo
. Celastrol como un ingrediente activo de la medicina herbal tradicional por lo tanto podría ser desarrollado como un nuevo agente terapéutico para el cáncer de próstata refractario a las hormonas

Visto:. Dai Y, Desano J, Tang W, X Meng, Meng Y, E Burstein , et al. (2010) proteasoma inhibidor natural celastrol Suprime andrógeno-independiente del cáncer de próstata mediante la modulación de la progresión apoptóticos proteínas y NF-kappaB. PLoS ONE 5 (12): e14153. doi: 10.1371 /journal.pone.0014153

Editor: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Estados Unidos de América

Recibido: 10 de julio de 2010; Aceptado: 10 de noviembre de 2010; Publicado: December 10, 2010

Derechos de Autor © 2010 Dai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el Departamento de Programa de Investigación de cáncer de próstata Defensa [W81XWH-06-1-0010] y los Institutos nacionales de Salud (NIH) Instituto Nacional del cáncer [R01 CA121830 (S1), R21 CA128220 y R01 CA134655] para LX, y por NIH a través de una Universidad de Michigan Centro de cáncer Proyectos financiados [5 P30 CA46592]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el proteasoma es un complejo de proteasa multicatalítica responsable de la degradación de múltiples proteínas intracelulares que están implicadas en diversos eventos celulares, incluyendo la reparación del ADN, el ciclo celular, la supervivencia y apoptosis. Por ejemplo, p27, un regulador clave de G1 a S transición en el ciclo celular, se ubiquitinated rápidamente y degradado por proteasomas que conducen a corta vida media de p27 [1]. Además, la mayoría de las proteínas de la familia Bcl-2 son degradados por el sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) [2], [3], [4]. El factor nuclear kappaB (NF-kappa B) es un importante factor de pro-supervivencia que se forma pivotante regulada por el proteasoma, ya que es bien sabido que en la vía clásica NF-kappa B, I? B?, el secuestrante de NF-kB, es degradada por la proteasoma, por lo tanto, la liberación de NF-kappa B para la activación [5].

montaje evidencia revela que la activación sostenida o constitutiva de NF-? B contribuye a la progresión maligna y la resistencia terapéutico en la mayoría de los cánceres humanos [6]. Por ejemplo, en el cáncer de próstata, constitutivamente activa NF-kappa B se ha demostrado que se correlaciona inversamente con el estado del receptor de andrógenos y vinculado a andrógenos independencia y la terapia de la resistencia [7]. La elevada NF-kB sobrevivir vía de señalización en el cáncer de próstata independiente de andrógenos (AIPC) parece estar correlacionado con una alta actividad de proteasoma, tal como se refleja por una rotación más rápida de I? B? [8], [9]. Sobre la base de esta evidencia, la orientación proteasomas podría disminuir la actividad de NF-kB y así ser una estrategia útil en la intervención AIPC. De hecho, la modulación de la función proteasomal con inhibidores específicos ya se ha demostrado como un enfoque prometedor para el tratamiento de cáncer de próstata humano. Bortezomib (Velcade; PS-341), el primero en utilizar un inhibidor del proteasoma en una aplicación clínica, ha demostrado actividad anti-tumor cuando se utiliza como agente único o en combinación con terapias convencionales en cáncer de próstata refractario a las hormonas [10]. En modelos preclínicos de cáncer, los inhibidores del proteasoma inducen la apoptosis de cáncer de próstata, tanto
in vitro
y
in vivo
[11], [12], proporcionando evidencia sustancial de que los inhibidores del proteasoma pueden aplicarse como un agente terapéutico estrategia para AIPC.

celastrol es un inhibidor natural del proteasoma que se ha informado para mostrar los efectos antiproliferativos y la apoptosis en varios modelos preclínicos de cáncer [12], [13]. Mecánicamente, NF-kB se ha demostrado que es un objetivo clave de celastrol [14]. Estudios recientes han sugerido que celastrol puede potenciar la apoptosis y bloquear la activación constitutiva o inducida por NF-? B con otros agentes terapéuticos, tales como el factor de necrosis del tumor [15], la temozolomida [16] y ácido gambogic [17]. Además, se propone celastrol para suprimir el crecimiento del tumor xenoinjertado a través de la orientación de la angiogénesis [18], [19]. En el ajuste de cáncer de próstata, celastrol solo desencadena la apoptosis por medio de la inhibición del proteasoma y suprime el crecimiento del tumor de próstata [12]. Sin embargo, el mecanismo de acción directa sigue siendo difícil de alcanzar. En el estudio actual, nuestro objetivo es poner a prueba la hipótesis de que celastrol suprime la progresión a través de AIPC la inhibición de la actividad de NF-kB constitutiva, así como la modulación de las proteínas de la familia Bcl-2. Se determinó la eficacia de celastrol tanto
in vitro
y
in vivo
, y evaluamos el papel de NF-kB en la regresión AIPC celastrol mediada.

Materiales y Métodos

Reactivos y cultivo celular

celastrol (98% de pureza) se adquirió de Gaia química (Gaylordsville, CT). El polvo se resolvió en sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se almacena como alícuotas (20 mM) a -70 ° C. MG-132 se adquirió de BIOMOL (Plymouth Meeting, PA). cóctel inhibidor de proteasa fue proporcionado por Roche (Indianápolis, IN). Otros productos químicos fueron adquiridos de Sigma a menos que se indique lo contrario. líneas celulares de cáncer de próstata humano PC-3, DU145 y LNCaP se obtuvieron de American Type Culture Collection. La línea celular de cáncer de próstata independiente de andrógeno-CL1, derivada de la línea celular LNCaP andrógeno-dependientes [20], fue proporcionado amablemente por el Dr. Arie Belldegrun (Universidad de California, Los Ángeles, CA). Las células se mantuvieron en medio RPMI-1640 (PC-3) o DMEM (DU145, LNCaP y CL1) suplementado con 10% FBS, 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina, y se incubaron en un 5% de CO
2 humidificado incubadora a 37 ° C.

proliferación celular y muerte celular

Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos y se trataron con celastrol por triplicado. Después de 4 días de incubación, se identificaron las células viables con un kit de recuento de células con WST-8 (Dojindo, Rockville, MD) y la absorbancia se ensayó a 450 nm colorimétricamente. La viabilidad celular (%) era la relación de absorbancia de la muestra tratada con el control sin tratar [21], [22]. Alternativamente, las células se sembraron en una placa de 24 pocillos a una densidad de 2 x 10
5 células /pocillo y tratados con celastrol en pocillos duplicados. Se recogieron las células unidas y se contaron usando un contador de células Coulter (Fullerton, CA) cada 24 h durante 4 días. La muerte celular se ensayó por exclusión de azul de tripano para ambas células flotantes y unidas [21], [23]. Los datos se representaron gráficamente y se analizaron por GraphPad Prism 5,0 (San Diego, CA). El cincuenta por ciento de las concentraciones inhibitorias (IC
50) se calcularon mediante un análisis de dosis-respuesta sigmoidal de regresión no lineal (Prism 5.0) [21], [22], [24].

migración de células

migración celular se determinó mediante un ensayo de "-cicatrización de heridas" [25], [26]. Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos y se crecieron durante 48 h para llegar a la confluencia. Las lagunas se han creado artificialmente por el rascado de la monocapa celular. La migración celular fue fotografiada 6 h, 24 hy 48 h después de cada cero. Las células que migran a la zona despojada puntuaba de cuatro campos al azar.

invasión celular

La invasión fue probada usando Transwell (8 micras de poro) precargado con Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA ). Las células se incubaron con o sin celastrol (1 M) en un medio libre de suero y se cargan en la cámara superior (2 × 10
4 /inserto). Se añadió el medio completo (10% FBS) a la cámara inferior para generar un quimioatrayente. Veinticuatro horas después de la siembra de células, los insertos se limpian con un hisopo de algodón para eliminar el Matrigel, y se tiñeron con violeta cristal (0,1%). La invasión de las células en la parte inferior del filtro fueron anotados de ocho campos al azar.

Análisis de Ciclo Celular

Las células fueron fijadas en etanol al 70% a 4 ° C durante la noche, y luego tratados con yoduro de propidio ( PI, 50 g /ml) y RNasa a (1 mg /ml) durante 30 min. Las muestras se analizaron por citometría de flujo (FACScalibur, BD Biosciences). La población sub-G1 se obtuvo a partir del contenido hypodiploid ADN [24], [27]. Los datos fueron analizados utilizando el software WinMDI 2.8 (Purdue University Laboratorio de Citometría).

Activación de la caspasa

Las células se homogeneizaron en un tampón de lisis (Biovision, Mountain View, CA), y los lisados ​​de células enteras (40 g) se incubaron con 20 M de sustrato fluorogénico LEHD-AFC o DEVD-AFC en un tampón de reacción (BioVision) que contiene DTT 5 mM a 37 ° C durante 1 h. liberación proteolítica de AFC se controló a? ex = 405 nm y λem = 500 nm usando un lector de microplacas de fluorescencia (BMG LABTECH, Cary, NC). La actividad se expresa como "veces mayor", y se calcula como la relación de la señal de fluorescencia en las muestras tratadas con las células control no tratadas.

Western Blot

Total de células se hicieron lisados ​​de células o tejidos tumorales y experimentos de Western blot se realizaron como se describió anteriormente [26]. Los anticuerpos contra la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) (F-2), MCL-1 (S-19), Bcl-2 (C-2), la ubiquitina (P4D1), caspasa-3 (H-277), I? B? (C-15), de RelA (F-6), tubulina (4G1) y GAPDH (L-20) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). El anticuerpo anti-Noxa se adquirió de Calbiochem (Gibbstown, NJ). Anti-β-actina (AC-74) de anticuerpos se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO). la densidad de la banda se cuantificó mediante el software TotalLab (Durham, Carolina del Norte).

Fraccionamiento subcelular

citosólicas y nucleares fracciones se prepararon como se describe anteriormente [24], [25]. Brevemente, extracto citosólico se obtuvo por homogeneización de las células en un tampón hipotónico [mM HEPES 10 mM, KCl 5, MgCl mM 1.5
2 y 1 mM ditiotreitol (DTT) con cóctel inhibidor de la proteasa], seguido de la adición de Igepal CA- 630 (0,5%). Los pellets se resolvieron en un tampón hipertónico (mM HEPES 20 mM, KCl 50, NaCl 300 mM, PMSF 1 mM, DTT 1 mM, e inhibidores de proteasa) para obtener extractos nucleares. subcelulares proteínas se cuantificaron mediante el ensayo de Bradford antes de Western blot.

Cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)

qPCR se realizó para determinar NF-KB expresión de genes objetivo [28]. El ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. cDNA se obtuvo por transcripción inversa con 1 g de ARN total usando un kit de transcripción inversa TaqMan (Applied Biosystems). SYBR Green se utilizó para la PCR cuantitativa. Secuencias de cebadores de genes se enumeran en la Tabla S1. Las reacciones con TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems) se realizaron en el Mastercycler
realplex

2 Sistema S (Eppendorf, Westbury, NY). los niveles de mRNA de los genes diana se normalizaron a GAPDH utilizando la fórmula: [2∧- (C
T objetivo-C
T actina)] x 100%, donde C
T es el ciclo umbral [27] . la expresión de ARNm se expresa como "doblar aumento" y se calculó dividiendo la expresión del gen diana normalizada de la muestra tratada con células control sin tratar.

Estudio Animal

Mujer nu ratones atímicos /nu (5 semanas) se inocularon por vía subcutánea (sc) con células PC-3 (3 × 10
6) en ambos lados de la espalda baja. Cuando los tumores crecieron hasta 100 mm
3, los ratones se aleatorizaron y se trataron diariamente mediante sonda oral (p.o.) con vehículo de control [12] o celastrol a una dosis de 1 mg /kg con 5 días por semana durante 3 semanas. El tamaño del tumor se midió en la última dosificación de celastrol (día 18). El volumen del tumor se calculó como (longitud x anchura
2) /2. Las muestras tumorales se fijaron en 4% de paraformaldehído y embebidos por parafina. El análisis inmunohistoquímico se realizó por Ki67, desoxinucleotidil transferasa terminal biotina-dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL), y la tinción CD31 para la detección de la proliferación, la apoptosis y la angiogénesis, respectivamente, como se describió anteriormente [22], [23], [26] . Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo a los protocolos aprobados por la Universidad de Michigan Directrices para el Uso y Cuidado de los Animales.

Análisis estadístico

Dos de cola de Estudiantes de
t-test
WAS empleado para analizar tanto
in vitro Opiniones y
in vivo
datos. Todos los análisis se realizó mediante GraphPad Prism 5.0. Un umbral de
P
. & Lt; 0,05 se definió como estadísticamente significativa

Resultados

proliferación de células de cáncer de próstata celastrol Inhibe
ha informado
celastrol para mostrar actividad anti-tumor en células de cáncer de próstata humano [12]. En nuestro estudio, hemos confirmado que celastrol reducción de la viabilidad celular en ambas (PC-3, DU 145, CL1) células andrógeno-dependientes (LNCaP) y andrógeno-independiente de cáncer de próstata, con una CI
50 de citotoxicidad inferior a 2 micras ( Fig. 1A). Para las células PC-3, celastrol inhibió la proliferación dependiente de la dosis (Fig. 1B), con la inhibición del crecimiento del 65% en el IC
50 dosis (~ 1 mM) en el día 3. Al 2 M, celastrol completamente inhibe el crecimiento celular en las líneas celulares ensayadas. Estos datos demuestran que celastrol disminuye constantemente la proliferación celular y la viabilidad AIPC a las concentraciones & lt; 2 M

(A): las células se trataron con diversas dosis de celastrol y la viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT.. IC
50 se muestra como se calcula por Prism 5.0. Los datos son la media ± SD (n = 3). (B): células PC-3 fueron tratados con diferentes dosis de celastrol (CEL). Se recogieron las células unidas y se cuentan todos los días durante 4 días. Los datos mostrados son la media ± SD (n = 6).

celastrol suprime la migración y la invasión

A medida que una mayor concentración de celastrol era citotóxica (Fig. 1), se evaluó el efecto de celastrol sobre la migración celular y la invasión usando dosis no tóxicas (& lt; 1 M). Celastrol inhibe la migración de células PC-3 tanto en la dosis y de manera dependiente del tiempo (Fig. 2A). Con concentraciones (0,5 M) que mínimamente afectados proliferación, celastrol impidió la motilidad celular 24 h post-tratamiento (
P
& lt; 0,001, Fig 2B.). Además, la invasión de células DU145 se inhibió a 70% en 1 M de celastrol (
P
. & Lt; 0,001, Fig 2C y D). Estos datos sugieren que celastrol suprime la migración celular y la invasión AIPC a concentraciones subcytotoxic

(A):. PC-3 células en monocapa se rascaron y se trataron con celastrol en 0,5 y 1 mM. "Cicatrización de heridas" se puso a prueba a las 6 h, 24 hy 48 h post-cero. Aumento original, × 100. (B): la cuantificación de la migración celular en A a partir de 4 campos aleatorios en muestras duplicadas.
Columnas
, media;

bares, SD (n = 8). ***,
P Hotel & lt; 0,001. (C): células DU145 tratadas con o sin 1 mM de celastrol se sembraron en insertos Transwell recubiertas con Matrigel (2 × 10
4 /de inserción) para 24 h. Las células en la parte inferior del filtro se tiñeron. Aumento original, × 200. (D): la invasión de las células en (C) se obtuvo a partir de 8 campos aleatorios.
Columnas
, media;

bares, SD (n = 8). ***,
P
. & Lt; 0,001

celastrol induce la apoptosis y modula MCL-1 |
A continuación se investigó si la apoptosis está implicada en la citotoxicidad mediada por celastrol . Celastrol de hecho induce la condensación de la cromatina y fragmentación del ADN en las células AIPC. PC-3 trató con 2 M de celastrol durante 24 h produjeron un aumento de 8 veces en el África sub-G
1 población (Fig. 3A). Además, celastrol inducida G
2 arresto /M (Fig. 3A) que era coherente con un informe anterior [29], lo que demuestra aún más el efecto de celastrol en la detención del ciclo celular. Celastrol también mejoró dramáticamente la actividad enzimática tanto de la caspasa-9 y la caspasa-3 en DU145, con la activación más fuerte (2,9 ± 0,4 veces para la caspasa-9 y 22,3 ± 3,5 veces para la caspasa-3, respectivamente,
P
& lt;. 0,001) a las 8 h post-tratamiento (figura 3B), lo que indica la amplificación de la cascada de caspasas en la vía apoptótica intrínseca. Celastrol PARP división inducida que podría ser revertido por el zVAD- inhibidor pan-caspasa, lo que demuestra la apoptosis es dependiente de caspasa (Fig. 3C). Curiosamente, celastrol fue demostrado que se acumulan simultáneamente y escindir la proteína anti-apoptótica de Mcl-1 a ​​una temprana (4 h) en lugar de una fase tardía (24 h) en PC-3 (Fig. 3C). Dicha observación fue consistente con la expresión de ubiquitina intracelular (Fig. 3C), lo que sugiere una regulación rápida y complejo de MCL-1 por el proteasoma-inhibidor. En DU145, se observó un fenómeno similar. MCL-1 de escisión que se produjo en la primera etapa (4-8 h) (Fig. 3D) se correlacionó con la activación de la caspasa (Fig. 3B). Además, la inducción de troceados de Mcl-1 se invirtió mediante zVAD (Fig. 3C), lo que indica que dicha escisión es mediada por caspasas. En contraste, se observó poco cambio de Bcl-2 (Fig. 3C), Bcl-xL o XIAP (datos no presentados), lo que sugiere que entre las proteínas Bcl-2 de la familia anti-apoptóticos, MCL-1 parece ser un importante objetivo de celastrol en las líneas celulares ensayadas

(a):. células PC-3 fueron tratados con celastrol durante 24 h y el ciclo celular se ensayó. población de células en cada fase del ciclo celular fue representado numéricamente. Los datos representan uno de los tres experimentos independientes. (B): células DU145 se trataron con celastrol (2 M) para los puntos de tiempo deseados. La actividad enzimática de la caspasa-9 y la caspasa-3 se determinó fluorométricamente.
Columnas
, media;

bares, SD (n = 3). (C): células PC-3 fueron tratados con celastrol con o sin 1 h de tratamiento previo del inhibidor de pan-capsase zVAD (2 M) para el análisis de transferencia Western. Actina se utilizó como control de carga. La muerte celular se detectó por exclusión de azul de tripano. (D): células DU145 se trataron con celastrol (2 M) para la transferencia de Western. La actina es un control de carga.

celastrol induce la apoptosis mediante la activación Noxa

Se ha demostrado que Noxa, una de sólo BH3 proteína pro-apoptótica, puede ser significativamente inducida por bortezomib [ ,,,0],30]. En el presente estudio, se investigó si Noxa también puede ser activado por celastrol. De hecho, celastrol indujo la expresión Noxa que era consistente con la activación de caspasa-3, PARP división y acumulación ubiquitina dependiente de la dosis en las células CL1 (Fig. 4A) y células PC-3 (Fig. 4B). Además, la inducción Noxa se produjo tan pronto como 2 h post-tratamiento, mucho más rápidamente que la caspasa-3 de activación y escisión de PARP en CL1 (Fig. 4C). En conjunto, estos datos sugieren que Noxa está fuertemente y rápidamente activada por celastrol, que puede ser responsable del efecto pro-apoptótico en células AIPC

(A):. Células CL1 se trataron con celastrol para 16 h. (B): células PC-3 fueron tratados con celastrol (2 M) para los puntos de tiempo indicados. (C): Las células se trataron con CL1 celastrol (2 M) durante 16 h. lisados ​​de células enteras fueron analizados por Western blot, con la actina como control de carga.

celastrol Suprime la NF-kB actividad constitutiva

Es bien sabido que los inhibidores del proteasoma, incluyendo celastrol, puede bloquear la actividad de NF-kB en diversos cánceres humanos [15]. En nuestro estudio, hemos probado si un resultado similar podría obtenerse en las células AIPC. En las células PC-3, celastrol bloqueado degradación I? B? Citosólica, así como la translocación nuclear de NF-KB de RelA proteína /p65, que muestra los efectos que excedieron MG132, un inhibidor del proteasoma ampliamente utilizado que se muestra para bloquear NF-kB de señalización [31] ( Fig. 5A). Del mismo modo, dependiendo de la dosis causada celastrol redistribución subcelular de NF-kB en las células DU145 (Fig. 5B). Por otra parte, al igual que MG132, celastrol inhibió la expresión de varios genes diana NF-kB que están involucradas en múltiples etapas de la progresión tumoral, incluyendo la proliferación (CXCL1, c-Myc y Ciclina D1), adhesión (ICAM-1), la migración ( CXCL1), invasión (MMP-9), y anti-apoptosis (BIRC2 /4/5, Bcl-2 y Bcl-xL) (. Tabla 1). El efecto inhibidor de NF-kB por celastrol se confirmó adicionalmente mediante el ensayo de indicador de luciferasa (datos no mostrados). Estos datos demuestran que celastrol puede suprimir la progresión AIPC impidiendo la actividad de NF-kappa B constitutiva

(A):. Células PC-3 fueron tratados con celastrol (2 M) o MG132 (10 M) durante 30 min. (B): células DU145 se trataron con celastrol (1 y 2 M) durante 30 min. Para ambos (A) y (B), se procesaron las células para el fraccionamiento subcelular. extracto citosólico (CE) se probaron para I? B? y extracto nuclear (NE) se sondeó RELA. Tubulina y PARP se utilizan como marcador y control de carga para CE y NE, respectivamente.

Efecto antitumoral de celastrol Involucra NF-kB Atenuación en PC-3 xenoinjertos

para determinar si la supresión de NF-kB podría contribuir a la regresión del tumor
in vivo
, evaluamos la eficacia celastrol en el modelo de xenoinjerto PC-3 establecido en la forma descrita anteriormente [26]. El tratamiento de celastrol (1 mg /kg) durante 3 semanas inhibió el crecimiento del tumor PC-3 (
P
& lt; 0,05) (Fig. 6A), con una toxicidad sistémica mínima [26]. El análisis histológico mostró que celastrol reduce las células y los microvasos CD31-positivo Ki67 positivas, y el aumento de células TUNEL positivas (Fig. 6B), lo que sugiere que celastrol disminuye la proliferación y la angiogénesis, e induce la apoptosis en los tejidos tumorales. Además, se demostró que I? B? Total de haber acumulado después del tratamiento (Fig. 6C). Además, la expresión de NF-kB genes diana que están involucrados en la proliferación (CXCL1), la angiogénesis (IL-8) y anti-apoptosis (BIRC2 y BIRC3) fue inhibida por celastrol en tumores (
P
& lt; 0,01 para CXCL1 y BIRC2;
P
. & lt; 0,001 para otros genes) (Fig 6D). Estos datos indican que la atenuación de NF-kB se correlaciona con la regresión del tumor PC-3 por celastrol
in vivo

(A):. Volumen del tumor se midió después del tratamiento celastrol. Se muestra el número de ratones en cada grupo. *,
P Hotel & lt; 0,05. (B): secciones de tumores se procesaron por anti-Ki67, TUNEL y tinción CD31 anti-ratón. Aumento original, × 400. (C): lisados ​​de células enteras (50 g) de los tejidos tumorales se sondaron con anticuerpo anti-I? B?. GAPDH se utilizó como control de carga. pliegue expresión era la relación de la expresión de I? B? en el grupo celastrol de control del vehículo. (D): análisis de qPCR de NF-kB expresión del gen diana en los tumores. El ARN total de los tejidos tumorales se extrajo para la transcripción inversa. cebadores de genes se mezclan con ADNc y SyberGreen por qPCR.
Columnas
, media;

bares, SD (n = 3). **,
P Hotel & lt; 0,01; ***,
P
. & Lt; 0,001

Discusión

En este estudio, hemos encontrado que celastrol, un inhibidor del proteasoma natural, suprime la progresión de la AIPC por la modulación de dos vías. En primer lugar, celastrol induce la apoptosis dependiente de caspasa mediante la regulación de la proteína anti-apoptótica MCL-1 y la activación de la proteína pro-apoptótica Noxa. En segundo lugar, mediante la prevención de la degradación de I? B?, Celastrol atenúa la actividad de NF-kappa B constitutiva y así anula el efecto inhibidor de NF-kappa B en la apoptosis, así como la promoción de la proliferación, angiogénesis, migración e invasión (Fig. 7). En general, estos datos dilucidar la eficacia potencial y el mecanismo de celastrol en el tratamiento de AIPC a través de la orientación del proteasoma.

bloques celastrol la función del proteasoma, lo que resulta en MCL-1 borde inducción noxa que desencadena la apoptosis. Al mismo tiempo, celastrol previene la degradación de I? B, conduciendo a la supresión de NF-kB. En general, celastrol interrumpe la proliferación celular AIPC, la migración, la invasión y la angiogénesis, e induce la apoptosis al impedir significativamente la actividad de NF-kappa B constitutiva.

Se ha demostrado que la función del proteasoma dysregulated se correlaciona con la progresión del tumor y la terapia resistencia en los cánceres humanos [32]. Hiperactivación de NF-kB se correlaciona con el fenotipo de la independencia de andrógenos y la resistencia a la terapia en AIPC [7], [33]. En las células PC-3, alta actividad de NF-kappa B constitutiva es, al menos en parte, el resultado de un alto nivel de actividad del proteasoma [34]. En el presente estudio, mostramos que celastrol inhibe no sólo de forma potente PC 3 de crecimiento, la migración, la invasión y la angiogénesis, sino que también induce la apoptosis que se asocia con NF-kB atenuación tanto
in vitro
y

in vivo. Este hallazgo sugiere que en AIPC, la supresión de NF-kB por la orientación del proteasoma es aplicable en la interrupción de la progresión del tumor, incluyendo el crecimiento primario y metástasis. Aunque se necesita más pruebas para delinear el papel de NF-KB en la regresión del tumor celastrol mediada, nuestro estudio actual revela que celastrol inhibe la expresión de genes múltiples impulsado por NF-kappa B que está implicado en el crecimiento y la metástasis AIPC. Nuestros resultados, en consonancia con otros [35], [36], demuestran que NF-kappa B es un mediador fundamental de la progresión de la AIPC, y celastrol, que funciona como un inhibidor del proteasoma activa natural, puede deteriorar significativamente la progresión de la AIPC.

MCL-1 es una proteína anti-apoptótica de la familia Bcl-2 que se degrada rápidamente por el proteasoma y, por lo tanto tiene una vida media corta (& lt; 3 h) [37]. Un número creciente de estudios propone que los inhibidores del proteasoma son capaces de revertir la función MCL-1 a través de la escisión de la molécula original por caspasas para generar una forma corta (26~28 kDa) que es pro-apoptótica, independientemente de la estabilización directa de toda la longitud de MCL-1 [38], [39]. Tal rápida rotación de MCL-1 pone de manifiesto la rápida respuesta de las células del cáncer una vez que se encuentran con el estrés del proteasoma, cambiar el fenotipo de la supervivencia celular a la muerte celular programada. En consonancia con bortezomib [38], [40], nos encontramos con que en la AIPC, celastrol también regula significativamente MCL-1 en una etapa temprana, paradójicamente, por la acumulación de la forma original anti-apoptótica, al mismo tiempo que la generación de la forma escindida pro-apoptóticos. A medida que las células experimentan apoptosis, finalmente, es razonable postular que escinde MCL-1 puede ser más importante en el control del comportamiento celular que se había informado anteriormente [41]. Esto se debe a MCL-1 división se produce junto con la activación de caspasas y antes de la escisión de PARP, mientras que aumentó intacta MCL-1 es más que un evento transitorio en respuesta a la inhibición del proteasoma. La inducción de la escindido MCL-1 puede ser parcialmente atenuado por el inhibidor de la caspasa, lo que sugiere que la inducción de este tipo es dependiente de caspasa. Curiosamente, escindidos niveles MCL-1 disminuyen en una etapa posterior, lo que es consistente con intacta MCL-1. Esto sugiere que incluso después de la escisión por las caspasas, el fragmento de Mcl-1 está todavía regulada por proteasomas. En conjunto, estas observaciones indican que en las células AIPC, MCL-1 es un objetivo clave de celastrol que exhibe una respuesta compleja por la inhibición del proteasoma.

Al igual que MCL-1, Noxa es otra proteína de la familia Bcl-2 que está fuertemente incrementado en la inhibición del proteasoma en diferentes tipos de cáncer, incluyendo el melanoma [30], [42] y el mieloma múltiple [39], [43]. Sin embargo, a diferencia de MCL-1, Noxa no es un sustrato directo del proteasoma [44]. En su lugar, Noxa ARNm se transcriptionally reforzada por un inhibidor del proteasoma [44], [45]. Noxa es un BH3-only pro-apoptótica funcionamiento proteína mitocondrial de la apoptosis [4], [22]. Tras el estrés, Noxa puede ser activado de una manera dependiente de p53 e interactuar con proteínas anti-apoptóticas, la supresión de este modo su efecto negativo en la apoptosis [46]. Nuestros resultados sugieren que la expresión Noxa se produce incluso antes de la activación del iniciador de la caspasa-9, que indica que es un mediador temprano de la apoptosis inducida por celastrol. Curiosamente, ninguna de las tres líneas celulares AIPC tiene p53 funcional (PC-3 y CL1: null p53; DU145: mutante p53). Así, la inducción Noxa por celastrol es independiente de p53. Cómo Noxa está regulada positivamente en un escenario deficientes en p53 no está claro. Sin embargo, como la inducción Noxa correlaciona con MCL-1 acumulación, y puesto que se informó del complejo MCL-1 /Noxa que aumentarse por bortezomib [39], los datos actuales indican que la función potencial de la Noxa inducida puede estar interactuando con Mcl- acumulado 1 y neutralizar su efecto anti-apoptótica. En conjunto, estos datos ponen de manifiesto que tanto Mcl-1 y exhiben Noxa eventos volumen de negocios rápidos y polifacéticos de la inhibición del proteasoma, y ​​la coordinación de celastrol de estos dos miembros de la familia Bcl-2 dará lugar a la apoptosis a través de la iniciación de la cascada de caspasas en AIPC.

en resumen, nuestros datos se describen los efectos antitumorales potentes de la tradicional celastrol inhibidor del proteasoma naturales sobre el cáncer de próstata independiente de andrógenos. El doble papel de celastrol, la modulación de ambas proteínas apoptóticas y NF-kB, garantiza que su consideración como un candidato potencial terapéutico en el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata hormono-refractario con constitutivamente activa NF-kB.

Apoyo a la Información Suplementaria
Tabla S1 ..
Los cebadores para PCR en tiempo real (humana)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0014153.s001 gratis (0.01 MB PDF)

Reconocimientos

queremos agradecer a Susan Harris para obtener ayuda con el manuscrito; El Dr. Arie Belldegrun en la Universidad de California - Los Angeles por la amabilidad de ofrecer la línea de células CL1; la Universidad de Michigan Comprehensive Cancer Center (UMCCC) Histología Core para obtener ayuda con el estudio inmunohistología; Unidad UMCCC de Medicina de Laboratorio Animal (ULAM) para obtener ayuda con los experimentos con animales, y la UMCCC citometría de flujo básico para el análisis de citometría de flujo.