humano
Extracto
El objetivo inicial de este estudio fue identificar marcadores de diagnóstico novedoso suero para el tumor de ovario humano células de la granulosa (GCT), un tumor que representa hasta el 5% de todos los cánceres de ovario. Para sortear la escasez de tejidos humanos disponibles para los análisis, se utilizó el
CTNNB1
tm1Mmt /+;
PTEN
tm1Hwu /tmiHwu;
Amhr2
TM3 (CRE) BHR /+ modelo de ratón transgénico, que cuenta con la activación constitutiva de señalización CTNNB1 combina con la pérdida de
PTEN Hoteles en células de la granulosa y desarrolla TCG que imitan las formas agresivas de la enfermedad humana. perfiles proteómicos por espectrometría de masas ha demostrado que vinculina, enolasa 1, varias proteínas de choque térmico, y valosin que contiene proteínas (VCP) fueron más abundantemente secretada por las células GCT ratón cultivadas en comparación con GC cultivadas primaria. Entre estas proteínas, sólo el VCP estaba presente en un aumento significativo de los niveles en el suero preoperatorio de pacientes con cáncer de GCT en comparación con sujetos normales. Para determinar la especificidad de VCP, los niveles séricos también se midieron en el carcinoma de ovario, linfoma no Hodgkin y de mama, de colon, de páncreas, de pulmón, y los pacientes de cáncer de próstata. Se observaron aumento de los niveles séricos del PCV en la mayoría de los casos de cáncer, con la excepción de pacientes con cáncer de pulmón o cáncer de próstata. Por otra parte, los niveles de VCP de suero se incrementaron en alguna GCT, los pacientes de carcinoma de ovario, cáncer de mama y cáncer de colon que no lo contrario muestran mayores niveles de marcadores tumorales séricos ampliamente utilizados para su tipo de cáncer (por ejemplo, la inhibina A, inhibina B, CA125, CEA, o CA15.3). Estos resultados demuestran el uso potencial de VCP como marcador sérico altamente sensible para la GCT, así como de otros cánceres humanos
Visto:. Laguë MN, Romieu-R Mourez, Bonneil É, Boyer A, Pouletty N, Mensajero Masson AM, et al. (2012) proteómico de perfiles de un modelo de ratón para la granulosa de ovario de células tumorales Identifica VCP como marcador tumoral en suero altamente sensibles en varios cánceres humanos. PLoS ONE 7 (8): e42470. doi: 10.1371 /journal.pone.0042470
Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Abril, 2012; Aceptado: 9 Julio 2012; Publicado: 1 Agosto 2012
Copyright: © Laguë et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto contó con el apoyo operativo subvención RP-102508 de los Institutos canadienses de Investigación en Salud y la Cátedra de Investigación en Biología Molecular y Genómica funcional de ovario. La Universidad de Virginia Centro de Investigación en Reproducción ligando de ensayo y análisis Core es apoyada por los Institutos Nacionales de Salud NICHD (SCCPRR) Subvención U54-HD28934. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los marcadores séricos son de gran valor para la clínica de detección, el diagnóstico y el seguimiento de los cánceres. Un marcador ideal debe tener una alta sensibilidad y /o alta especificidad, con el fin de discriminar pacientes con cáncer de sujetos sanos como de pacientes con tumores benignos o condiciones no relacionadas. La mayoría de los marcadores séricos actualmente utilizados son hormonas, glicoproteínas, u otras proteínas sobreexpresados por las células cancerosas. Estos marcadores generalmente no son específicos de un tipo único cáncer y algunas veces carecen de sensibilidad [1]. Recientemente se han propuesto varias estrategias para identificar nuevos marcadores tumorales séricos [2]. análisis proteómicos diferenciales de muestras de suero de pacientes con cáncer y sujetos sanos son enfoques de elección, pero se ven obstaculizados por la escasez de material en cánceres raros, así como por la dificultad en la detección de proteínas que se expresan en niveles bajos en comparación con abundantes proteínas de suero normales. Un enfoque alternativo de dos etapas implica la identificación inicial de proteínas que se expresan y /o secretadas entre las células normales y tumorales diferencialmente, seguido de la identificación de estas proteínas en el suero de pacientes con cáncer. Este enfoque requiere idealmente el aislamiento de células tumorales primarias y células normales correspondientes. En este contexto, el uso de modelos animales relevantes del desarrollo del tumor puede proporcionar materiales de partida esenciales para el análisis proteómico o genómico, y conducir a la identificación de proteínas candidatos específicos de tumores o genes cuya expresión se pueden entonces ser investigadas en muestras humanas, como se demuestra en el cáncer de ovario [3], [4], [5].
el tumor de ovario células de la granulosa (TCG) es el más frecuente de los subgrupos de los cordones sexuales /estroma de los tumores de ovario en las mujeres, y se cree que representar hasta el 5% de todos los cánceres de ovario. En los últimos años, nuestro grupo ha centrado en la elucidación de la etiología molecular de GCT humano, así como en la creación de modelos animales GCT pertinentes. Encontramos evidencia de que una regulación deficiente tanto de la WNT /CTNNB1 (ß-catenina) y PI3K /AKT vías de señalización se produce en GCT humana [6], [7]. Los ratones transgénicos con la activación constitutiva de CTNNB1 en células de la granulosa (CG,
CTNNB1
tm1Mmt /+;
Amhr2
TM3 (CRE) BHR /+) desarrollan lesiones precancerosas que ováricos menudo progresar en GCT más adelante en la vida [6]. La pérdida del gen antagonista de señalización PI3K /AKT
PTEN Hoteles en GC rara vez causa la GCT, pero la activación concomitante de CTNNB1 y la pérdida de
PTEN
en el
CTNNB1
tm1Mmt /+;
PTEN
tm1Hwu /tm1Hwu;
Amhr2
TM3 (CRE) BHR /+ (CPA) los resultados del modelo en el desarrollo de la GCT agresiva, con 100 metastásico % penetrancia [7]. Hemos propuesto que la APC ratón es el mejor modelo disponible actualmente para el análisis de los TCG la biología, así como para los estudios preclínicos en animales destinado a desarrollar intervenciones terapéuticas novedosas y /o herramientas de diagnóstico.
La hipótesis de que el ratón de CPA modelo podría ser utilizado para la identificación de proteínas asociadas, GCT-expresados diferencialmente, y que éstos se traduciría en marcadores de diagnóstico novela séricas clínicamente útiles de la enfermedad humana. Aquí presentamos un análisis diferencial comparando secretoma GC cultivadas primaria de ratones normales a células GCT de ratones CPA. Este enfoque condujo a la identificación de la proteína que contiene vasolin (VCP) como un marcador de suero potencialmente clínicamente relevante para GCT humano, así como para otras formas de cáncer.
Resultados
Identificación de proteínas secretadas selectivamente en el ratón GCT
perfiles proteómicos se utilizó con el objetivo de identificar proteínas secretadas que podrían representar nuevos marcadores de diagnóstico específicas del suero de los TCG. medios de cultivo gastado se obtuvieron a partir de células GCT cultivadas de ratones de CPA o de GC normal a partir de ovarios estimulados con eCG. Las proteínas de los medios de comunicación se separaron por SDS-PAGE y catorce bandas de proteínas observadas en GCT pero no en medio GC fueron sometidos a análisis de espectrometría de masas (Figura 1). Este proceso identificó una serie de proteínas que se secretan que derraman por las células GCT en relación con GC normal (Tabla 1) en abundancia. VCL, ENO1, varias proteínas de choque térmico (HSPA8 /HSC70, las isoformas alfa HSP90 constitutivos e inducibles HSP90ab1 y HSP90aa1, y hspa4), y VCP fueron los más consistentes proteínas identificadas a partir de la secretoma GCT.
Las muestras fueron separadas por 10% SDS-PAGE seguido por tinción con plata. Las flechas indican ejemplos de proteínas expresadas de manera selectiva en los medios de cultivo de células GCT, junto con los pesos moleculares aproximados. Se estudiaron un total de 3 geles con diferentes contenidos de acrilamida y 14 bandas (con las proteínas de 12 a 116 KDa) se sometieron a análisis de espectrometría de masas. Sólo uno de los geles 3 se muestra en la figura.
VCP es un marcador de suero para la GCT y otros tipos de cáncer
A continuación se investigó si las proteínas secretadas por GCT las células de ratones CPA podrían servir como marcadores en suero en pacientes humanos GCT. homólogos humanos de nueve proteínas identificadas en los análisis de secretoma (B2M, CTSB, hspa4 /HSP70, HSP90, SPARC, TIMP-2, VCP, VCL, y WIF-1) fueron seleccionados para el estudio adicional basado en las funciones de genes conocidos y la disponibilidad de anticuerpos. Las muestras de suero se obtuvieron de voluntarios sanos y de pacientes con GCT antes del tratamiento. No se observaron diferencias significativas en los niveles de B2M, CTSB, HSP90, SPARC, TIMP-2, VCL o WIF-1 por análisis de inmunotransferencia en el suero de pacientes GCT en comparación con sujetos sanos (datos no mostrados). Se observaron marginalmente mayores niveles de HSP4A en el suero de algunos pacientes GCT en comparación con sujetos normales, sin embargo las diferencias no fueron estadísticamente significativas, y consideran poco probable que sea clínicamente útil (Figura 2A). niveles PCV eran bajas en análisis de inmunoblot de muestras de suero de los sujetos sanos, pero se incrementaron significativamente en la mayoría de las muestras de suero de pacientes GCT (
P
& lt; 0,05). Con un valor de referencia para los niveles de VCP establecidos en la media de los valores de intensidad de la banda de inmunotransferencia de los controles sanos más dos veces la desviación estándar, se observó que 8 de cada 9 mujeres con TCG mostraron un aumento del PCV niveles en suero (Figura 2 B, Tabla 2). Para determinar la especificidad de VCP como marcador tumoral para GCT, los niveles de VCP de suero se evaluaron en los pacientes con carcinomas de ovario, así como en pequeñas cohortes de pacientes con los principales tipos de cáncer no de ovario de histología y grado (Tabla 3) conocido. Sorprendentemente, se detectaron niveles VCP suero elevados en proporciones clínicamente significativo de pacientes con carcinoma de ovario (8 de 8), cáncer de mama (5 de 12), cáncer de colon (7 de 12), el cáncer de páncreas (8 de 12) o no Hodgkin linfoma (5 de 12) (Figura 2B y en la Tabla 3). Sin embargo, los niveles séricos del PCV no aumentaron de manera significativa en los pacientes con cáncer de pulmón o cáncer de próstata.
Niveles hspa4
(A) en el suero de las mujeres con TCG o carcinoma de ovario. Igual cantidad de proteína de suero fueron separadas por SDS-PAGE y se sometieron a análisis de inmunoblot para los niveles hspa4 (borrones representativos se muestran en el panel superior, cada carril representa un único donante). Densitometría análisis de las señales obtenidas con los análisis de inmunotransferencia hspa4 se presentan en una gráfica en la que cada punto representa un único donante (fondo, barra horizontal = media). No se detectó ninguna diferencia significativa en los niveles hspa4 entre los grupos por ANOVA de una vía. los niveles de (B) del PCV se aumentan en el suero de pacientes con cáncer. Los sueros se analizaron como en (A) para la presencia de VCP en pacientes con cáncer de mama, colon, pulmón, páncreas o el cáncer de próstata, carcinoma de ovario, GCT, o linfoma no-Hodgkin (NH). Diferencias estadísticamente significativas (
P Hotel & lt; 0,05). Se detectaron entre el control (normal) y GCT y los grupos de cáncer de colon
La especificidad y sensibilidad de VCP relativa a utilizarse ampliamente suero de diagnóstico marcadores
a continuación comparó la relevancia de VCP a la de otros marcadores de diagnóstico en suero de uso común para varios tipos de cáncer. En la actualidad, los marcadores séricos más útiles para la GCT en las mujeres posmenopáusicas son la inhibina A y la inhibina B [8]. En nuestra cohorte, los niveles séricos de inhibina A y la inhibina B se incrementaron en 5 fuera 9 y 7 de cada 9 de pacientes con GCT (Tabla 2), respectivamente. No hubo una clara correlación entre los niveles preoperatorios de inhibina A, inhibina B y VCP en pacientes GCT, sin embargo un paciente tenía niveles séricos indetectables de inhibina A e inhibina B, pero los niveles de VCP (Tabla 2) altamente aumentado. La sensibilidad de VCP tanto, parece comparar favorablemente a la de las inhibinas y VCP podría servir para identificar a los pacientes GCT inhibina-negativo raras. Serum CA125 se incrementa en aproximadamente el 50% de las mujeres con carcinoma de ovario temprano y en más de 80% de las mujeres con enfermedad avanzada y es útil para la monitorización del tratamiento [9]. En nuestra cohorte pequeña carcinoma de ovario, 4 de 8 pacientes dieron positivo para el CA125, mientras que la medición de VCP detecta el cáncer en todos los pacientes, incluidos los negativos para CA125 (Figura 3). CEA es el marcador tumoral en suero más ampliamente utilizado para el cáncer de colon. Serum CEA está elevada en menos de 25% del cáncer de colon en estadio temprano y 75% del cáncer de la última etapa y es útil para determinar el pronóstico, seguimiento de la terapia y la vigilancia [10]. En los pacientes con cáncer de colon 12 que hemos probado, 5 fueron positivas para CEA. medición VCP detecta el cáncer en todos los pacientes CEA-positivos, además de dos que eran CEA-negativo (Figura 3). CEA y CA15.3 son los marcadores séricos más comúnmente utilizados para el cáncer de mama. La evaluación de estos marcadores no se recomienda para el pronóstico, sino más bien para el seguimiento postoperatorio, así como la vigilancia de las enfermedades avanzadas [10]. En el caso de 12 cohortes que hemos examinado, 3 pacientes resultaron positivos ya sea CEA o CA15.3, y el resto negativo para ambos. los niveles de VCP fueron elevados en los tres pacientes que estaban CEA- o CA15.3-positiva, y también en tres pacientes que fueron negativos para ambos marcadores (Figura 3). Por lo tanto, los niveles séricos del PCV se incrementaron significativamente en la mayoría de los pacientes de cáncer probadas, incluyendo en algunos de otro modo negativo para marcadores tumorales séricos establecidos.
Los sueros de los pacientes se ensayaron para determinar los niveles del PCV por análisis de inmunoblot y los espectáculos de línea de puntos los valores de corte del PCV establecidos en donantes sanos. Además, los sueros se ensayaron por ELISA para la presencia (+) o ausencia (-) de aumento de los niveles de CA125 en el carcinoma de ovario, CEA en el cáncer de colon, o CEA y CA15.3 en el cáncer de mama. Los rangos normales de CA125, CEA y CA15.3 están por debajo de 35 U /ml, 7 g /l, y 29 kU /l, respectivamente.
Discusión
El VCP la proteína es un AAA + ATPasa asociada con diversas actividades celulares. VCP es necesario para el mantenimiento de la homeostasis de la proteína celular y regula la expresión de proteínas implicadas en muchas funciones tales como la replicación del ADN, la mitosis, la degradación de proteínas, la endocitosis, la fusión de membranas, y la biogénesis de orgánulos. En concreto, VCP actúa sobre las moléculas de ubiquitina sustratos y regula el recambio proteico mediante el equilibrio de la degradación proteosomal de proteínas solubles o agregados de proteínas mal plegadas localizadas en el lumen del RE o el citosol. Dependiendo de recuperabilidad de conformación de complejos con PCV y proteína diana sustratos, ya sea VCP promueve su degradación, los segrega a partir de grandes complejos de proteínas, o modula su ubiquitinación compitiendo maquinarias Conjugación ubiquitina y desconjugación (revisado en [11]). asociados VCP con numerosos sustratos ubiquinated, y las funciones de VCP en diferentes tipos de células se refiere en parte a la expresión específica de tejido de sustratos y cofactores. En las neuronas y las células musculares, la interacción VCP con NF-1, UNC45b, y caveolina-3 regula la sinaptogénesis y myofibrogenesis (revisado en [12]). Algunas mutaciones autosómicas dominantes en el gen miopatía por cuerpos de inclusión VCP con enfermedad de Paget del hueso y la demencia frontotemporal (IBMPFD), que es una, a finales de la edad de aparición rara enfermedad hereditaria degenerativa que puede afectar a los músculos, los huesos y el cerebro [13]. Además de las funciones esenciales en la homeostasis, VCP se demostró para regular la vida media y los niveles de varias proteínas con las funciones del cáncer de modulación. Por ejemplo, VCP en cooperación con varias ligasas de ubiquitina regula el volumen de negocio de IkappaB [14], HIF-1 [15], p53 [16], o ErbB3 [17]. Las mutaciones y /o regulación deficiente de las funciones del PCV en las células cancerosas todavía no están bien caracterizados, así como sus posibles efectos causales en la tumorigénesis. Sin embargo, la sobreexpresión de VCP recientemente se ha evidenciado
in situ
en una amplia gama de tipos de cáncer humano, y el análisis de grandes cohortes de pacientes demostró un aumento significativo de los niveles de expresión de VCP por las células tumorales a menudo se correlacionan con la progresión de la enfermedad [18] , [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Sin embargo, el presente informe es el primero en identificar aumento de los niveles del PCV en el suero de pacientes con cáncer.
En conjunto, nuestros resultados indican que VCP representa un marcador tumoral sérico altamente sensible y potencialmente clínicamente útil para una variedad de humanos tipos de cáncer. Aunque su falta de especificidad para un único tipo de cáncer sugiere que es poco probable que la medición de suero VCP podría ser utilizado como una herramienta de detección, su sensibilidad equivalente o superior a muchos marcadores usados comúnmente indica que se podría utilizar en aplicaciones tales como la eficacia del tratamiento de monitoreo o vigilancia de la recidiva de la enfermedad. Además, VCP podría utilizarse para el diagnóstico en conjunción con marcadores específicos de tipo más cáncer para aumentar la sensibilidad global del ensayo. Se requerirá Proyección de cohortes mucho más grandes para determinar la sensibilidad de la medición de VCP de suero para la detección de las diferentes etapas de la progresión del cáncer, y de diferentes subtipos de cáncer. Además, tendrá que ser evaluado antes de su utilidad como marcador tumoral se puede establecer definitivamente la especificidad de VCP con respecto a la detección de la enfermedad neoplásica vs no neoplásico. Como inmunotransferencia es limitado tanto en términos de cuantitatividad y practicidad técnica, el cribado a gran escala, será necesario el desarrollo de un ensayo ELISA de alto rendimiento para VCP
.
En resumen, nuestros resultados demuestran que el perfil proteómico de secretomas tumorales clínicamente relevantes modelos de ratón pueden conducir a la identificación de candidatos proteínas circulantes asociados con la tumorigénesis en humanos. Nos informan de que VCP se sobreexpresa en el suero de pacientes con cáncer, y que puedan representar un nuevo marcador clínicamente útil para la detección del cáncer.
Materiales y Methods
Mice
Ctnnb1
tm1Mmt/+;
Pten
tm1Hwu/tm1Hwu;
Amhr2
tm3(cre)Bhr/+ Se generaron (CPA) ratones transgénicos como se describe anteriormente [7] y se mantuvieron en un fondo genético C57BL /6. En estos ratones, la activación constitutiva de señalización CTNNB1 se debe a la supresión de la tercera exón de
CTNNB1
, lo que resulta en la producción de una proteína mutante dominante-CTNNB1 estable que carece de los sitios de fosforilación necesarios para su degradación proteosomal [ ,,,0],6]. CPA ratones desarrollan durante el período perinatal GCT y mueren antes de las 8 semanas de edad [7]. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional y se ajustan a la política de Servicio de Salud Pública de la Integridad Personal Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
Cultivo de células
Normal GC fueron aislados utilizando el método descrito por Zeleznik et al. [26]. Brevemente, se inyectaron inmaduras (23-26 días de edad) C57BL /6 ratones I.P. con 5 UI de gonadotropina coriónica equina (eCG, Folligon, Intervet Schering-Plough) para inducir el crecimiento folicular. Cuarenta y ocho horas más tarde, los animales fueron sacrificados y los ovarios se punza con una aguja de calibre 25 para liberar los GC en el medio (0,9% NaCl). La suspensión celular se centrifugó a 1000
g
por 5 min y se resuspendieron GC se sembraron en placas de 24 pocillos a 70% de confluencia en medio DMEM /F12 (Sigma Aldrich), complementado con 5% de SFB (Invitrogen), penicilina y estreptomicina (P /S). GCT de 21 a ratones CPA 25 días de edad fueron extirpados, picada con una hoja de bisturí tamaño 10 y digerido durante 2 h con 0,1% de colagenasa de
Clostridium Histoliticum gratis (Sigma) en DMEM libre de suero con P /S . Las células se centrifugaron a 1000
g
de 10 min y se resuspendieron en DMEM suplementado con 10% de FBS y P /S antes de chapado en placas de cultivo celular de 100 mm (25 × 10
6 células /placa) .
secretoma diferencial
analiza
Veinticuatro horas después de la siembra, GC cultivadas y las células GCT se lavaron con HBSS (Invitrogen) y se incubaron durante 24 horas en DMEM libre de suero. Los sobrenadantes se recogieron y se concentraron 80 veces usando Ultra-4 unidades Amicon centrífugas de filtro (Millipore) con un 3 kDa de peso molecular de corte. Las concentraciones de proteína se cuantificaron utilizando el método de Bradford (ensayo de proteínas Bio-Rad) y 4-6 muestras de proteína g fueron separadas por SDS-PAGE. Después de la tinción de plata, proteínas bandas encuentran en GCT pero no en muestras de GC (n = 14) se escindieron del gel. Las rodajas de gel se destiñeron con metanol al 50% después se redujo en DTT 10 mM durante 1 hora a 56 ° C y se alquiló en cloroacetamida 55 mM durante una hora a temperatura ambiente. Después del lavado en 50 mM de bicarbonato de amonio, las piezas de gel se encogieron en 100% de acetonitrilo (ACN). La digestión se realizó utilizando tripsina en bicarbonato de amonio 50 mM durante 8 horas a 37 ° C. Los péptidos se extrajeron finalmente en 90% ACN /0,5 M de urea y se secaron en un vacío de velocidad. Las muestras se resolubilized en 5% de ACN con ácido fórmico al 2% (FA) y se separaron en una columna C
18 la columna casera (150 micras x 10 cm) utilizando un sistema Eksigent nanoLC-2D. Se utilizó un gradiente de 56 min-5-60% ACN (0,2% FA) para eluir los péptidos de una columna de fase inversa casera (150 micras de diámetro interno x 100 mm) con un caudal fijado en 600 nanolitros /min. La columna se conecta directamente a una nanosonda en interfaz con un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap Velos (Thermo-Fisher). Cada espectro completo de MS fue seguido por doce espectros MS /MS (trece eventos de análisis), donde se seleccionaron los doce iones cargados se multiplican más abundantes para la secuenciación MS /MS. experimentos Tandem MS se realizaron utilizando la disociación inducida por colisión en la trampa de iones lineal. Los datos fueron procesados con el motor de búsqueda de la mascota 2,1 (Matrix Science) con los parámetros de tolerancia establecidos a 15 ppm y 0,5 Da para el precursor y los fragmentos de iones, respectivamente. Las modificaciones de variables seleccionadas fueron Carbamidomethyl (C), la desamidación (NQ), la oxidación (M) y la fosforilación (RET). La base de datos seleccionada era humano v.3.54 base de datos IPI con 150858 secuencias.
Las muestras de suero
Las muestras de suero de pacientes con cáncer de mama, colon, pulmón, páncreas o el cáncer de próstata, o el linfoma no Hodgkin de ( n = 12 para cada tipo de cáncer) se obtuvieron del Banco de Tumores Ontario. Las muestras de suero de voluntarios sanos (n = 7) y los pacientes con GCT (n = 9) o carcinoma de ovario (n = 8; 2 de células claras, 2 serosas, 2 mucinoso y 2 endometrioides cánceres de ovario) se obtuvieron de la Réseau de recherche du cancer du Fonds de recherche Québec - Santé. Los procedimientos fueron aprobados por el Comité FRQS-RRCancer Investigación y el Consejo de Ética de Investigación de Cáncer de Ontario, así como el Comité d'éthique de la Recherche sur les sujets humains del Centro Hospitalario de la Universidad de Montreal. La inhibina A y B, los niveles de inhibina se determinaron por ELISA en la Universidad de Virginia Centro de Investigación en Reproducción ligando de ensayo y análisis de testigos. Los valores para la inhibina A y B por debajo del umbral de detección (13 ng /l y 20 ng /l, respectivamente) se definieron como normal. niveles CA15.3 y CEA se determinaron por Les Laboratoires du Centro Hospitalario de la Universidad de Montreal. Valores por debajo de 7 g /l y 29 kU /l para CEA y CA 15.3, respectivamente, se consideraron normal. niveles de CA125 se determinaron utilizando un kit de ensayo ELISA disponible en el mercado y los niveles fueron considerados como normal cuando menos de 35 U /ml (Abnova).
análisis de inmunoblot
muestras de suero (4 l es decir, aproximadamente 200 g ) se separaron mediante SDS-PAGE en geles al 10% de acrilamida. Los geles se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (GE Amersham /VWR). La inmunodetección se realizó con HSPA4- o anticuerpos específicos del PCV (clones ab75977 o ab11433 respectivamente, Abcam) y rábano picante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Amersham GE /VWR) y revelaron usando reactivos de detección ECL (Amersham GE /VWR). La cuantificación de las bandas de proteína se realizó por densitometría análisis utilizando un Kodak Image estación 440CF y software v.3.6.5 Kodak 1D (Eastman Kodak, Rochester, NY). Con el fin de normalizar los niveles de PCV o proteínas hspa4 entre inmunotransferencias, cada gel contenía dos o tres muestras de suero comunes como referencias. El valor de referencia para VCP se estableció como la media de las intensidades de banda de control saludable en inmunoblot análisis + 2SD.
análisis estadísticos
ANOVA de una vía con el post-test de Dunnett se utilizó para comparar los niveles de VCP en mujeres sanas y pacientes con cáncer.
Reconocimientos
los autores agradecen a Meggie Girard, Kathleen Théroux, Jennifer Kendall-Dupont, y Manon de Ladurantaye por su ayuda técnica y el Banco de Tumores Ontario (Jeanette Joanes ) y la Réseau de Recherche du cancer du Fonds de la Recherche en Santé du Québec para proporcionar sueros de pacientes con cáncer y los sujetos normales.