Extracto
Antecedentes
marcadores actuales para el cáncer de próstata, tales como PSA carecen de especificidad. Por lo tanto, se necesitan nuevos biomarcadores. Desafortunadamente, la complejidad de los fluidos del cuerpo a menudo dificulta el descubrimiento de biomarcadores. Un enfoque alternativo atractivo es el aislamiento de pequeñas vesículas, es decir, los exosomas, ~ 100 nm, que contienen proteínas que son específicas para el tejido del que se derivan y por lo tanto pueden ser consideradas como cofres de tesoro para el descubrimiento de biomarcadores específicos de la enfermedad.
Materiales y Métodos
exosomas se aislaron a partir de 2 células inmortalizadas de próstata primario epiteliales (PNT2C2 y RWPE-1) y 2 líneas de células de CaP (PC346C y VCAP) por ultracentrifugación. Después de la digestión tríptica, análisis proteómicos utilizó un nanoLC junto con un LTQ-Orbitrap que opere en modo tándem MS (MS /MS). Se empleó Masa exacta y estrategia de etiquetas de Tiempo (AMT) para la identificación y cuantificación de péptidos. biomarcadores candidatos fueron validados por Western Blot e inmunohistoquímica.
Resultados
caracterización proteómica como resultado la identificación de 248, 233, 169, y 216 proteínas por al menos 2 péptidos en los exosomas de PNT2C2, RWPE -1, PC346C, y VCAP, respectivamente. Los análisis estadísticos revelaron 52 proteínas abundantes diferente entre células de CaP y de control, de las cuales 9 eran más abundantes en el CaP. Validación mediante transferencia Western confirmó una mayor abundancia de FASN, XPO1 y PDCD6IP (ALIX) en exosomas CaP.
Conclusiones
Identificación de proteínas de alto rendimiento utilizando exosomal LC-FTMS dio como resultado el descubrimiento de PDCD6IP , FASN, XPO1 y ENO1 como nuevos biomarcadores candidatos para el cáncer de próstata
Visto:. Duijvesz D, Burnum-Johnson KE, Gritsenko MA, Hoogland AM, Vredenbregt-van den Berg MS, Willemsen R, et al. (2013) proteómico de perfiles de exosomas conduce a la identificación de nuevos biomarcadores para el cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (12): e82589. doi: 10.1371 /journal.pone.0082589
Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 16 Julio, 2013; Aceptado: 25 Octubre 2013; Publicado: 31 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Duijvesz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
antígeno prostático específico (PSA) es una utilidad clínica. biomarcadores de proteínas para el diagnóstico y el seguimiento después del tratamiento para el cáncer de próstata (CaP). Sin embargo, el cribado basado en PSA ha demostrado tener un alto riesgo de sobrediagnóstico y sobretratamiento porque carece de especificidad [1], [2]. Con el fin de diferenciar con mayor precisión entre las enfermedades benignas de la próstata y (diferentes formas) de CaP, a evitar las biopsias de próstata innecesarias, y apoyar el urólogo la hora de recomendar un tratamiento óptimo, se necesitan urgentemente nuevos biomarcadores moleculares.
En las últimas décadas , una enorme cantidad de investigación se ha realizado para encontrar nuevas y mejores biomarcadores para el CaP, a menudo utilizando tecnologías de espectrometría de masas del estado de la técnica, pero el descubrimiento de nueva proteína de baja abundancia general, se ha obstaculizado por la complejidad de suero u orina [3]. Aislamiento de exosomas de fluidos corporales representa un enfoque atractivo para eludir estas limitaciones y permitir la detección del candidato (poco abundantes) biomarcadores.
Los resultados recientes en la búsqueda de nuevos biomarcadores han revelado que los exosomas pequeños (50-150 nm) , están presentes en suero y orina [4]. Mediante el aislamiento de exosomas de los fluidos del cuerpo que debe ser posible superar el reto de rango dinámico y facilitar la caracterización de las proteínas del tejido /derivados del cáncer que pueden representar con mayor precisión las condiciones celulares. Por lo tanto exosomas podrían ser útiles para determinar las características individuales del tumor [5], [6].
En este estudio, nuestro objetivo fue determinar la presencia y la importancia de las proteínas exosomal como nuevos biomarcadores candidatos para CaP mediante la comparación de los exosomas líneas celulares de próstata no cancerosas a exosomas de líneas celulares de PCA.
Materiales y Métodos
cultivo de células y aislamiento
Dos líneas de células epiteliales de próstata humanos inmortalizada (PNT2C2 [7] y RWPE-1) y dos líneas celulares de CaP (PC346C [8] y VCAP [9]) se cultivaron en 10 T175 (175 cm
2) frascos de cultivo (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) hasta 80- 100% de confluencia. La línea celular y PNT2C2 VCAP se cultivaron en RPMI 1640 (Lonza, Verviers, Bélgica) y suplementado con 5% y 10% de FCS, 500 U de penicilina y 500 U de estreptomicina (Lonza, Verviers, Bélgica). El-1 RWPE línea celular (ATCC-LGR, Wesel, Alemania) fue cultivada en queratinocito medio sin suero (Invitrogen, CA, EE.UU.) y se suplementó con 5 ml de Pen-Strep y un kit comercial que contiene bovina pituitaria Extract (BPE, 0,05 mg /ml) y Factor de Crecimiento epidérmico (EGF, 5 ng /ml). La línea celular PC346C se cultivó en medio modificado-Ham F-12 medio de Dulbecco de Eagle (Lonza), suplementado con múltiples aditivos como se describe por Marques [10].
Después de alcanzar 80 a 100% de confluencia, las células se se incubaron con medio libre de 25 ml de suero. Después de 48 h, se recogió el sobrenadante y se somete a las etapas de centrifugación de 400 ×
g gratis (10 min), 3000 ×
g gratis (20 min), y 10.000 ×
g
(30 min) para eliminar los restos celulares. Los exosomas se sedimentaron a 64.000
g gratis (110 min), y en 100.000
g gratis (gradiente de sacarosa) durante 1 h [11]. Se agruparon al menos dos exosomas aislamientos independientes de cada una de las cuatro líneas celulares. La cantidad total y la concentración de proteínas exosomal de las muestras combinadas se midió con un ensayo BCA (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.).
Microscopía Electrónica (EM)
5 l de exosomas eran avistados en rejillas recubiertas de Formvar-(200 mesh) y se fijaron en paraformaldehído al 2%. Después de la fijación de los exosomas se tiñeron negativamente utilizando 4% uranylacetate. Las rejillas se examinaron mediante un microscopio electrónico Philips CM100 a 80 kV.
se añadió Preparación de muestras para espectrometría de masas
TFE (2,2,2-trifluoroetanol) (Sigma-Aldrich) a las muestras a una concentración final de 50%. Las muestras se sometieron a ultrasonidos en un baño de hielo-agua (Branson 1510, Danbury, CT) durante 2 minutos y después se incubaron a 60 ° C durante 2 h con agitación constante (300 rpm). Para puente disulfuro de proteínas (S-S) reducción, se añadió DTT (ditiotreitol) (Sigma-Aldrich) a una concentración final de 2 mM, seguido por sonicación durante 2 min. Las muestras se centrifugaron y se incubaron a 37 ° C durante 1 h con agitación (300 rpm). Las muestras se diluyeron, 5 veces con bicarbonato de amonio 50 mM (pH 7,8) antes de la adición de tripsina de grado de secuenciación modificado (Promega, Madison, WI) para la digestión de proteínas (1:50 w /w de tripsina a proteína). Las muestras se agitaron (300 rpm) durante la noche (16 h). La congelación rápida de las muestras en nitrógeno líquido inactivó la digestión. Todas las muestras se concentran en el Speed-Vac SC 250 Express (Thermo Savant, Holbrook, NY).
espectrometría de masas
mediciones proteómicos se realizaron utilizando un nanoLC-MS en el Laboratorio de Ciencia Molecular Ambiental (EMSL), Richland, WA, EE.UU.. La plataforma de análisis consistió en una línea de presión constante (5000 psi) de fase inversa (C
18) sistema de cromatografía líquida (RPLC) [150 micras Identificación del × 360 × 65 m od cm capilar (Polymicro Technologies Inc., Phoenix , AZ)] acoplado a un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) a través de una ionización por electrospray (ESI) fuente de fabricación propia [12]. En pocas palabras, lleno de MS fueron adquiridos a través de
m
/
z
rango de 400-2000 con una resolución de 100.000, seguido de LTQ MS /MS dependiente de los datos de los seis principales iones más abundantes en cada plena miembros de exploración, utilizando un ajuste de la energía de colisión de 35% y el tiempo de exclusión dinámica de 60 s. Un gradiente de HPLC exponencial de ~ 100 min (0-70% de B) se utilizó para cada análisis, con fases móviles que consiste en ácido fórmico al 0,1% en agua (A) y ácido fórmico al 0,1% en ACN (B). Cada muestra se analizó por triplicado, con aproximadamente 5 g de péptido total consumida (es decir, cargada en la columna) en cada análisis.
espectrometría de masas de análisis de datos
Los datos MS resultante se analizó utilizando el PNNL desarrolló masa exacta y la hora (AMT) Tag tubería [13]. software SEQUEST [14] se utilizó para buscar los espectros de masas en tándem contra la base de datos UniProt humana (descarga el 5 de abril de 2011). péptidos identificados con confianza (Tabla S1 en el archivo S1) se reunieron en una base de datos de etiquetas AMT-exosome específica. Para los análisis comparativos, características LC-MS se comparan con las etiquetas AMT para la identificación y las intensidades relativas de los picos de MS-se utiliza para derivar cambio en la abundancia. estrategia de etiquetas de AMT facilita la cuantificación de muchos más péptidos que contar espectral solo. Mientras un péptido fue identificado en al menos una muestra /análisis (por tándem MS), se podría cuantificar en todos los conjuntos de datos en los que se detectó, incluso si la función de LC-MS no era lo suficientemente abundante para ser fragmentado en que el análisis particular, . VIPER software [15] fue utilizado para correlacionar entradas de las etiquetas AMT (péptidos identificados) con LC-MS funciones que se basan en la precisión de medición de alta masa (MMA & lt; 2 ppm) y Precisión del tiempo de elución normalizado (NET~2.5%). En consecuencia, cada característica LC-MS igualó de nuevo a un único péptido (etiqueta AMT) dando así un valor pico de intensidad (o abundancia relativa) para ese péptido. Para péptido identificaciones redundantes en el caso de un único péptido a juego múltiples proteínas (típicamente isoformas de la proteína) una proteína su Representante fue elegido; Por lo tanto, cada péptido reportado coincide de nuevo a una sola proteína. No péptido identificaciones se realizaron en masa sola.
En las 263 proteínas identificadas, la base de datos de la proteína humana de referencia (HPRD) y el ingenio Pathway Analysis (IPA) se utilizaron para determinar la localización subcelular de las funciones biológicas [16].
La selección de potenciales biomarcadores de proteínas para el cáncer de próstata se realiza utilizando dos enfoques independientes. En primer lugar, se seleccionaron las proteínas que estaban presentes en ambas exosomas derivados de la línea celular de CaP y ausente en ambos exosomas no CaP. Con el segundo método, el software Dante [17] fue utilizado para convertir los valores de intensidad de pico péptido a una escala log 2 y evaluarlos en un nivel de proteína usando (escala basada péptido de referencia) Rrollup parámetros en los que se excluyen de la escala si es que no fueron vistos en péptidos se requieren al menos tres conjuntos de datos y no hay presencia de péptidos mínimo. Las proteínas que se presentan en este manuscrito se identificaron por al menos dos péptidos. También se realizaron comparaciones por pares ANOVA entre cada CaP y la línea celular de control de Dante, donde se establece el número mínimo de puntos de datos por nivel de factor a las tres, por lo que para que una proteína que muestra cambios estadísticamente significativos que tendría que ser identificados en todo tres repeticiones. diferencia significativa se determinó como un valor de p y q-valor inferior a 0,05. Dante genera los valores de p y calcula sus valores de q. Q El valor de una prueba mide la proporción de falsos positivos incurridos (llamada la tasa de falso descubrimiento) cuando esa prueba en particular se llama significativa. Sólo se seleccionaron las proteínas significativamente diferentes para la agrupación jerárquica sin supervisión. Cluster y TreeView se utilizó para iniciar la sesión transformar, con una media de centros de los valores relativos de expresión, y posteriormente de conglomerados jerárquico todas las proteínas en función de su expresión [18]. Para seleccionar más las proteínas más prometedores, a≥1.5 log2 veces el cambio de corte se aplicó junto con el requisito de que cada proteína mostró cambio significativo en al menos dos de las cuatro comparaciones listados en la Tabla 1. La Tabla 1 enumera los 52 proteínas resultantes, 9 de los cuales mostraron un aumento (disminución y 43) abundancia en exosomas derivados de las células de CaP.
Para seleccionar más las proteínas más prometedores de los dos enfoques, las proteínas se redujeron basado en preferencialidad próstata. Cinco diferentes atlas de expresión de genes humanos [19] - [23] sobre la base de los datos de microarrays de expresión fueron combinados en SRS [24], para determinar la expresión de genes en proteínas correspondientes. Eventualmente, preferencialidad de próstata se determinó como 1,5 veces más alta expresión en el tejido de próstata en comparación con el riñón y tejido de la vejiga a partir de datos de expresión génica de microarrays [25].
Western blotting
A partir de cada muestra exosome 5 g de proteína se mezcló con tampón de muestra Laemmli (01:01), se calentó a 95 ° C durante dos minutos y se cargó en 10% de una sola dimensión geles de SDS-PAGE. Posteriormente, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Protran (de Whatman Hertogenbosch, Países Bajos) y bloqueados (1 h) a temperatura ambiente con leche en polvo desnatada al 5% en Tris-solución salina tamponada con 0,1% de Tween-20. A continuación, los geles se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos contra: PDCD6IP (dilución 1:500, Sigma-Aldrich), FASN (dilución 1:500, Sigma-Aldrich), XPO1 (dilución 1:200, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania), ENO1 (Clon H300, la dilución 1:1000, Santa Cruz Biotechnology), GAPDH (Clon 7B, 1:500 dilución, Santa Cruz Biotechnology), CD9 (clon 209306, dilución 1:500, R & amp; D Systems, Abingdon, Reino Unido), PSA (Clon A0562, dilución 1:500, Dako, Heverlee, Bélgica). Los anticuerpos secundarios (HRP-conjugado de cabra anti ratón /conejo, 1:10,000 diluciones, DakoCytomation) se incubaron durante 1 h. BM quimioluminiscencia Blotting Substrato (POD, Roche Applied Science, Almere) se utilizó para iniciar la oxidación por el HRP
La inmunohistoquímica (IHC)
IHC análisis de la expresión de biomarcadores candidatos se realizó en:. Normal de la próstata tejidos (NAP, n = 2), la puntuación de Gleason CP 3 + 3 = 6 (n = 2), y PCA puntuación de Gleason 5 + 4 = 9 (n = 2). Tejidos portaobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio recubierto aminoacetylsilane (Starfrost, Berlín, Alemania), deparaffinised en xileno y deshidratados en etanol. actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno 0,3% en PBS durante 20 min. tratamiento previo de microondas se realizó durante 15 min en tris (hidroximetil) aminometano-EDTA (pH 9,0). Después del pretratamiento, los portaobjetos se incubaron con el PDCD6IP (1:400), FASN (1:50), y XPO1 (1:50) anticuerpos, durante la noche a 4 ° C. Posteriormente, se utilizó el kit EnVision DAKO (DAKO, Glostrup, Dinamarca) para la visualización cromogénico. Después de la tinción de las diapositivas se counterstained con hematoxilina, se lava, se deshidrata y se monta en malinol (Chroma-Geselschaft, Korgen, Alemania).
Resultados
Aislamiento y caracterización
Microscopía Electrónica (EM) de las muestras de exosoma purificados reveló que las vesículas derivadas de cuatro líneas celulares son razonablemente homogéneos en tamaño, con un diámetro aproximado de 70 a 200 nm (Figura 1).
Todas las muestras de exosoma contienen múltiples vesículas con una tamaño en el intervalo de 70 a 200 nm. La oscuridad de las vesículas refleja la diferencia en la densidad de los exosomas entre las muestras.
LC-MS /MS análisis después de la digestión con tripsina, identificado péptidos 1494 no redundante (Tabla S1 en el archivo S1), que corresponde a 496 proteínas por al menos 1 péptido (Tabla S2 en el archivo S1). 263 proteínas se identificaron por lo menos 2 péptidos, y en concreto 248, se identificaron 233, 169, y 216 proteínas en el PNT2C2, RWPE-1, PC346C y celulares VCAP líneas, respectivamente (Tabla S3 en el archivo S1). Sin supervisión agrupación jerárquica de estas proteínas 263 dio lugar a una clara distinción entre el cáncer y las líneas celulares de control (Figura 2).
Cada muestra se analizó exosome por triplicado. Los resultados se significan centradas y transformación logarítmica. la abundancia relativa de proteínas está codificado por color con rojo que corresponde a una abundancia relativamente alta, r verde correspondiente a una abundancia relativamente baja, y gris que indica que faltan los valores de abundancia.
Las proteínas exosomal identificados en las líneas celulares 4 mostraron similares patrones de localización subcelular (Figura 3A). Cuando se compara con todas las proteínas incluidas en la base de datos IPA, exosomas contienen, en términos relativos, más proteínas citoplasmáticas y casi sin proteínas extracelulares. Una mayoría de proteínas detectadas dentro de los exosomas se refieren a la tumorigénesis, la muerte celular, la síntesis de proteínas, el crecimiento y la proliferación (Figura 3B) celular.
exosomas de las cuatro líneas celulares (PNT2C2, RWPE-1, PC346C, VCAP) contenido 60% de las proteínas citoplasmáticas y 25% de proteínas transmembrana. B. Los siete principales funciones de las proteínas exosomal de acuerdo con Ingenuity Pathway Analysis. Se aplicó la prueba exacta de Fisher para calcular la significación (p-valor & lt; 0,05).
Selección de biomarcadores potenciales
Para seleccionar proteínas que muestran un cambio significativo en la abundancia entre los exosomas y no CaP -PCa exosomas se utilizó ANOVA comparaciones por pares (es decir, p-valor y el valor de q & lt; 0,05, presencia en todos los análisis, ≥ 2 péptidos) [17]. Tabla S4-8 S1 en el archivo contiene los resultados obtenidos para el PC346C (CaP) vs. PNT2C2 (control), PC346C (CaP) vs. RWPE-1 (control), VCAP (CaP) vs. PNT2C2 (control), y VCAP ( PCa) vs. RWPE-1 (control). Para mejorar aún más la confianza, requerimos que cada proteína se determinó que era significativamente cambiando en abundancia en al menos 2 comparaciones; esto reduce aún más nuestra lista de 52 proteínas (Tabla 1 y Tabla S9 en el archivo S1).
Nuestro análisis proteómico se indica PDCD6IP, FASN, CD9, y ENO1 tener un cambio significativo en la abundancia entre dos condiciones, mientras que hizo XPO1 no pase nuestros estrictos criterios de filtrado y por lo tanto se consideró sin cambios en abundancia en el VCAP vs comparación RWPE-1 (Tabla S8 en archivo S1). A pesar de ello, se optó por validar XPO1 debido a su mayor abundancia en los exosomas VCAP comparación con el control RWPE-1 y la disponibilidad de un anticuerpo de alta calidad adecuada para el Western Blot e inmunohistoquímica.
Exploración de nuevos biomarcadores candidatos
para FASN y XPO1, se observaron señales fuertes en los lisados de células enteras en comparación con los exosomas y no parece ser relativamente mayor abundancia en la muestra exosome VCAP (Figura 4). El PDCD6IP proteína está enriquecida en exosomas y muestra mayor abundancia en ambas muestras de exosoma derivados de PCa como se representa en la Figura 4 y en la Tabla 1. Basado en analiza la MS, FASN es significativamente mayor en los exosomas PC346C en comparación con los dos controles y en exosomas VCAP comparación a RWPE-1 de control. Esta mayor abundancia de FASN en PC346C se confirma por el Western blot. CD9 es altamente enriquecido en exosomas y muestra relativamente alta abundancia en los exosomas PC346C. XPO1 exhibió mayor abundancia en los exosomas VCAP en comparación con los controles. MS datos ENO1 caracteriza por ser significativamente disminuidos en abundancia en PC346C en comparación con los dos controles y en VCAP comparación con el control PNT2C2. Western Blot de ENO1 reveló una banda adicional (aproximadamente 30 kDa) dentro de las dos muestras exosomas derivados de CaP. Como era de esperar, en base a la diferencia de PSA-secreción y formación exosome, PSA es predominantemente presente en las dos muestras de células de cáncer y ausente en exosomas. Los sobrenadantes se recogieron después de que los exosomas se sedimentaron durante la ultracentrifugación, no contenían ninguna de las proteínas exosomal, excepto ENO1 y GAPDH única en medio VCAP.
Las cuatro muestras de exosoma y sus correspondientes líneas celulares se utilizaron para la validación. Además, el sobrenadante de los exosomas sedimentadas se utilizó como control. Las proteínas seleccionadas FASN, XPO1, CD9 y PDCD6IP, fueron probados con ENO1 y GAPDH como control. PSA se puso a prueba para confirmar que es secretada por vía de secreción alternativa y por lo tanto no están presentes en los exosomas. El marcador de proteína más cercano (kDa) se indica para cada mancha.
Verificación de expresión en muestras clínicas
PDCD6IP mostró una fuerte luminal y basal del epitelio tinción citoplasmática en la próstata normal adyacente (NAP) , sin alteración de la expresión de la proteína en el tejido de CaP con diferentes grados de Gleason (Figura 5). En NAP, FASN es de moderada a altamente abundantes en las células epiteliales. Sin embargo, cuando las puntuaciones de Gleason aumenta, la coloración se vuelve más fuerte. En cuanto a XPO1, hay una abundancia de núcleos fuertes en el PAN y una débil tinción citoplásmica. Dentro de las células de CaP, la abundancia citoplasmática aumenta con puntuaciones de Gleason. tinción nuclear sigue siendo igual entre todos los tejidos con CaP.
imágenes representativas de la tinción de 2 muestras independientes por grupo.
Discusión
Comparación de los exosomas derivados de las células del cáncer líneas y inmortalizado células epiteliales de la próstata, proporciona una herramienta poderosa para superar el reto de la gama dinámica e identificar nuevos biomarcadores de cáncer de bajas derivadas abundantes. Este enfoque único en la investigación de proteínas exosomal, combinado con el estado de la técnica LC-MS análisis facilitó la identificación de nuevos biomarcadores candidatos para CaP. Este estudio describe la expresión de proteínas exosomal de múltiples líneas celulares de CaP, pero también examina el contenido de exosomas de múltiples células epiteliales prostáticas normales inmortalizadas. En comparación con estudios anteriores, esto nos permite identificar de manera más fiable biomarcadores candidatos y proteínas exosomal común PCA-específica. El uso de IHC y Western Blot, que verificar la expresión diferencial y demostrar que los marcadores candidatos se expresan por las células de cáncer de próstata en muestras de pacientes.
El número total de proteínas únicas que hemos identificado en este estudio (496 por ≥1 péptido, 263 ≥ 2 por péptidos), es comparable con los informes publicados anteriormente exosome proteómicos. [26] - [30]. Asignación de una localización subcelular reveló que una gran proporción de proteínas exosomal normalmente localizar en el citoplasma o núcleo de las células. Después de comparar esto con una base de datos que contiene una gran mayoría de todas las proteínas (~20,000), nos dimos cuenta de que los exosomas tienen una abundancia relativamente comparable de proteínas nucleares, mayor abundancia de proteínas citoplasmáticas y una gran cantidad sustancialmente menor de las proteínas extracelulares. Esto encaja con la teoría actual de la formación de exosomas [4]. Los exosomas muestran una sobrerrepresentación de transmembrana y citoplásmicos proteínas, tales como CD9 y PDCD6IP, como se muestra mediante transferencias Western. Este hallazgo está de acuerdo con la teoría de que la biogénesis y la selección de los contenidos exosomal no es un procedimiento aleatorio, pero al menos en parte, el resultado de un proceso de separación selectiva [4].
Dos recientes estudios proteómicos reveló proteínas exosomal relacionados con la próstata cáncer [30], [31]; Sandvig
et al.
Realizó el análisis LC-MS en una única línea celular de próstata (cáncer), fueron Hosseini-Beheshti
et al.
Examinó cinco líneas de células de CaP y un epitelio de próstata no maligno línea celular. Ambos se reportaron 266 y 220 proteínas, lo cual es similar al número revelamos. Curiosamente, Sandvig
et al.
Informó una proteína distribución subcelular diferente y correlación con los procesos biológicos en comparación con nuestros datos. Sandvig
et al.
Propuso CDCP1 y CD151 como marcadores candidatos, fueron Hosseini Beheshti-sugirió ANXA2, CLSTN1, FLNC, FOLH1 y GDF15. Hosseini Beheshti-
et al., También mostró
FASN ser un biomarcador candidato exosomas derivados (de acuerdo con nuestros resultados). Cuando comparamos sus proteínas identificadas (por & gt; 2 péptidos) nos dimos cuenta de una superposición de sólo 9 proteínas, respectivamente CD9, ANXA1. ACTB, PGK1, RAN, EPCAM, HSPB1, PDCD6IP y Prdx1 (Figura 6). Estas proteínas han sido publicados anteriormente en múltiples artículos y se considera que estar presente en casi todos los exosomas. PDCD6IP también ha sido identificado por los investigadores, pero no se ha encontrado para ser más abundante en exosomas derivados de PCa. Un total de 199 proteínas únicamente se han encontrado en nuestro estudio, incluyendo la XPO1 candidato biomarcador. La superposición entre los estudios es bastante limitado. En particular, no se espera una superposición de sólo 42 proteínas entre nuestro estudio y Hosseini Beheshti-
et al.
Ya que se utilizaron partido las mismas líneas celulares (VCAP y RWPE-1). Esta estrecha superposición podría ser el resultado de diferentes tecnologías de purificación, MS-MS y tuberías de proceso de datos utilizados. Además, si exosomas contienen una gran colección de diferentes proteínas, se superponen entre bases de datos pueden ser limitados si sólo una fracción de todas las proteínas se identifica en cada estudio. Un informe reciente de Principe
et al.
Mostró la primera identificación de más de 900 proteínas en exosomas derivados de líquido de la próstata humana a partir de pacientes con CaP de bajo grado y hombres sanos [32]. Cuando comparamos su expresión única proteína (presencia de & gt; 2 péptidos), sólo 31 proteínas se superponen, incluyendo varias anexinas (ANXA1-7), peroxirredoxinas (PRDX1-6), PDCD6IP y proteínas transmembrana general (CD9 /CD242 /CD44). Se cree que todas estas proteínas para estar presente en casi todos los exosomas. ¿En qué medida la limitada superposición se debe a diferencias reales entre celulares exosomas y vesículas a partir de muestras clínicas derivado de la línea, aún ha de ser establecida.
El número de proteínas identificadas en cada estudio son una recopilación de la cáncer- exosomal proteínas derivadas identificadas por MS-MS.
se identificaron PDCD6IP como ser enriquecido en exosomas, especialmente en los exosomas CaP. PDCD6IP, también conocido como ALIX, es una proteína citoplasmática que es conocida por su papel en la apoptosis y se demuestre que están involucrados en la vía de clasificación seleccionada por ESCRT complejos [33]. PDCD6IP se ha utilizado como un marcador general para demostrar la presencia de exosomas [34]. Sin embargo, ninguna asociación se hizo con una mayor abundancia en exosomas derivados del cáncer. Una posible explicación para la abundancia alta PDCD6IP en exosomas derivados-CP podría ser que las células de CaP tienen una producción alterada de los exosomas, donde son incapaces de regular la clasificación de contenido exosomal correctamente más. También es posible que las células cancerosas intento de eliminar la proteína PDCD6IP por la secreción exosome a (parcialmente) suprimir la apoptosis. Para complementar esta teoría, otros estudios no CaP relacionados han demostrado que la sobreexpresión de PDCD6IP se correlaciona con la muerte celular [35]. El uso de IHC, no se encontró ninguna diferencia en la abundancia PDCD6IP entre el epitelio normal de la próstata y el tejido CaP
.
Tanto FASN y XPO1 tienen una mayor abundancia en los exosomas derivados de células de CaP VCAP. FASN cataliza la formación de ácidos de cadena larga a partir de acetil-CoA, malonil-CoA y NADPH y ya ha sido sugerido como un marcador de CaP [36], [37]. Estudios recientes mostraron que FASN se expresa principalmente en las células sensibles a hormonas, promueven la proliferación celular y que la inhibición de FASN mata eficazmente y selectivamente células del cáncer [36]. Sin embargo, todos se realizaron estos estudios
in vitro
. La línea celular VCAP utiliza en esta memoria es sensible a hormonas, lo que podría explicar la mayor abundancia de FASN en exosomas derivados de VCAP. Las células cancerosas producen más FASN, probablemente debido a que promueve la proliferación de células, lo que podría conducir a una mayor incorporación en los exosomas. De acuerdo con los resultados anteriores [38], también se observó un aumento en la abundancia en el CaP en comparación con NAP.
XPO1 ha sido sugerido como un marcador pronóstico de otros tipos de cáncer [39]. XPO1 es una proteína nuclear que se sabe están involucrados en la exportación nuclear-citoplasmática de las proteínas portadoras de la señal (NES), que desempeñan un papel en la señalización de las vías tumorales relevantes, tales como P53, AKT1, HDAC5, el receptor de andrógenos (AR) y el EGFR [40] - [42]. Nuestros hallazgos indican que XPO1 podría ser un biomarcador potencial de CaP. Cuando esta proteína se valida en la sección entera muestras de CaP con IHC, se observa una fuerte expresión nuclear y un muy débil expresión citoplasmática. Curiosamente, dentro de las células de cáncer, esta proteína parece trasladar en el citoplasma. Con el aumento de la puntuación de Gleason, la expresión citoplasmática XPO1 se hace más intensa. ¿Por qué se produce este proceso aún no está claro. En una célula normal, XPO1 tiene que ser transportado desde el citoplasma hacia atrás en el núcleo con el fin de funcionar como una proteína chaperona. Si este proceso de reubicación se inhibe en el cáncer, XPO1 citoplasmática se acumulará y más XPO1 puedes ser incorporado en exosomas.
Según lo publicado con anterioridad, una banda de proteína adicional (aproximadamente 30 kDa) aparece con Western Blot utilizando un anticuerpo dirigido contra ENO1 en la línea celular PC346C [43]. Aquí nos muestran que esta banda también está presente en los exosomas VCAP y ausente en los exosomas de dos líneas de células no-PCA. El origen de la banda adicional puede ser un anticuerpo no específico reacción cruzada con otra proteína, una alternativa empalmados ENO1, un fragmento traducido o un producto de degradación de la proteína original. Una isoforma de proteína conocido llamado MBP-1 (c-myc promotor-proteína de unión-1) se produce forma el gen ENO1 [44]. MBP-1 es idéntico en la secuencia a ENO1, pero carece de los primeros 93 ó 96 aminoácidos. Con una masa molecular calculada de 36 kDa, MBP-1 es poco probable que el estimado 30 kDa banda adicional. La observación de que esta banda adicional sólo se produce en ambas muestras cancerosas podría indicar que podría tener una relación con el CP.
Los nuevos marcadores que hemos identificado vino de exosomas de células derivadas de la línea. A pesar de la presencia y expresión exosomal tejido canceroso de un conjunto seleccionado de biomarcadores candidatos se confirmó mediante Western Blot y IHC, la validación independiente de los marcadores candidatos sigue siendo necesaria en una gran colección de muestras tales como exosomas urinario del paciente o muestras de tejido. Esto dilucidar su papel como un biomarcador para el CP.
Con el fin de probar la presencia de proteínas exosomal en grandes cohortes de muestras de pacientes, se puede recurrir a la norma IHC de marcadores candidatos en microarrays de tejidos y biopsias de próstata. Alternativamente, exosomas intactos pueden ser aislados de la orina o plasma usando precipitación, filtración o protocolos de inmunocaptura después de lo cual el contenido de los exosomas se puede medir por ELISA, específico para las proteínas de interés. ELISA se están desarrollando actualmente para la detección de la próstata exosomas derivados intactas utilizando anticuerpos de captura o de detección dirigidos contra las proteínas transmembrana específicos de la próstata conocidos. Dicho ensayo permite identificar la expresión de las proteínas transmembrana, sino también estimar el número de exosomas.
Conclusión
Próstata (cancerosas) secretan exosomas que se pueden utilizar para identificar nuevos biomarcadores candidatos para CaP . Identificación de proteínas por exosomal alto rendimiento LC-FTMS resultó en el descubrimiento de PDCD6IP, FASN, XPO1 y ENO1 como nuevos biomarcadores candidatos para CaP. En la siguiente fase, todos los biomarcadores candidatos propuestos serán evaluados en muestras de pacientes (tejido, suero u orina) para dilucidar plenamente su potencial valor clínico.
Información de Apoyo
archivo S1.
Información de apoyo que contiene 9 de soporte archivos de información. Tabla S1 S1 en el archivo: Confianza péptidos identificados (n = 1.494) fueron montados en una base de datos de la etiqueta AMT-exosome específica. S2 Tabla en el archivo S1: 1494 péptidos no redundantes corresponde a 496 proteínas por al menos 1 péptido.