Extracto
El zinc protoporfirina (ZnPP) se ha encontrado que tienen actividad contra el cáncer tanto
in vitro
y
in vivo
. Recientemente hemos demostrado que disminuye ZnPP expresión de la proteína β-catenina en las células cancerosas. El presente estudio examinó los mecanismos celulares que median la supresión de la expresión β-catenina de ZnPP. Demostramos que ZnPP induce una rápida degradación de la proteína β-catenina en las células cancerosas, que se acompaña de una inhibición significativa de la actividad del proteasoma, lo que sugiere que la degradación del proteasoma no tiene en cuenta directamente para la represión. La posibilidad de que ZnPP induce la exportación β-catenina fue rechazada por la observación de que no había ninguna proteína β-catenina detectable en el medio acondicionado después del tratamiento ZnPP de las células cancerosas. La experimentación adicional demostró que ZnPP induce permeabilización de la membrana lisosoma, que fue revertido por el tratamiento previo con un cóctel inhibidor de la proteína de transporte que contiene Brefeldina A (BFA) y monensina. Más significativamente, el tratamiento previo de las células de cáncer con BFA y monensina atenuó la supresión inducida por ZnPP de expresión β-catenina de una manera de la concentración y dependiente del tiempo, lo que indica que la vía de degradación de proteínas lisosoma es probable que participan en la supresión inducida por ZnPP de β catenina expresión. Si existe diafonía entre el sistema ubiquitina-proteasoma y la vía lisosoma que puede dar cuenta de la degradación inducida por ZnPP proteína β-catenina se desconoce en la actualidad. Estos resultados proporcionan un nuevo mecanismo de acción contra el cáncer de ZnPP y revelan una nueva estrategia potencial para la orientación de la vía de señalización de Wnt β-catenina para la terapia del cáncer
Visto:. Wang S, Hannafon BN, Lind SE, Ding WQ (2015 ) El zinc protoporfirina suprime la β-catenina expresión de proteínas en células de cáncer humano: la posible participación de mediada por la degradación del lisosoma. PLoS ONE 10 (5): e0127413. doi: 10.1371 /journal.pone.0127413
Editor Académico: Ming Tan, de la Universidad del Sur de Alabama, Estados Unidos |
Recibido: 17 de diciembre de 2014; Aceptado: April 15, 2015; Publicado: 22 de mayo de 2015
Derechos de Autor © 2015 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Americana del cáncer (CNE-117557) para wqd, Susan G. Komen for the Cure Foundation (KG081083) para wqd, programa NIH OK-INBRE ( 3P20RR016478-09S2) para wqd y el Centro de Oklahoma para el Avance de la Ciencia y la Tecnología (HR14-147) para wqd. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
zinc protoporfirina (ZnPP) pertenece a un grupo de compuestos químicos en el que el ion central de hemo libre se reemplaza por un ion de metal pesado, tal como zinc, estaño (SnPP) o cobre (Cupp). Debido a la similitud estructural de ZnPP a la de hemo libre, un sustrato establecido del antioxidante enzima hemo oxigenasa-1 (HO-1), ZnPP actúa como un inhibidor competitivo para HO-1 actividad enzimática [1]. ZnPP se ha encontrado que tienen actividad contra el cáncer tanto
in vitro
y
in vivo
[2-5] y en general se cree que la actividad contra el cáncer de ZnPP se atribuye a HO-1 inhibición. Sin embargo, la evidencia experimental no ha sido proporcionado para apoyar esta suposición. Por el contrario, algunos estudios han sugerido que la acción anticancerígena de ZnPP podría ser independiente de HO-1 [5,6]. En nuestro informe reciente, se demostró que ni la sobre expresión ni desmontables de HO-1 en los sistemas de modelo de cáncer afecta a la citotoxicidad de ZnPP, indicando fuertemente una acción HO-1-independiente de ZnPP contra las células cancerosas. Nuestros estudios sobre el mecanismo revelaron además que ZnPP es capaz de suprimir rápida y dramáticamente expresión de la proteína β-catenina y la actividad en las células del cáncer [7].
Debido a β-catenina es un jugador clave en la vía canónica de señalización Wnt, que es una vía de destino muy apreciado para la terapia del cáncer [8], la supresión significativa de la expresión y la actividad β-catenina revela un mecanismo importante de la actividad contra el cáncer de ZnPP. Una comprensión adicional de cómo ZnPP suprime la expresión β-catenina en células de cáncer no sólo puede ayudar a dilucidar los mecanismos celulares de la acción anticancerígena de ZnPP, sino también proporcionar nuevas estrategias terapéuticas de cáncer para la orientación de la vía de señalización de β-catenina Wnt
.
en el presente estudio, hemos explorado los mecanismos celulares de la supresión inducida por ZnPP de expresión β-catenina en células de cáncer humano. La naturaleza rápida y dramática de la supresión inducida por ZnPP de expresión de la proteína β-catenina sugiere fuertemente que esta supresión se debe principalmente a ß-catenina degradación de proteínas. β-catenina niveles de proteína están bien controlados por el complejo de destrucción β-catenina que está estrechamente acoplado al sistema ubiquitina-proteasoma [9]. Por tanto, es probable que el sistema de la ubiquitina-proteasoma media inducida por ZnPP degradación de la proteína β-catenina. Sin embargo, otras vías de degradación de proteínas, tales como la vía de degradación de proteínas mediada por lisosoma [10], también pueden estar involucrados en este proceso. Además, la posibilidad de que ZnPP induce una rápida exportación de β-catenina de las células cancerosas no se puede excluir. El presente estudio examinó estos tres mecanismos potenciales de la supresión inducida por ZnPP de expresión β-catenina. Para nuestra sorpresa, supresión inducida por ZnPP de expresión β-catenina no se debe a la actividad del proteasoma mejorado ni es mediado por la exportación de β-catenina. Nuestros resultados apoyan la implicación de la vía de degradación lisosoma mediada por la supresión inducida por ZnPP de expresión β-catenina.
Material y Métodos
Materiales
La β-catenina , fosfo-β-catenina (Ser33 /37 /Thr41) y K48 (lisina 48) varillaje anticuerpos específicos poliubiquitina eran de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA). MG132 y cóctel de Brefeldina A /monensina eran de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Suc-LLVY-AMC fue de Anaspec (Fremont, CA). Z-ARR-AMC y Z-LLE-AMC eran de Millipore (Billerica, MA). Otras sondas fluorescentes eran de Life Technologies (Grand Island, NY). Los concentradores de Corning Spin-X (6 ml) y la sal sódica de monensina fue de VWR International LLC (Radnor, PA). El anticuerpo β-actina y otros reactivos químicos fueron de grado analítico y obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Cultivo de células
La línea celular A2780 (cáncer de ovario humano) era una especie de regalo del Dr. Stephen Howell (Universidad de California, San Diego). La línea celular DU145 (cáncer de próstata humano) y la línea celular MDA-MB-231 (cáncer de mama humano) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). células A2780 se cultivaron en medio RPMI 1640, y DU145 y células MDA-MB-231 se cultivaron en medio DMEM. Ambos RPMI 1640 y DMEM medios se complementaron con suero bovino fetal al 10%, 100 IU /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina. Las células fueron cultivadas rutinariamente en un matraz de 75 mm a 37 ° C en un ambiente humidificado que contiene 5% de CO
2. Todas las células fueron sub-cultivadas dos veces por semana y se aplican a los diversos experimentos que se describen en la sección de resultados.
Preparación y aplicación de ZnPP y SnPP
ZnPP y SnPP fueron adquiridos de Frontier Scientific, Inc. (Logan, UT). El consejo del fabricante y un informe anterior [11] fueron seguidos durante el manejo adecuado de estos compuestos. Una madre de trabajo de ZnPP y SnPP estaba recién preparado para cada experimento individual. Todos los tubos utilizados para preparar la solución madre se cubrieron con papel de aluminio para evitar la reacción con los compuestos de la luz. Los compuestos se disolvieron inicialmente en DMSO completa, y se diluyen adicionalmente con 50% de DMSO en tampón 1X PBS antes de la adición al medio de cultivo celular. La concentración final de DMSO en el medio de cultivo celular estaba por debajo de 0,5% en todos los experimentos llevados a cabo. Vehículos se incluyeron como controles. Las células fueron tratadas con los compuestos en condiciones de poca luz indirecta y se incubaron en la oscuridad durante diversos períodos de tiempo antes de los ensayos individuales, similar a los informes anteriores [5,11].
Western blot
La expresión de proteínas se analizó por Western blot como anteriormente hemos descrito [12,13]. Las células se sembraron en placas de cultivo de 100 mm y alcanzaron% de confluencia 80 antes del tratamiento con ZnPP o SnPP a las concentraciones indicadas y duraciones. Para lisado de células enteras, se lisaron las células y se sonicaron en hielo durante 3 golpes (10 segundos cada uno con un intervalo de 10 segundos en el medio). Los materiales insolubles se eliminaron por centrifugación a 15.000 xg durante 15 min. Los sobrenadantes se recogieron para la determinación de la concentración de proteína. Para el aislamiento de proteína extracelular, las células fueron tratadas en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) durante 1,5 horas. Después del tratamiento, HBSS se recogió y se concentró con concentradores Corning Spin-X. 25 a 40 g de proteína se cargaron en cada pocillo de un gel SDS PAGE al 10%, se transfirieron a una membrana de PVDF, y se transfirieron con anticuerpos específicos contra la β-catenina, fosforilados β-catenina, polyubiquitinated proteínas y β-actina.
co-inmunoprecipitación
co-inmunoprecipitación (co-IP) utilizando anticuerpo β-catenina se llevó a cabo como se describe anteriormente [13]. En resumen, las células que crecen en placas de 100 mm se lavaron con PBS y se recogieron mediante la adición de 150 l de tampón IP (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 50 mM, EDTA 0,5 mM, PMSF 1 mM, y 1% de Triton X -100). Las células se sometieron a ultrasonidos durante 1 minuto sobre hielo, y el material insoluble se eliminó por centrifugación. Los sobrenadantes se recogieron y se determinaron las concentraciones de proteína. Los sobrenadantes se pre-borran por la proteína de agarosa acoplada A, y las perlas de agarosa se retiraron por centrifugación. anticuerpos β-catenina se han añadido a los sobrenadantes (relación 1: 100), y la reacción se incubó a 4 ° C durante la noche con rotación suave. se añadieron 50 l de proteína de agarosa acoplada A para capturar los complejos anticuerpo-proteína mediante la rotación durante 2 horas a 4 ° C. Las perlas (IPS) se recogieron por centrifugación a 2000 × g durante 5 minutos. Las direcciones IP se solubilizaron con 50 l de 2 x tampón de SDS-PAGE mezclando e incubando durante 1 hora a temperatura ambiente. El sobrenadante se recogió por centrifugación a 2000 × g durante 5 minutos. Una inmunoprecipitación en paralelo con IgG de conejo se realizó como un control. Tanto las direcciones IP y las entradas se hirvieron durante 5 minutos y Western blot se realizó utilizando anticuerpos contra proteínas específicas polyubiquitinated K-48 de articulación y β-catenina. la expresión de β-actina en las entradas fueron también se determinó.
fluorescencia detección microscópica de ZnPP intracelular y lisosoma permeabilidad
Lysosome permeabilidad se analizó mediante microscopía de fluorescencia utilizando el sistema de imágenes de contenido de alta Opereta de PerkinElmer ( Waltham, MA). células A2780 se sembraron en Cell Carrier-96 placa de PerkinElmer (Waltham, MA) a una densidad de 10.000 células por pocillo. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, las células fueron tratadas con o ZnPP SnPP o pre-tratado con Brefeldina A /monensina (21,1 mM /4 mM) cóctel durante 4 horas seguido de tratamiento con ZnPP. El medio se reemplazó con medio fresco que contiene 2.5 M de naranja de acridina (AO, Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de 30 minutos de incubación las células se lavaron tres veces con HBSS y se vieron bajo la Operetta. Lysosome permeabilidad se midió utilizando la tinción AO [14]. AO se detectó mediante excitación a 500 nm, emisión a 526 nm para el rojo, y la excitación a 460 nm, emisión a 650 nm para el verde.
actividad del proteasoma ensayo
Las actividades del proteasoma se midieron como anteriormente informado [15]. En resumen, las células A2780 fueron tratados con ZnPP, SnPP o MG132 a diferentes concentraciones y duraciones. Después del tratamiento, las células se lavaron con PBS y se recogieron en PBS. Los sedimentos celulares se lisaron con 250 l de tampón de lisis (HEPES 50 mM, pH 7,5, EDTA 5 mM, NaCl 150 mM y 1% de Triton X-100) por 5 × 10
6 células por incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos y vórtex cada 10 minutos. Los lisados se centrifugaron a continuación y sobrenadante recogido. Un total de 10 g de proteína para cada muestra se incubó con 20 mM de sustrato fluorogénico (Suc-LLVY-AMC, Z-ARR-AMC o Z-LLE-AMC) en 100 l de tampón de ensayo (20 mM Tris-HCl, pH 7,5 ) a 37 ° C durante 2 horas. Después de la incubación, la fluorescencia se leyó a 380 nm de excitación y 460 nm de emisión en el uso de Molecular Devices Fmax lector de microplacas de fluorescencia (Sunnyvale, CA):
Resultados
La supresión inducida por ZnPP de β-catenina expresión va acompañada de una inhibición de la actividad del proteasoma. Hemos informado anteriormente de que ZnPP suprime la expresión de proteína β-catenina en las células cancerosas humanas [7]. Esto también se confirmó en el presente estudio (Fig 1). El tratamiento con 5 mM ZnPP durante 30 minutos a 1 hora expresión de la proteína β-catenina suprimido dramáticamente en las células A2780, lo que indica que la degradación de proteína está implicada. β-catenina niveles de proteína son estrictamente regulados por el sistema ubiquitina-proteasoma. En ausencia de ligandos Wnt, la proteína β-catenina puede ser fosforilado por CK1 en Ser 45, seguido por una fosforilación secundaria en Ser 33, Ser 37 y Thr 41 por GSK-3β. Fosforilada β-catenina será entonces poli-ubiquitinated y destinada a la degradación por el proteasoma [9]. Para determinar si la activación de la actividad del proteasoma es el principal mecanismo para la degradación inducida por ZnPP β-catenina, que mide el nivel de fosforilados β-catenina después del tratamiento ZnPP en las células A2780. La figura 2A muestra que el nivel de fosforilados β-catenina (Ser 33, Ser 37 y Thr 41) se redujo después del tratamiento con 5 mM ZnPP durante 15, 30 o 60 minutos, lo que indica que ZnPP no aumenta la fosforilación de β-catenina por GSK -3β. Co-inmunoprecipitación con un anticuerpo contra β-catenina (IgG de conejo utilizó como control para la precipitación) mostró además que mientras que los niveles de toda β-catenina fue suprimida, acoplamiento K48 poli-ubiquitinated específica β-catenina se acumula en el β-catenina precipitó muestras después del tratamiento ZnPP durante 30 minutos y 4 horas (Fig 2B). A continuación, medir los niveles de K48 (lisina 48) varillaje proteínas específicas poli-ubiquitinated para determinar aún más los efectos de ZnPP en proteínas poli-ubiquitinated. La cadena de poli-ubiquitina enlazada-K48 se conoce a proteínas diana para la degradación proteasomal [16]. Como se muestra en la figura 2C, el tratamiento con 10 mM ZnPP durante 4 o 21 horas inducidas acumulación de proteínas poli-ubiquitinated específicos K48, lo que indica que en lugar de la activación de la actividad del proteasoma, ZnPP realidad suprime la actividad del proteasoma en nuestro sistema de modelo. Tenga en cuenta que los compuestos de unión de cinc se han descrito previamente para inhibir la actividad del proteasoma [17,18].
células A2780 se trataron con 5 mM ZnPP de 0,5 o 1 hora. Los lisados celulares se prepararon y Western blot se realizó utilizando anticuerpos contra β-catenina y la β-actina.
Un
. células A2780 se trataron con 5 mM ZnPP para 15, 30 o 60 minutos. Los lisados celulares se prepararon y Western blot se realizó utilizando anticuerpos contra fosforilados β-catenina (Ser 33, Ser 37 y Thr 41) y β-actina.
B Opiniones. células A2780 se trataron con 5 mM ZnPP durante 0,5 y 4 horas. Los lisados celulares se prepararon y co-IP se realizó utilizando anticuerpos β-catenina seguido por análisis de Western blot de proteínas específicas de vinculación K48, β-catenina (PI) o β-actina (entradas). Se muestra son imágenes representativas de tres experimentos individuales.
C
. células A2780 fueron tratados con 10 mM ZnPP durante 4 y 21 horas, o 10 M MG132 durante 21 horas. Los lisados celulares se prepararon y Western blot se realizó utilizando anticuerpos contra proteínas específicas polyubiquitinated K48-vinculación y β-actina.
inhibición de la actividad del proteasoma de ZnPP fue confirmado por medición directa de las proteasoma 20S actividad quimotrıptico, que se analizó usando el péptido fluoróforo unido Suc-LLVY-AMC [19]. El eucariotas 20S proteasoma se sabe que tiene actividades atribuida a sus diferentes subunidades de proteínas que se conocen como la actividad de caspasa-como (escinde después de glutamina y aspártico, residuos de ácido), actividad similar a la tripsina (escinde después de los aminoácidos básicos lisina y arginina) y quimotripsina actividad (escinde después de aminoácidos hidrófobos) [20]. Como se muestra en las células con ZnPP o MG132, pero no SnPP Fig 3, el tratamiento de A2780 (Fig 3A y 3C) y MDA-MB-231 (Fig 3B y 3C), suprimió la actividad quimotríptica en un tiempo y manera dependiente de la concentración. El IC
50 para la inhibición de la actividad del proteasoma de ZnPP se determinó que era 6,2 M en células A2780 y 4,2 M en células MDA-MB-231 (Fig 3D). ZnPP, pero no SnPP, también suprimió la actividad del proteasoma tríptica y la caspasa-como en las células A2780 como se analiza usando el fluoróforo unido péptidos Z-ARR-AMC o Z-LLE-AMC, respectivamente, [19] (Fig 4). Tenga en cuenta que MG132 fue más eficaz en la supresión de la actividad quimotríptica, en lugar de la actividad de la caspasa-como y no afectó a la actividad tríptica, resultados que son coherentes con los informes anteriores [21,22].
A2780
(a)
o MDA-MB-231
(B)
células fueron tratadas con 10 mM ZnPP, SnPP o MG132 durante 4 o 21 horas. Lisados de células enteras se prepararon y se incubaron con Suc-LLVY-AMC durante 2 horas a 37 ° C y la fluorescencia se registró a 380 nm de excitación y 460 nm de emisión.
C
,
D
. células A2780 y MDA-MB-231 fueron tratados con varias concentraciones de ZnPP como se indica durante 21 horas. Lisados de células enteras se prepararon y se incubaron con Suc-LLVY-AMC durante 2 horas a 37 ° C y la fluorescencia se registró a 380 nm de excitación y 460 nm de emisión. El IC
50 se calculó con una curva de regresión no lineal (ecuación dosis-respuesta sigmoidal). Los datos (media ± SE, n = 3) se expresan como porcentaje de control no tratado. **,
P Hotel & lt; 0,01, en comparación con células control sin tratar utilizando ANOVA de una vía seguido por el análisis de Bonferroni.
células A2780 fueron tratados con 10 mM ZnPP, SnPP o MG132 durante 4 o 21 horas. lisados de células enteras se prepararon y se incubaron con Z-ARR-AMC (actividad tríptico)
(A)
o Z-LLE-AMC (actividad quimotrıptico)
(B)
durante 2 horas a 37 ° C y la fluorescencia se registró a 380 nm de excitación y 460 nm de emisión. Los datos (media ± SE, n = 3) se expresan como porcentaje de control no tratado. *,
P Hotel & lt; 0,05, **,
P Hotel & lt; 0,01, en comparación con los controles no tratados utilizando ANOVA de una vía seguido por el análisis de Bonferroni.
Estos resultados indican que inducida por ZnPP degradación de la proteína β-catenina se acompaña de una supresión significativa de la actividad de ubiquitina-proteasoma, lo que sugiere que la degradación del proteasoma no lo hace directamente cuenta de supresión inducida por ZnPP de expresión β-catenina.
ZnPP no promueve la β-catenina exportación de proteínas. Un informe reciente ha demostrado que la proteína β-catenina se secreta en exosomas de células HEK293, que conduce a una supresión significativa de la vía de señalización Wnt canónica [23]. Para determinar si ZnPP-induce la secreción de la proteína β-catenina, las células A2780 se cultivaron en HBSS y se trataron con 5 mM o 10 mM de ZnPP durante 1,5 horas. Se prepararon lisados de células enteras y proteínas extracelulares concentrados. Aproximadamente 20 a 30 g de lisado celular total y las proteínas extracelulares se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida. El análisis de transferencia Western (Fig 5 superior) muestra que la expresión de la proteína β-catenina fue suprimida por ZnPP en el lisado celular y no detectable en la fracción de proteína extracelular, lo que indica que ZnPP no induce la secreción de la proteína β-catenina. Algunas bandas de bajo peso molecular solamente se detectaron en las proteínas extracelulares, no en lisados de células enteras, lo que sugiere que estos son no específicos. Esta conclusión fue apoyada además por azul de Coomassie de gel de tinción (Fig 5 inferior) muestra que el tratamiento ZnPP no alteró los perfiles de proteínas extracelulares. También tratamos las células A2780 con 5 M ZnPP durante 72 horas y exosomas aislado del medio. β-catenina fue indetectable en los extractos de proteínas de exosoma (datos no mostrados), excluyendo aún más la posibilidad de que la proteína β-catenina se secreta en exosomas en el tratamiento ZnPP.
células A2780 se cultivaron en HBSS y se trató con ZnPP en las concentraciones indicadas durante 1,5 horas. El HBSS acondicionado se recogió y las proteínas se concentraron. Western blot se realizó utilizando anticuerpos contra β-catenina
(top)
. Los lisados celulares y muestras de proteínas concentradas también fueron separadas por SDS-PAGE y se tiñeron con tinción con azul Coomassie
(Abajo)
. Se muestra son imágenes representativas de tres experimentos individuales.
La vía lisosoma es probable que participan en la degradación inducida por ZnPP proteína β-catenina. Hemos demostrado anteriormente que las enzimas lisosomales pueden ser liberados a una mayor permeabilidad de la membrana lisosoma, lo que lleva a la escisión de las proteínas celulares [14]. Para determinar si la vía de degradación de proteínas lisosoma está implicado en la supresión inducida por ZnPP de expresión de la proteína β-catenina, se examinaron permeabilidad de la membrana después del tratamiento lisosoma ZnPP. AO se utilizó para estudiar la permeabilidad de la membrana lisosoma [14,24]. AO se acumula preferentemente en los lisosomas y emitirá fluorescencia roja cuando es excitado en condiciones ácidas. Cuando se permeabiliza el lisosoma, AO se trasladará al citosol donde emite una fluorescencia verde después de la excitación. El cambio de rojo a verde fluorescente indica un aumento de la permeabilidad de la membrana lisosoma [25]. Como se muestra en la figura 6A, el tratamiento con 5 mM ZnPP para 1, 4, o 21 horas indujo un cambio dependiente del tiempo en la tinción de AO de rojo a verde, lo que indica que ZnPP mejora la permeabilidad de la membrana en las células A2780 lisosoma. En contraste, el tratamiento con SnPP no dio lugar a cambios significativos en la permeabilidad de la membrana (Fig 6C), coherente con nuestra observación anterior de que SnPP no induce la supresión de la expresión de la proteína β-catenina.
células A2780 fueron tratados con 5 M ZnPP (
Un
) o 5 M SnPP (
B Opiniones) durante 1, 4 o 21 horas. Las células fueron incubadas con 2,5 mM AO durante 30 minutos a 37 ° C. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con HBSS. Las imágenes fueron capturadas usando un microscopio de fluorescencia (60X) con excitación a 500 nm, emisión a 526 nm para AO verde, excitación a 460 nm, emisión a 650 nm para AO rojo.
C
. células A2780 fueron pretratados con 21,2 M Brefeldina A y 4 M monensina durante 4 horas. Las células se trataron entonces con 5 M ZnPP durante 1 hora seguido de incubación con 2,5 M AO durante 30 minutos a 37 ° C. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con HBSS. Las imágenes fueron capturadas usando un microscopio de fluorescencia (60X) con excitación a 500 nm, emisión a 526 nm para AO verde, y excitación a 460 nm, emisión a 650 nm para AO rojo. Se muestran las imágenes representativas de tres experimentos individuales.
BFA se sabe que bloquea el transporte intracelular de las enzimas lisosomales [26] y monensina puede bloquear la acidificación de los lisosomas [27,28]. Por lo tanto, hemos probado si un cóctel BFA /monensina podría revertir la permeabilidad de la membrana lisosoma inducida por ZnPP. Después del pretratamiento de las células con un cóctel BFA /monensina (concentración final de 21,2 mM BFA y 4 M monensina) durante la noche (Fig 6B), una inversión de la permeabilidad de la membrana inducida por lysomal ZnPP se observó. Estos resultados apoyan la implicación de la vía de degradación en el lisosoma supresión inducida por ZnPP de expresión de la proteína β-catenina. Para confirmar esta hipótesis, las células A2780 y DU145 se trataron con el cóctel de BFA /monensina durante la noche y se trataron con ZnPP a las concentraciones y duraciones (Fig 7) indicados. supresión inducida por ZnPP de expresión de la proteína β-catenina fue atenuada significativamente por el tratamiento previo con el cóctel de BFA /monensina. El efecto de ZnPP en β-catenina era a la vez dramática y significativa y la reversión por BFA /monensina sólo se observó después del tratamiento ZnPP 0,5 y 1 hora (datos no presentados). Sin embargo, la atenuación correlaciona con la concentración y la duración del tratamiento ZnPP. Estas observaciones demuestran, además, que la vía de degradación lisosoma es probable que participan en la supresión inducida por ZnPP de expresión de la proteína β-catenina.
A2780
(A)
o DU145
(B)
células se trataron previamente con o sin 21,2 M BFA y 4 M monensina durante la noche seguido por tratamiento con 5 M de ZnPP de 0,5 o 1 hora.
C
. células A2780 fueron pretratados con 21,2 M BFA y 4 micras monensina durante la noche seguido por tratamiento con ZnPP durante 1 hora a las concentraciones indicadas. Se recogieron las células y se lisaron. El análisis de transferencia Western se realizó utilizando anticuerpos contra β-catenina y β-actina. Se muestra son imágenes representativas de tres experimentos individuales.
Discusión
La supresión del presente estudio fue diseñado para explorar los posibles mecanismos celulares que median ZnPP indujo la expresión β-de-catenina usando células de cáncer sistemas modelo. El hallazgo más interesante de este estudio es que inducida por ZnPP degradación de la proteína β-catenina es acompañado por una inhibición significativa de la vía de degradación ubiquitina-proteasoma; y mediada lisosoma-degradación de la proteína parece mediar este evento. Estos resultados aclarar aún más los mecanismos celulares de la actividad contra el cáncer de ZnPP e indican una potencial nueva estrategia en la orientación de la vía de señalización Wnt β-catenina para la terapia del cáncer.
β-catenina niveles de proteína están bien controlados por la fosforilación y la ubiquitina-proteasoma la degradación de [9]. Por lo tanto, se creyó inicialmente que ZnPP activaría la vía de degradación del proteasoma, lo que conduce a una rápida degradación de la proteína β-catenina. Sin embargo, varias líneas de evidencia experimental indica que la degradación del proteasoma no media directamente inducida por ZnPP degradación de la proteína β-catenina. En primer lugar, la fosforilación de proteínas β-catenina, un evento que conduce a la ubiquitinación y la posterior degradación de la proteasoma de β-catenina, no fue inducida por ZnPP en células de cáncer. Por el contrario, el tratamiento ZnPP reduce rápidamente los niveles de proteína β-catenina fosforilada, probablemente debido a la rápida degradación de la proteína total β-catenina celular. En segundo lugar, el análisis de transferencia Western de proteínas poli-ubiquitinated mostró que ZnPP induce la acumulación de proteínas poli-ubiquitinated, lo que sugiere que ZnPP actúa como un inhibidor del proteasoma en lugar de un activador. En tercer lugar, co-IP con un anticuerpo β-catenina y análisis de transferencia Western de proteínas poli-ubiquitinated específicos K48-vinculación demostró que el poli-ubiquitinated β-catenina acumulada después del tratamiento ZnPP, en consonancia con su inhibición de la actividad del proteasoma. Por último, una medición directa de la quimotríptica del proteasoma, las actividades trípticos y la caspasa-como confirmó que ZnPP suprime significativamente las actividades del proteasoma en un tiempo y manera dependiente de la concentración en las células cancerosas. Para nuestro conocimiento, este es la primera demostración de que ZnPP es un inhibidor del proteasoma. Tenga en cuenta que la actividad inhibidora del proteasoma de ZnPP es diferente de los inhibidores del proteasoma previamente establecidos, tales como MG132 [21,22], en que ZnPP parece tener un espectro más amplio de la actividad inhibidora del proteasoma (Figs 3 y 4).
la posibilidad de que ZnPP podría inducir la β-catenina proteína a través de la exportación exosomas [23] disminuyendo de este modo la expresión de la proteína β-catenina celular tampoco fue apoyado por nuestros resultados experimentales. β-catenina proteína era indetectable por Western blot de las proteínas extracelulares recogidas de los medios de comunicación de las células tratadas con ZnPP acondicionado. Por otra parte, los exosomas aisladas de los medios de comunicación no contenían proteínas beta-catenina. Estas observaciones indican que ZnPP no induce la secreción de la proteína β-catenina de células cancerosas.
Recientemente hemos informado de que los ionóforos de zinc mejoran la permeabilidad de la membrana del lisosoma que conduce a la liberación de enzimas lisosomales y la escisión de las proteínas celulares [14]. En el presente estudio, el uso de AO nos ha permitido demostrar que ZnPP mejora la permeabilidad de la membrana lisosoma en nuestro sistema de modelo de células de cáncer, lo que sugiere que la expresión de proteínas de supresión de β-catenina de ZnPP es el resultado de la digestión de la enzima lisosomal de las proteínas celulares. Es importante destacar que, inducida por ZnPP permeabilidad de la membrana lisosoma podría ser atenuada eficazmente por el pretratamiento de las células con el transporte de proteínas BFA cóctel inhibidor /monensina [29], que se sabe que bloquea el transporte celular de enzimas lisosómicas (BFA, [26]) e inhibe lisosoma la acidificación (monensina, [27]). Mientras que este cóctel inhibidor no es específica de los lisosomas, el uso de monensina y BFA de alterar la estructura lisosoma y la actividad ha sido bien documentada [30-32]. Estas observaciones apoyan el concepto de que la vía de degradación de proteínas mediada por lisosoma está implicado en la supresión inducida por ZnPP de expresión β-catenina. El pretratamiento de las células de cáncer con el cóctel de BFA /monensina atenuó significativamente la supresión de la expresión de la proteína β-catenina por ZnPP además de confirmar la implicación de la vía de degradación de proteínas lisosomal en este proceso. Queda por determinar si las enzimas lisosomales específicas son responsables de la inducida por ZnPP degradación de la proteína β-catenina o si un grupo selecto de proteínas se degradan a través de este proceso en las células cancerosas. La interacción potencial del sistema de ubiquitina-proteasoma con la vía de degradación lisosoma [33,34] que pueden explicar inducida por ZnPP degradación de la proteína β-catenina está bajo investigación activa. Dado que no existen informes anteriores sobre la inhibición del lisosoma mediada por la expresión de β-catenina, los resultados de este estudio proporcionan una nueva visión de la actividad anticancerígena de ZnPP y revelan posibles nuevas estrategias en la supresión de la vía de señalización Wnt canónica.
en resumen, hemos explorado los mecanismos celulares que median la supresión inducida por ZnPP de expresión β-catenina en las células cancerosas. Nuestros resultados indican que la vía de degradación lisosoma es probable que participan en la supresión de la expresión de β-catenina de ZnPP y que este proceso está acompañado por una inhibición de la actividad del proteasoma. Estos resultados proporcionan un mecanismo celular novedoso de la actividad anticancerígena de ZnPP y implican una nueva estrategia para la orientación de la vía de señalización Wnt canónica.