Extracto
Antecedentes
Sí proteína asociada a (YAP) es un co-activador transcripcional y regula la proliferación celular y la apoptosis. Se investigó la significación clínica y biológica de YAP en el cáncer de endometrio (EMCA).
Métodos
expresión YAP en 150 tejidos tumorales primarias de pacientes con EMCA se evaluó mediante inmunohistoquímica y su asociación con los datos clínico-patológica se evaluó. Las funciones biológicas de YAP se determinaron en líneas celulares a través de EMCA knockdown /sobreexpresión de YAP. El papel de YAP en la modulación de la sensibilidad de radiación también se investigó en células EMCA.
Resultados
El aumento de la expresión nuclear de YAP se asoció significativamente con un mayor grado, estadio, invasión del espacio linfovascular, la recurrencia postoperatoria /metástasis y la supervivencia global de los estrógenos mediada EMCA, llamado tipo 1 del cáncer (p = 0,019, = 0,028, = 0,0008, = 0,046 y = 0,015, respectivamente). En el análisis multivariante, la expresión YAP nuclear fue confirmado como un factor pronóstico independiente de la supervivencia global en el tipo 1 EMCA. YAP desmontables de siRNA resultó en una disminución significativa en la proliferación celular (p & lt; 0,05), el crecimiento dependiente de anclaje (p = 0,015) y la migración /invasión (p & lt; 0,05), y un aumento significativo en el número de células en G0 /G1 fase (p = 0,002). Por el contrario, la sobreexpresión YAP promovió la proliferación celular. ensayo clonogénico demostró una mayor radiosensibilidad en aproximadamente un 36% en YAP inhibe células.
Conclusiones
Dado que las funciones de YAP como un co-activador transcripcional, su localización diferencial en el núcleo de las células cancerosas y la posterior impacto en la proliferación de células podría tener consecuencias importantes con respecto a su papel como un oncogén en EMCA. YAP expresión nuclear podría ser útil como indicador de pronóstico o diana terapéutica y predecir sensibilidad a la radiación en pacientes con EMCA
Visto:. Tsujiura M, Mazack V, Sudol M, Kaspar HG, J Nash, Carey DJ, et al . (2014) asociada a la proteína Sí (YAP) Modula Características oncogénicos y sensibilidad a la radiación en el cáncer endometrial. PLoS ONE 9 (6): e100974. doi: 10.1371 /journal.pone.0100974
Editor: Hong Wanjin, Instituto de Biología Molecular y Celular, Biopolis, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Febrero, 2014; Aceptado: 1 de junio de 2014; Publicado: 27 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Tsujiura et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los fondos para trabajo realizado en esta publicación era de subvención SRC-075 Fondo de Investigación Clínica, Geisinger Medical Center y la Fundación del cáncer de arroz. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de endometrio (EMCA) es el cuarto cáncer más común y la cáncer ginecológico más común en las mujeres estadounidenses, con aproximadamente 8200 muertes y 49500 casos nuevos en los Estados Unidos en 2013 [1]. Mientras que las mujeres con EMCA generalmente tienen un buen pronóstico con 81,5% de supervivencia a los 5 años (2003-2009), la tasa de incidencia y muerte de EMCA han seguido aumentando en promedio 1,1% y 0,4%, respectivamente, cada año durante los últimos 10 años [2 ]. Se han considerado los recientes aumentos en la incidencia de las tasas de cáncer de endometrio en gran parte atribuido a la epidemia de obesidad [3]. A pesar de las mejoras en las técnicas de diagnóstico y control perioperatorio han dado lugar a un aumento en la detección precoz de la EMCA y pronóstico favorable, las mujeres diagnosticadas con enfermedad avanzada o recurrente tienen tasas de supervivencia mucho peores y las opciones de tratamiento adyuvante limitados. estudios de expresión génica han identificado algunos genes que se expresan diferencialmente en EMCA, como
PTEN
,
KRAS
,
CTNNB1
,
PIK3CA
y
FGFR2
[4], [5], [6], [7]. En el ámbito clínico, sin embargo, algunas moléculas se han ensayado como terapéutico y /o biomarcadores de diagnóstico. Por lo tanto, la identificación de marcadores biológicos y sus objetivos de abajo es esencial para la personalización de las terapias y mejorar el resultado y la calidad de vida en pacientes con EMCA.
EMCA ha sido clasificado en dos tipos. Tipo 1 El cáncer de aproximadamente el 80% de EMCA y se caracteriza como el estrógeno dependiente, receptor de estrógeno (ER) y receptor de progesterona (PR) positiva con morfología endometrioide y generalmente un pronóstico favorable [8]. Por el contrario, el cáncer de tipo 2 es el estrógeno-independiente, ER /PR negativo, pobremente diferenciado y se asocia con un pronóstico mucho más pobre [9]. La terapia estándar para ambos tipos incluye una extirpación quirúrgica del útero, cuello del útero, trompas de Falopio y los ovarios bilaterales. Los pacientes cuyos tumores demostrar características de alto riesgo pueden sufrir, además, la linfadenectomía. EMCA en fase inicial con características de alto riesgo, tales como la invasión miometrial profunda, la invasión linfovascular espacio (LVSI) y alto grado se asocia con un riesgo de recurrencia de 15-25% [10]. La radioterapia adyuvante, la forma más común de la terapia para los pacientes de alto riesgo en fase inicial, se ha encontrado en varios estudios para disminuir la recurrencia pélvica y vaginales de 12-14% sin tratamiento al 3-4% con el tratamiento, pero aún sin un aumento correspondiente en la supervivencia general [11], [12]. En otras palabras, la radioterapia expone a un gran número de mujeres a la toxicidad sin ningún beneficio claro en la mortalidad general, sobre todo la mayoría de los pacientes que van a estar libres de la enfermedad en ausencia de terapia adicional. La radioterapia también se utiliza para los pacientes no tratados previamente con recurrencia local /regional. Sin embargo, a pesar de la radiación, el 50% de los pacientes con recidiva local en última instancia, morir de su enfermedad [13], lo que implica que estos pacientes tienen tumores resistentes a la radiación y pueden haber beneficiado de un tratamiento alternativo, como la quimioterapia. La identificación de marcadores de la sensibilidad a la radiación /resistencia permitiría terapia adaptada al régimen más eficaz y disminuir la toxicidad inducida por la radiación innecesaria
.
proteína asociada Sí-(YAP) se identificó primero en virtud de su capacidad para asociarse con Sí y Src quinasas de proteína-tirosina [14]. El
YAP
gen se localiza en el cromosoma humano 11q22, codifica un co-activador transcripcional y es uno de los dos principales efectores de la vía supresora tumoral hipopótamo [15]. La inhibición de la vía de Hipona conduce a la activación de YAP, localización nuclear y el aumento de la actividad transcripcional de los genes diana, como
CTGF
y
AREG
[16], [17]. Por el contrario, la activación de la vía de Hippo conduce a la fosforilación YAP, secuestro citoplásmica y la inactivación. La serina YAP 127 a alanina mutante (S127A) es una forma constitutivamente activa que permanece en el núcleo y es transcripcionalmente activo. YAP regula el equilibrio entre la proliferación celular y la apoptosis [18], [19], [20], y se amplifica en una serie de tumores malignos humanos incluyendo cáncer de mama, de esófago, hepatocelular, ependimoma, mesotelioma maligno y meduloblastoma [21], [22] , [23], [24], [25], [26]. Además, la expresión YAP se correlaciona con mal pronóstico en varios tipos de cáncer, como el colorrectal, de esófago, gástrico, hepatocelular, de pulmón y de ovario [22], [27], [28], [29], [30], [31], [32], España
también es diafonía entre YAP y hormonas esteroides. Dhananjayan et al. demostraron que YAP y el dominio de unión a proteínas WW-2 (WBP-2) son co-activadores de ER y PR [33], que desempeñan un papel clave en el ciclo menstrual normal y en la etiología de tipo 1 EMCA. Aunque varios informes demostraron oncogénico funciones de YAP en diversos cánceres humanos, su relevancia biológica y clínica en EMCA sigue sin estar clara. Además, la sobreexpresión promueve YAP radioresistance en las células de meduloblastoma a través del /IGF-2 /Akt YAP [34], lo que sugiere YAP puede funcionar en la modulación de sensibilidad a la radiación /resistencia. Esos resultados nos insta a investigar más a fondo si YAP podría desempeñar un papel en la oncogénesis y el desarrollo de la EMCA y la modulación de la sensibilidad a la radiación.
En el presente estudio, se investigó la utilidad potencial de YAP como indicador pronóstico y terapéutico en EMCA y la función biológica de YAP en EMCA. Además, se evaluó el efecto YAP respecto sensibilidad a la radiación. En consecuencia, nuestros datos proporcionan evidencia de que la expresión YAP nuclear es un marcador de mal pronóstico y pueden tener implicaciones terapéuticas para el tratamiento de pacientes con EMCA.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras de tejidos
el estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional de Geisinger Medical Center (Centro Médico Geisinger Protocolo IRB#2.011 hasta 0163) y una renuncia de consentimiento se obtuvo del Centro de IRB para llevar a cabo el estudio. Un total de 150 tejidos EMCA primarios se obtuvieron de pacientes que se sometieron a una histerectomía en Geisinger Medical Center entre 2008 y 2011, incluyendo 120 casos de tipo 1 EMCA y 30 casos de tipo 2 EMCA. La información demográfica y pronóstico, incluyendo la edad, índice de masa corporal (IMC), grado, estadio, LVSI y la supervivencia de datos se obtuvo de todos los sujetos. clasificaciones macroscópicas y microscópicas de los tumores se basaron en la Federación Internacional de Ginecólogos y Obstetras (FIGO) [35], [36].
La inmunohistoquímica
muestras de tejidos embebidos en parafina se cortaron a una espesor de 5 micras y se sometieron a tinción inmunohistoquímica de la proteína YAP con el método de avidina-biotina-peroxidasa. La recuperación del antígeno se llevó a cabo por calentamiento de las muestras en tampón de citrato (pH 6,0) durante 5 minutos en potencia alta, de 10 minutos de media potencia, con un horno de microondas. Los portaobjetos se enfrió y se enjuaga en agua destilada, y se tiñeron usando el DAKO Autostainer como sigue: Los portaobjetos se incubaron en 3% de peróxido de hidrógeno de 5 minutos con el enjuague posterior en tampón TBST. Las muestras se incubaron entonces en el anticuerpo YAP (1:200, NB110-58358) de Novus Biologicals, (Littleton, CO) durante 30 minutos con un lavado posterior TBST y se incubaron en solución de conejo Dako Envision + HRP (Dako, Carpinteria, CA) (diluido de acuerdo las instrucciones del fabricante) durante 30 minutos. Después de un lavado TBST, los portaobjetos se incubaron a continuación en solución DAB Dako durante 10 minutos y se aclararon de nuevo con tampón TBST. Las diapositivas fueron counterstained como sigue: 20 segundos de incubación en las branquias hematoxilina mancha, seguido de un lavado con agua del grifo. Los portaobjetos se deshidrataron y después se seca al aire, y las muestras fueron montadas en medio de montaje. Se evaluaron las diapositivas Immunostained tanto para la tinción glandular nuclear y citoplasmática de YAP por un patólogo ginecológica, (HK), anotando para la intensidad del uso de un punto 5 (0 a 4) escala.
líneas celulares EMCA
tres de tipo 1 humano líneas celulares EMCA, HEC-1-a, HEC-1-B y Ishikawa, se utilizaron en este estudio. HEC-1-A (ATCC HTB112) y HEC-1-B (ATCC HTB113) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Ishikawa células fueron proporcionados por el Dr. Jennifer Richer (Universidad de Colorado) [37], [38], [39]. HEC-1-A se cultivó en medio 5A de McCoy (ATCC, Manassas, VA) suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), HEC-1-B en Eagle de medio esencial mínimo (EMEM) (ATCC, Manassas, VA) suplementado con 10% (v /v) de FBS y Ishikawa en medio mínimo esencial (MEM) (Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado con aminoácidos no esenciales al 1% ( NEAA), 6 ng /ml de insulina y 5% (v /v) de FBS. Se añadieron antibióticos (10 unidades /ml de penicilina y 10 g /ml de estreptomicina) a todos los medios de cultivo. Todas las líneas celulares se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de dióxido de carbono.
análisis de transferencia de Western
Las células se lisaron en tampón Tris (10 mmol /l, pH 7,4) que contiene 5 mmol /l EDTA, 300 mmol /l de NaCl, 10% de glicerol, 1% Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS y un cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) y se sometieron a SDS-PAGE . anticuerpo anti-YAP (NB110-58358) se adquirió de Novus Productos Biológicos (Littleton, CO); anti-fosfo-YAP (ser127) (# 4911) de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA); anti-NF-2 (SC-331) de Santa Cruz; anti-LATS2 (ab70565) y anti-GAPDH (ab9485) de Abcam (Cambridge, Reino Unido). rábano picante apropiada anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (anti-conejo /ratón, GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) se utilizaron. Las bandas de proteínas se visualizaron con un sustrato de quimioluminiscencia (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) y detectado usando LAS-3000 (Fujifilm, Tokio, Japón).
inmunofluorescencia e imágenes
Las células cultivadas se lavaron con PBS y se fijaron en 4% (w /v) de paraformaldehído. Después de la permeabilización con 0,2% Triton X-100 en PBS, las células se bloquean en 5% (w /v) de suero de cabra en PBS y se incubaron con el anticuerpo primario (YAP, 1:500) a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de Alexa Fluor 488 de cabra anti conejo (1:500) como anticuerpo secundario durante 30 min a temperatura ambiente. Después de ser montado con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la tinción de núcleo, las células se examinaron usando un microscopio de fluorescencia (Olympus IX81, Olympus, Tokio, Japón).
ARN corto de interferencia (siRNA ) de tratamiento
el siRNA dirigidos a la
YAP
gen (sc-38637; se utilizó Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) para los experimentos de pérdida de función. El control de siRNA (sc-37007; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) se utilizó como control negativo. Cada siRNA (37,5 nM) se transfectó en células EMCA utilizando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. La caída de un gen diana se verificó por Western Blot.
proliferación de las células de ensayo
El número de células viables en varios puntos de tiempo después de la transfección de siRNAs fueron evaluados por una sal de tetrazolio soluble en agua colorimétrico ensayo (kit de recuento de células-8; Dojindo, Kumamoto, Japón). como se describe en otro lugar [40]
Soft agar ensayo
Para el ensayo in vitro de desarrollo de la colonia independiente de anclaje, 5000 células transfectadas con siRNAs de 48 horas se cultivaron en 1 ml de 0,4% de agar fundido en EMEM con 10% (v /v) de FBS en placas de 6 pocillos cubrieron con 1,5 ml de 0,9% de agar fundido en el mismo medio. Las placas se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de dióxido de carbono. Revestimiento del se realizó por sextuplicado y una pequeña cantidad de EMEM medio completo se añadió cuidadosamente cada pocos días en la parte superior de cada pocillo para garantizar el suministro nutritivos y para evitar que se seque. Después de la incubación durante aproximadamente cuatro semanas, las células se fijaron y tiñeron con una solución que contiene 2% de etanol y 0,03% de cristal violeta y el número de colonias se evaluó por dos investigadores independientes cegados.
Invasion y Migración Los ensayos
migración Transwell y ensayos de invasión se llevaron a cabo utilizando 24 pocillos insertos de cultivo celular BioCoat (BD, Franklin Lakes, NJ). La superficie superior de los filtros de 6,4 mm de diámetro con poros de 8 micras poros se recubrió previamente con (ensayo de invasión) o sin (ensayo de migración) revestimiento de matriz extracelular (Matrigel). 50.000 células siRNA transfectadas en medio libre de suero se sembraron en a la cámara superior de cada inserción, con medio completo añadido a la cámara inferior. Después de 24 h de incubación, migran o células invasoras en la superficie inferior de los filtros se fijaron y se tiñeron con el kit de diferencial Quik (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), y el número de células teñidas que habían migrado /invadido a la parte inferior del filtro se contaron directamente por dos investigadores independientes ciego.
análisis del ciclo celular
Para el análisis de citometría de flujo, las células se trataron con tripsina 72 o 96 horas después de la transfección de siRNAs, seguido de incubación en una tinción tampón (0,1% de Triton X-100, 0,2 mg /ml de RNasa a, y 40 g /ml de yoduro de propidio en PBS). Las células se analizaron para el contenido de ADN usando Beckman Coulter, Cytomics FC 500 (Brea, CA).
Las construcciones de expresión y la formación de colonias de ensayo
plásmidos que expresan de tipo salvaje YAP (pEGFP-C3-WT YAP) se obtuvieron mediante la clonación de la secuencia de codificación completa de YAP con 504 aminoácidos [41] en el vector pEGFP-C3 (un regalo de Gregory Matera y Channing Der, Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, Carolina del Norte). S127A forma mutante de YAP (pEGFP-C3-S127A-YAP) se generó a través de mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR de pEGFP-C3-WT-YAP. pEGFP-C3-WT-YAP, pEGFP-C3-S127A-YAP o el vector vacío (pEGFP-C3-EV) como control se introdujo en células EMCA utilizando Lipofectamine LTX y el reactivo Plus (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. La expresión de la proteína YAP en las células transfectadas se confirmó por Western Blot. Después de la incubación durante aproximadamente cuatro semanas, con concentraciones apropiadas de G418, las células se fijaron y tiñeron con una solución que contiene 10% de formaldehído y 1% de cristal violeta. La zona manchada se calculó por densitometría usando software ImageJ. Condiciones
ensayo clonogénico y de irradiación
exposición de supervivencia después de la radiación se define como la capacidad de las células para mantener su capacidad clonogénico. En pocas palabras, el número de células transfectadas con el ARNsi de control o siRNA YAP-específica durante 48 horas cada vez mayor se sembraron en placas de 6 pocillos. Las células se irradiaron con 0-6 Gy usando un acelerador lineal y se devuelven a la incubadora durante varias semanas hasta que las células en pocillos de control se habían formado suficientemente grandes colonias. Las colonias formadas se fijaron y tiñeron con una solución que contiene 10% de formaldehído y 1% de cristal violeta y aquellos con al menos 50 células se contaron por dos investigadores independientes ciego. El número de colonias obtenidas a partir de tres réplicas se promedió para cada condición. Estos valores medios se corrigieron según chapado eficiencia de los controles respectivos para calcular la supervivencia celular para cada nivel de dosis. La ecuación cuadrática lineal fue ajustado a los conjuntos de datos para generar curvas de supervivencia, y el factor de aumento de dosis se calculó en un 10% la fracción superviviente (DEF 0,1).
El análisis estadístico
Las correlaciones entre el núcleo /citoplasma de coloración niveles y factores clínico-patológicos fueron evaluados mediante la prueba t de Student, la prueba de Chi cuadrado o la prueba de Fisher en consecuencia. El Mann-Whitney
T-test
y la prueba t de Student se utilizó para comparar la diferencia en el comportamiento biológico entre las células transfectadas y las células de control. Para el análisis de supervivencia, las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se construyeron para los grupos en función de predictores univariados y diferencias entre los grupos fueron evaluados con la prueba de log-rank. Para aquellas variables que son estadísticamente significativas en el análisis univariado, se utilizó el modelo de riesgos proporcionales de Cox con la prueba de razón de verosimilitud para una evaluación adicional de análisis de supervivencia multivariante. Valor de p & lt; 0,05 fue considerado significativo. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando JMP 10 (SAS Institute Inc., Cary, NC).
Resultados
YAP expresión de la proteína en los tejidos primarios EMCA
Para determinar si se expresa YAP en EMCA humano, la expresión de proteínas en los tejidos YAP EMCA primarios se evaluó por inmunohistoquímica. micrografías representativas que demuestran la expresión YAP nuclear y citoplásmica se muestran en la Figura S1. Dado que la localización intracelular de YAP se considera generalmente como importante para su función oncogénica [42], tanto los niveles de tinción nucleares y citoplasmáticas se analizaron y obtuvo para la intensidad usando una escala de 5 puntos (0 a 4). Los datos demográficos y los niveles de tinción de YAP que comparan el tipo 1 y 2 EMCA se resumen en la Tabla 1. Tipo 2 EMCA tenía superior etapa, una mayor frecuencia de LVSI y postoperatoria metástasis /recurrencia, y la expresión YAP nuclear mayor en comparación con el tipo 1 EMCA. Seguidamente, evaluó la correlación entre los factores clínico-patológicos y tinción YAP en el tipo 1 y tipo 2 EMCA, de forma individual. Como se muestra en la Tabla 2, la expresión más alta YAP nuclear se asoció significativamente con un mayor grado, estadio patológico, LVSI y postoperatoria recurrencia /metástasis en el tipo 1 EMCA (p = 0,019, 0,028 =, = 0,0008, = 0,046, respectivamente). No se observó ninguna asociación significativa entre la expresión YAP nuclear y estas variables en el tipo 2 EMCA (Tabla S1). la expresión citoplasmática de YAP no se asoció con factores clínico-patológicos en cualquiera de los cánceres de tipo 1 o tipo 2 (datos no mostrados). las estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier mostró que el aumento de la inmunoreactividad nuclear de YAP se asoció significativamente con una peor supervivencia global en el cáncer de tipo 1. (P = 0,015, prueba de log-rank, Figura 1). El análisis univariante indicó etapa avanzada y la presencia de LVSI también correlacionado con una pobre supervivencia global (p = 0,0005 y 0,003, prueba de log-rank, respectivamente, la figura S2). No hubo correlación entre la supervivencia global y YAP tinción citoplasmática en el tipo 1 o EMCA YAP nuclear /citoplasmática mancha de tipo 2 EMCA (Figura S3). Mediante análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox multivariado que considera el escenario, y el nivel LVSI YAP nuclear, único nivel YAP nuclear (2/3/4 anotar frente a anotar 0/1) se asoció de forma independiente con la supervivencia global (p & lt; 0,021). Nuestros datos demuestran que YAP nuclear se asocia con características de mal pronóstico y la disminución de la supervivencia global en el Tipo 1 EMCA.
El aumento de inmunoreactividad nuclear de YAP se asoció significativamente con peor supervivencia global (p = 0,015, prueba de log-rank).
YAP expresión de la proteína en las líneas celulares EMCA
para obtener una mayor comprensión de las funciones biológicas de YAP en EMCA, se optó por utilizar tres tipos de células 1 EMCA líneas; HEC-1-A, HEC-1-B y Ishikawa. En primer lugar, evaluamos los niveles de proteína de YAP y fosfo-YAP (inactivo YAP) (Figura 2A). HEC-1-B demostró los más altos niveles de YAP total y muy bajos niveles de fosfo-YAP inactiva por Western Blot. Por el contrario, HEC-1-A expresa los niveles más bajos del total YAP y los más altos niveles de fosfo-YAP inactiva. Inmunofluorescencia confirmó altos niveles de YAP nuclear y citoplasmática en HEC-1-B células y los bajos niveles de YAP nuclear y citoplasmática en las células HEC-1-A, de acuerdo con los resultados de transferencia Western (Figura 2B). Por lo tanto, se utilizaron células HEC-1-B para un experimento de la pérdida de la función, y se utilizaron células inversa HEC-1-A para un experimento de ganancia de función.
(A) Expresión de YAP y fosfo-YAP (Ser127) en tres líneas celulares EMCA por Western Blot. (B) Inmunofluorescencia tinción citoquímica de YAP endógena utilizando anti-anticuerpo YAP (YAP: verde, DAPI: azul).
YAP desmontables en las células EMCA
Para extender nuestros resultados inmunohistoquímicos demostrando una correlación entre YAP nuclear y características de mal pronóstico en pacientes EMCA, que determina los efectos de YAP caída sobre la proliferación celular utilizando YAP-siRNA (siYAP) y el control de siRNA (siCont) en las células de la EMCA HEC-1-B. la expresión endógena de la proteína YAP se inhibió de manera eficiente a las 72 y 96 horas después de la transfección transitoria de siRNA (Figura 3A). La proliferación celular se redujo significativamente en las células inhibidas YAP en comparación con las células de control de 26,2% (72 horas) y 42,9% (96 horas), respectivamente (Figura 3A). Este efecto inhibidor de crecimiento similar en la proliferación celular se confirmó usando una secuencia de siRNA YAP alternativo (datos no mostrados).
(A) expresión de la proteína inhibido de YAP por YAP-siRNA (siYAP) se confirmó mediante transferencia de western tanto 72 y 96 horas después de la transfección (izquierda). Se evaluó el número de células viables entre 24-96 horas después de la transfección de siYAP o control siRNA (siCont) en las células HEC-1-B utilizando el ensayo de sal de tetrazolio soluble en agua (recuento de células Kit-8) (derecha). 26,2% y 42,9% de inhibición de la proliferación celular se confirmaron por desmontables de expresión YAP a las 72 y 96 horas, respectivamente. (* P & lt; 0,05 (la prueba U de Mann-Whitney)). Los resultados se muestran en medias ± desviaciones estándar (barras) en los experimentos por cuadruplicado. Se obtuvieron tendencias similares en otros dos experimentos independientes. (B) El número de colonias en agar blando se comparó entre el YAP inhibe las células y las células de control para evaluar el crecimiento celular independiente del anclaje en las células HEC-1-B. imagen representativa de colonias formadas en agar blando (izquierda). El análisis cuantitativo en el número de colonias formadas (derecha), que muestran una disminución significativa en las células transfectadas siYAP. (* P & lt; 0,05 (la prueba U de Mann-Whitney)). Columnas y barras representan las medias y desviación estándar en los experimentos sextuplicado. Se obtuvieron tendencias similares en otro experimento independiente. (C) Transwell migración y la invasión de ensayo. imagen representativa de emigrado /invadió las células HEC-1-B (izquierda). El análisis cuantitativo en el número de células migradas /invadido (derecha), que mostró una disminución significativa en las células transfectadas siYAP. (* P & lt; 0,05 (la prueba U de Mann-Whitney)). Columnas y barras representan las medias y desviación estándar en los experimentos por cuadruplicado. Se obtuvieron tendencias similares en otro experimento independiente. Análisis de citometría de (D) de flujo. Los resultados representativos de la población en cada fase del ciclo celular en las células EMCA HEC-1-B 72 y 96 horas después de la transfección con siCont /siYAP (izquierda). El análisis cuantitativo de la población en cada fase (derecha). Las células transfectadas siYAP mostraron una significativa acumulación de células en la fase G0 /G1 y disminuciones significativas en S y G2 fases /M a las 72 y 96 horas (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,001, prueba de la t de Student). Columnas y barras representan las medias y desviación estándar de tres experimentos. Se obtuvieron tendencias similares en otro experimento independiente.
También determina el papel de YAP en el crecimiento independiente de anclaje celular, la migración y la capacidad de invasión, comúnmente consideradas características de las células transformadas malignas. En los ensayos de formación de colonias en agar blando, desmontables de YAP en células de HEC-1-B disminución de la capacidad de formación de colonias en comparación con las células control (p = 0,015, Figura 3B). En la migración de células /ensayos de invasión, se observó una disminución significativa en el número de células que migraron /invadido a través de membranas no recubiertas /recubrimiento de Matrigel en las células transfectadas siYAP comparación con las células transfectadas siCont (P & lt; 0,05, Figura 3C). Estos experimentos demuestran que la expresión YAP se asocia con la proliferación celular, el crecimiento independiente de anclaje y la migración /invasión potencial en esta línea celular EMCA.
Análisis del ciclo celular en las células EMCA
Para determinar si la inhibición del crecimiento inducidos por YAP knockdown causaron alteraciones en el ciclo celular, análisis de citometría de flujo se realizó en células EMCA HEC-1-B transfectadas con siRNAs YAP-específicos y de control. En consonancia con los resultados de los ensayos de proliferación celular, siYAP células tratadas HEC-1-B mostraron una acumulación significativa de células en la fase G0 /G1 y disminuciones significativas en S y G2 fases /M a las 72 y 96 horas, en comparación con siCont células tratadas (Figura 3D). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la caída YAP produce la detención del ciclo celular G0-G1 en esta línea celular EMCA.
sobreexpresión en las células YAP EMCA
En base a los resultados de la función de pérdida de ensayos, la hipótesis de que la sobreexpresión de YAP en las células EMCA con bajos niveles endógenos de YAP aumentaría la proliferación celular. Hemos investigado la posibilidad de colonias que forman después de la transfección transitoria de YAP construcciones que expresan en células de HEC-1-A, que presentaban niveles relativamente bajos de YAP y altos niveles de fosfo-YAP (Figura 2). La sobreexpresión de tipo salvaje GFP-etiquetados YAP y GFP-etiquetados S127A mutante constitutivamente activa en células YAP HEC-1-A fue verificado por el Western Blot (Figura 4A). Las células que sobreexpresan WT-YAP o S127A-YAP producen significativamente más colonias en comparación con las células transfectadas con el vector vacío de control (EV). Mientras S127A-YAP transfectaron células producidas las mayoría de las colonias, una diferencia significativa no se observó en comparación con WT-YAP células (Figura 4B) transfectadas. Estos resultados apoyan aún más el papel de YAP en la proliferación celular de la EMCA.
(A) expresión endógena de YAP (aproximadamente 65 kDa) y la expresión exógena de YAP etiquetado con proteína GFP (aproximadamente 92 kDa en total) en HEC células -1-a transfectadas con el tipo salvaje YAP (WT-YAP) y S127A mutante YAP (S127A-YAP). (B) Imagen representativa del ensayo de formación de colonias (izquierda). Las células fueron transfectadas transitoriamente con el vector vacío (EV) /WT-YAP /S127A-YAP y seleccionados con concentraciones apropiadas de G418 durante cuatro semanas. Las colonias resistentes a los fármacos formados por las células transfectadas con YAP fueron significativamente más numerosos en comparación con el control (la prueba U de Mann-Whitney). Columnas y barras representan las medias y desviación estándar en los experimentos por cuadruplicado. Se obtuvieron tendencias similares en otro experimento independiente.
Papel de YAP en la modulación de sensibilidad a la radiación
Dada la importancia de la radioterapia en el tratamiento EMCA y publicado recientemente datos que implican YAP en la modulación de la radiación sensibilidad de las células de meduloblastoma, se determinó el efecto de la próxima YAP sobre la sensibilidad a la radiación en las células EMCA usando un ensayo de supervivencia clonogénico. Desmontables de expresión YAP por siRNA redujo la supervivencia clonogénico en células de HEC-1-B, lo que resulta en un aumento de la sensibilidad a la radiación con una DEF 0,1 de 1,36 (Figura 5). Específicamente, 90% de destrucción celular mediante la exposición a la radiación en las células transfectadas siYAP requiere 3,48 Gy, mientras que el mismo nivel de muerte celular en las células transfectadas siCont requiere 4,72 Gy. Por lo tanto, nuestros resultados demuestran un aumento de la sensibilidad a la radiación con la pérdida de expresión en las células YAP EMCA HEC-1-B.
Desmontables de expresión YAP por siRNA redujo la supervivencia clonogénico en células de HEC-1-B, lo que resulta en una aumento de la sensibilidad a la radiación con un factor de aumento de dosis en 10% de supervivencia (DEF 0,1) de 1,36. Los resultados se muestran en las medias ± desviaciones estándar (barras) en experimentos por triplicado. Se obtuvieron tendencias similares en otros tres experimentos independientes.
Discusión
Nuestros datos identifican las funciones oncogénicas de YAP en EMCA. La vía de Hipona, en especial el regulador de aguas arriba directa, LATS1 /2, modula negativamente la actividad YAP por la fosforilación de su sitio S127. Fosforilada-YAP se segrega en el citoplasma y destinada a la proteólisis mediada por ubiquitina [43], [44]. Por lo tanto, la localización subcelular de YAP se ha considerado crucial en la determinación de sus funciones biológicas en diversos tipos de cáncer [42]. expresión YAP Nuclear como un pobre marcador pronóstico se ha demostrado en otros tipos de cáncer, como el esófago, gástrico y de ovario [22], [28], [31], [32]. Nuestros estudios inmunohistoquímicos demostraron que los niveles más altos de YAP nuclear se asociaron con factores de mal pronóstico, como la fase avanzada, grado, LVSI, la recurrencia postoperatoria /metástasis y la supervivencia global.