Extracto
cáncer de tumor infiltrante-gástrico es una de las causas más frecuentes de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo. La expresión de la proteína supresora de tumores, leucemia promielocítica (PML), se reduce o abolida en los carcinomas gástricos, en asociación con un mayor nivel de invasión linfática, el desarrollo de una mayor puesta en escena pTNM, y el pronóstico desfavorable. En este documento, se investigó la relación entre la extensión de los linfocitos infiltrantes de tumor y el estado de expresión de la proteína PML en el carcinoma gástrico avanzado. Se observó un mayor número de infiltrarse en las células T en los tejidos de carcinoma gástrico en el que la expresión de PML fue de reducción o derogación, en comparación con los tejidos positivos para la LMP. El alcance de la migración de células T hacia sobrenadantes de los cultivos obtenidos a partir de líneas celulares de carcinoma gástrico interferón-gamma (IFN-estimulado-γ, además, fue afectada por la expresión de PML
in vitro
. Proteína interferón-gamma-inducible 10 (IP -10 /CXCL10) expresión se incrementó en los tejidos de carcinoma gástrico se presentan los niveles de PML reducidos. Además, tanto
Pml
expresión IP-10 ARNm y proteínas knockout y desmontables células mostradas mejorada en presencia de IFN-γ. knockdown PML aumento de IFN-γ mediada transductor de señales y activador de la transcripción-1 (STAT-1) de unión al promotor de IP-10, lo que resulta en la transcripción elevada del gen de IP-10. por el contrario, PML IV expresión de la proteína suprimida IP-10 la activación del promotor . Basándose en estos resultados, se propone que la pérdida de expresión de la proteína PML en células de cáncer gástrico contribuye a un aumento de IP-10 de transcripción
vía
mejora de la actividad STAT-1, que, a su vez, promueve el tráfico de linfocitos dentro de las regiones tumorales .
Visto: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) La pérdida de la proteína de la leucemia promielocítica en el cáncer gástrico: Implicaciones para la IP-10 Expresión y infiltrantes de tumores, los linfocitos. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10.1371 /journal.pone.0026264
Editor: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), Estados Unidos de América
Recibido: 21 Abril, 2011; Aceptado: September 23, 2011; Publicado: 12 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación de Ciencias básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (2010 a 0.015.506) a y-HC, por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el gobierno de Corea (MEST) (2010-0029353) para JLK, y por RO1 NS50665 de ENB. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es una de las causas más frecuentes de muerte por cáncer en todo el mundo. Los recientes avances en la genética han facilitado la detección de eventos que se producen durante el curso de la carcinogénesis gástrica, incluyendo la activación de oncogenes, silenciamiento de genes supresores de tumores, y la mutación de genes implicados en la reparación del ADN [1]. Entre estos eventos genéticos, se sabe que la expresión de supresor de tumores leucemia promielocítica proteína (PML) se reduce o se suprimió en el cáncer gástrico, y que esto está asociado con más extensa invasión linfática, mayor puesta en escena pTNM, y el pronóstico desfavorable, lo que sugiere que la pérdida de PML es vinculada a la progresión de la carcinogénesis y gástrica carcinoma [2]. Estudios anteriores implicado
Pml
disfunción en la progresión de una variedad de cánceres, y reducido o suprimido la expresión de PML ha sido reportado en la próstata, de mama, del sistema nervioso central, colon, pulmón y cánceres gástricos [2], [3] .
el
Pml
gen fue identificado originalmente por fusión con el receptor de ácido retinoico que participan en la translocación t (15; 17) translocación cromosómica asociada con la leucemia promielocítica aguda (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML es una proteína supresora de tumores que regula la progresión del ciclo celular, la transcripción de genes, la supresión de la transformación, y la apoptosis.
Pml
ratones knockout son considerablemente más sensibles a la formación de tumores después de la exposición a agentes carcinógenos que son los controles de tipo salvaje, y
Pml
deficiente en las células son menos propensas a sufrir apoptosis después de la aplicación de tipos particulares de estrés celular [9]. Además de los informes que se centran en el papel desempeñado por supresor de tumores PML, varios estudios han confirmado que la proteína actúa como un regulador transcripcional,
a través de
asociación con la proteína co-activador de CREB vinculante; co-represores incluidos HDAC, N-CDR y mSin3A; y los factores de transcripción Nur77, AP-1, myc, p53, y STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].
mutación progresiva de alteraciones genéticas y en varios genes supresores de tumores promueven el desarrollo y progresión del tumor [18]. Además de las alteraciones genéticas en las células tumorales, tanto en las células inflamatorias y los mediadores contribuyen a la formación de microambientes tumorales particulares [19], [20]. fibroblastos asociados a tumores (TAF) y macrófagos (TAMs) también están implicados en la modulación de la microambiente tumoral
vía
producción de citocinas, quimiocinas, interferones, y otros factores biológicamente activos [21], [22]. Cross-talk entre las células tumorales, TAF, TAM, y linfocitos, es importante en el desarrollo y progresión del tumor, y contribuye al establecimiento de microambientes tumorales enriquecidos en la expresión de una variedad de factores biológicamente activos [23], [24], [25] , [26], [27].
TAM se encuentran en correlación con la angiogénesis y un pronóstico desfavorable en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer gástrico [22], [28]. mastocitos produce muchos factores angiogénicos y una variedad de citoquinas, y su densidad se ha informado que se correlaciona altamente con el grado de neoangiogénesis tumoral y mal pronóstico [29], [30]. CD4
+ y CD8
+ linfocitos también se encuentran en una variedad de tejidos de cáncer de sólidos. Hasta ahora, son en gran parte desconocidos los mecanismos moleculares precisos por los cuales el tipo y el número de células tumorales infiltrantes son regulados. Hay varios informes controvertidos en relación con el número y la función de los linfocitos infiltrantes de tumor. Especialmente, CD8
+ T linfocitos, mientras que su función se conoce para eliminar las células transformadas nacientes y contribuir a la inmunovigilancia [31], se ha informado que las células T CD8
+ infiltrantes de tumor son defectuosos en función de fase efectora al entrar en contacto con células tumorales [32], y su infiltración está vinculada a pronóstico desfavorable en ciertos tipos de cáncer como el cáncer no microcítico de pulmón de células y el carcinoma nasofaríngeo [33], [34].
Las quimiocinas secretadas por las células del estroma o tumor células influir en la migración de células tumorales, invasión, la proliferación, la angiogénesis y la infiltración de células inmunes en la masa del tumor [35]. IFN-γ-inducible proteína-10 (IP-10, CXCL10) es una de las quimiocinas CXC que desempeña múltiples funciones en enfermedades inflamatorias y cáncer [36], [37]. Desde IP-10 promueve preferentemente Th1 respuesta inmune mediante la atracción de robustamente células NK y T, se sugiere como uno de los posibles mecanismos de la infiltración de células T a los tumores.
Ya sea la pérdida de genes supresores de tumores en células tumorales induce el reclutamiento de los linfocitos y la modulación de las funciones de estas células dentro de microambientes tumor es claro en la actualidad. En el presente estudio, se examinó la función de la LMP con respecto al reclutamiento de linfocitos y la modulación de la expresión de factores derivados del tumor. La expresión de PML se correlacionó inversamente con el grado de infiltración de CD8
+ células T en los carcinomas gástricos. pérdida PML se asoció más con una mayor expresión de IP-10, una de las quimiocinas CXC linfocitos atraer, en células de carcinoma gástrico y tejidos. PML knockdown promovido mediada por IFN-γ STAT-1 de unión al promotor de IP-10, lo que resulta en aumento de la transcripción del gen de la IP-10. Nuestros datos apoyan la noción de que la PML está involucrado en el reclutamiento de linfocitos en los tumores,
a través de
modulación de los niveles de expresión de factores derivados del tumor, incluyendo IP-10, proporcionando una prueba más que la pérdida de genes supresores de tumores en el tumor células participa activamente en el establecimiento de microambientes tumorales.
resultados
la pérdida de la proteína PML se asocia con aumento de la infiltración de células CD8
+ T-células en tejido de carcinoma gástrico avanzado
tinción inmunohistoquímica para PML y CD8 se realizó para explorar si el grado de infiltración de linfocitos se asoció con el estado de la expresión de PML en el cáncer gástrico avanzado. Se enumeraron las células CD8-immunopositive como se describe en Materiales y Métodos. En total, 35 muestras (71,4%) mostraron pérdida parcial a completa de LMP en los núcleos de las células del tumor de estadio IV carcinomas gástricos avanzados. Las muestras de 14 pacientes con carcinoma gástrico avanzado fueron difusamente positiva para PML, y contenían un promedio de 32,7 CD8
+ T-células por campo (Figura 1A). Se identificaron 19 casos de carcinoma gástrico avanzado que presentan positividad focal para la LMP, con un promedio de 47,2 CD8
+ T-células por campo. Por otra parte, se observó una pérdida completa de la LMP en 16 pacientes con carcinoma gástrico avanzado; las muestras contenían un número promedio de 52,8 CD8
+ T-células por campo. Las muestras que presentan positividad focal o pérdida completa de LMP mostraron un aumento más marcado en CD8
+ número de células T que lo hicieron muestras que exhiben positividad difusa para la LMP. Imágenes representativas se muestran en la Figura 1B. Aunque la expresión de proteínas PML fue reducido o suprimido en células tumorales, todas las glándulas gástricas normales de las mucosas, los tejidos del estroma y células linfoides, exhibido immunopositivity nuclear moderada a fuerte difusa para la LMP
.
(A) tinción inmunohistoquímica para proteína PML y CD8 se llevó a cabo durante 49 casos de carcinomas gástricos en estadio IV avanzadas. Immunopositivity para la proteína PML se clasificó como positividad difusa (DP; inmunoreactividad nuclear en ≥50% de las células tumorales, n = 14), la positividad focal (FP; en ≥10% pero & lt; 50%, n = 19), o pérdida completa (CL; en & lt; 10%, n = 16). El número de células CD8 immunopositive en un campo de alta potencia (HPF, x40) de 0,25 mm
2 para cinco fronteras infiltrantes de tumores seleccionados al azar fueron contados para cada muestra, seguido del cálculo de la media y la DE. (B) Imágenes representativas que muestran expresión de la proteína PML y la infiltración CD8
+ de células T en tejidos de carcinoma gástrico avanzado. Bares, Dakota del Sur. *
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influencias PML la infiltración de células T /migración
in vitro
En vista de la pérdida de la LMP expresión de la proteína y el aumento de la infiltración de células CD8
+ T-linfocitos en tejidos de carcinoma gástrico avanzado, la hipótesis de que la PML contribuyó a la infiltración de células T /migración en el cáncer gástrico. Para explorar si el nivel de PML en células de cáncer gástrico influenciada la migración de células T, los medios condicionados a partir de células SNU-638 transfectadas de forma transitoria con cualquiera de
Pml
siRNA o PML IV vector de expresión, entonces se trató con IFN-γ se utilizó en transwell ensayos de migración. SNU-638 células de cáncer gástrico expresaron altos niveles de la proteína PML, en consonancia con los resultados anteriores [2], mientras que las células SNU-638 transfectadas con
Pml
siRNA visualiza los niveles de expresión endógena PML reducida (~46-56%) , como se confirmó por inmunotransferencia (Figura 2A). IFN-γ inducida por un aumento modesto en la expresión de la proteína PML, de acuerdo con los resultados anteriores [38]. La migración de las células T Jurkat hacia medio condicionado de
Pml
células SNU-638 siRNA transfectadas fue significativamente mayor, en comparación con la de las células transfectadas de control siRNA, después del tratamiento con IFN-γ (Figura 2B). Tras la transfección de SNU-638 con PML IV vector de expresión, la migración de las células T Jurkat hacia el medio acondicionado a partir de células sobreexpresados PML IV se redujo en comparación con el de vector vacío (Figura 2C). Estos resultados sugieren que PML regula los niveles de moléculas secretoras producidas por y liberados de IFN-γ estimulada por células de cáncer gástrico, y también influye en la migración de linfocitos T.
SNU-638 células de cáncer gástrico (A) fueron transfectadas transitoriamente con
Pml
siRNA o controlar siRNA. Dos días después de la transfección, las células fueron tratadas con o sin interferón-gamma (IFN-γ (10 ng /ml) durante 8 h y se lisaron y se analizaron por inmunotransferencia. Supresión eficaz siRNA mediada de expresión de la proteína PML se verificó para cada ensayo por inmunotransferencia . (B) células Jurkat y sobrenadantes de cultivo de células SNU-638 que fueron transitoriamente transfectadas con cualquiera de siRNA de control o
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siRNA se analizaron mediante un ensayo de migración transwell. Después de la transfección, las células SNU-638 se incubaron con IFN se colocaron -γ (10 ng /ml) durante 8 h o se deja sin tratar, y los sobrenadantes recogidos en las cámaras inferiores. las cámaras superiores recibieron 5 x 10
5 células Jurkat en un volumen de 100 l y las unidades de migración transwell se incubaron a 37 ° C durante 2 h. la migración de células Jurkat de la parte superior se analizó mediante el examen de las células cosechadas a partir de las cámaras inferiores por fluorescente recuento de grano conteo mediadas en un citómetro de flujo a la cámara inferior. migración celular relativa se determinó por el número de células migradas normalizados al número de células que migran a los sobrenadantes de las células SNU-638 transfectadas transitoriamente con siARN de control sin IFN-γ, y el valor de las células parentales se fijó arbitrariamente en 1. (C) 638 SNU-células de cáncer gástrico fueron transitoriamente transfectadas con el vector vacío o bien vector de expresión de PML IV (Mock) (PML IV). Día después de la transfección, las células fueron tratadas con o sin IFN-γ (10 ng /ml) durante 8 h y sobrenadantes de cultivo se obtuvieron y se sometieron a ensayo de migración transwell como se describe en la expresión de proteínas B. PML se verificó para cada ensayo por inmunotransferencia. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos. Bares, Dakota del Sur. *
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Pérdida de PML-γ aumenta IFN-inducida por la expresión de IP-10
Las quimioquinas, una familia de citoquinas quimiotácticas, promover la migración de leucocitos circulantes /linfocitos a los sitios de inflamación y lesiones. Para explorar si los niveles de quimioquinas se vieron afectados por
Pml
estado genético, la expresión génica de quimioquinas se examinó mediante ensayo de protección de ribonucleasa (RPA).
Pml
+ /+ y
Pml
- /- fibroblastos embrionarios de ratón de las células (MEF) se incubaron en ausencia o presencia de IFN-γ por 0-24 h , el ARNm total se recoge en varios puntos de tiempo, y se sometió a RPA. En
Pml
- /- MEF, IP-10 aumentaron los niveles de ARNm de 1,5 veces a las 2 h, y se convirtió marcadamente elevados (8 veces) por 4 h (Figura 3A). los niveles de ARNm de RANTES se incrementaron 3,2 veces a 0,5 h, y se mantuvo elevada, pero en un grado menor (1,3 veces), 8 h de tratamiento post-IFN-γ en
Pml
- /- MEFs . Otros genes de quimioquinas, incluyendo MIP-1, MIP-2 y MCP-1, no se expresaron de forma detectable en
Pml
+ /+ o
Pml
- /- MEFs (datos no mostrados). STAT-1 de expresión se incrementó después de la exposición a IFN-γ en ambos tipos de células, pero ninguna diferencia fue evidente cuando los niveles de IFN-gamma se compararon entre
Pml
+ /+ y
Pml
- /- las células. A medida que la transcripción del gen de la IP-10 se elevó sustancialmente en IFN-γ-estimulado
Pml
- /- MEF, que mide los niveles de proteínas relevantes en sobrenadantes de cultivo de
Pml
+ /+ y
Pml
- /- MEF, usando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Consistente con los resultados del EPR, los niveles más altos de proteína IP-10 eran evidentes en medio condicionado de tratados IFN-γ
Pml
- /- MEFs (Figura 3B). También, IP-10 expresión de ARNm en
Pml
células NIH3T3 siRNA transfectadas se mejoró, comparado con la de las células transfectadas de control siRNA, después del tratamiento de IFN-γ (Figura 3C). La reducción en la expresión de la proteína PML en
Pml
células NIH3T3 transfectadas con siRNA-fue confirmada por inmunotransferencia
-. /- MEFs en comparación con
Pml
+ /+
células de tipo salvaje. (A) ARN a partir de
Pml
+ /+ y Pml
- /- MEFs tratadas con IFN-γ (10 ng /ml) durante 0-24 h se sometieron a ensayo de protección de ribonucleasa ( RPA). La cuantificación de la IP-10, RANTES y STAT-1 mRNA (Las veces de aumento) se calcula dividiendo el valor densitométrico de cada carril por el valor correspondiente GAPDH. (B)
Pml
+ /+ y
Pml
- /- MEFs células se incubaron en ausencia o presencia de IFN-γ (10 ng /ml) durante 12 h. proteína de IP-10 a partir de los sobrenadantes de cultivo se analizaron mediante ELISA y se normalizaron por la concentración de proteína de la célula. La concentración relativa se calculó como la cantidad normalizada dividido por la cantidad normalizada de no tratada
Pml
- /- células MEFs. fibroblastos (C) NIH3T3 se transfectaron transitoriamente con cualquiera
Pml
siRNA o ARNsi de control. Dos días después de la transfección, las células fueron tratadas con o sin IFN-γ de 0 a 24 h, y se analizaron por inmunotransferencia para la detección de expresión de la proteína PML y RT-PCR para IP-10 ARNm. Cuantificación (Quant) de IP-10 mRNA se calculó dividiendo el valor densitométrico de cada carril por el valor de mRNA de actina correspondiente. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos. Bares, Dakota del Sur. *
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expresión de PML reducido se correlaciona inversamente con la IP-10 niveles de proteína en el tejido de cáncer gástrico y SNU-638 células
A continuación, hemos examinado la relación entre la PI-10 y la expresión de la proteína PML en tejido de carcinoma gástrico avanzado. cáncer de los tejidos se tiñeron inmunohistoquímicamente para PML y IP-10, y se midió la intensidad de IP-10 immunopositivity como se describe en Materiales y Métodos. La intensidad media de IP-10 fue de 1,2 en 14 muestras que muestran positividad difusa (DP) para la LMP, 2,2 en 19 casos de positividad focal (FP), y 2.0 en 16 muestras en las que no hubo pérdida total (CL) de la expresión de PML ( Figura 4A, panel izquierdo). Se observaron incrementos significativos en la expresión de IP-10 en muestras que muestra positividad focal de la LMP (
P = 0,034
), en comparación con aquellos que muestra la expresión de PML positiva difusa. Un aumento en la expresión de IP-10 se observó cuando la pérdida completa de la LMP fue evidente, en comparación con lo que se observó cuando la LMP fue expresada de forma difusa; Sin embargo, esta diferencia no alcanzó significación estadística. Los ejemplos representativos de las variaciones en el estado de la proteína PML que se correlacionaron con diferentes IP-10 niveles de expresión en las células tumorales de carcinomas gástricos avanzados se muestran (Figura 4A, derecha). Para examinar más a fondo la relación entre la expresión de la proteína IP-10 y PML en líneas celulares de carcinoma gástrico, IP-10 los niveles de proteína se midieron en sobrenadantes de cultivo de células SNU-638 transfectadas transitoriamente, ya sea con
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siRNA o PML IV exression vector. Las células se cultivaron en ausencia o presencia de IFN-γ por 8 h, los sobrenadantes recogidos, y IP-10 niveles cuantificados en la misma (por ELISA). inducida por IFN-γ secreción de IP-10 fue significativamente mayor en SNU-638-
Pml
células siRNA-transfectadas, en comparación con la de SNU-638 células transfectadas con ARNsi de control (Figura 4B). La transfección de SNU-638 con PML IV vector de expresión suprimida inducida por IFN-γ IP-10 secreción (Fig 4C). Los resultados muestran claramente que la secreción de IP-10 de células de cáncer gástrico se incrementa cuando se reduce la expresión de PML.
(A) Tinción inmunohistoquímica para PML y IP-10 expresión de la proteína se realizó durante 49 casos de etapa IV avanzado carcinomas gástricos. Immunopositivity para la proteína PML se clasificó como positividad difusa (DP; inmunoreactividad nuclear en ≥50% de las células tumorales), positividad focal (FP; en ≥10% pero & lt; 50%), o pérdida total (CL; en & lt; 10% ). Para el análisis cuantitativo de la inmunorreactividad de IP-10, positivamente las zonas manchadas se midieron usando un programa de software ImageJ como se describe en Materiales y Métodos. Imágenes representativas muestran PML e IP-10 expresión de proteínas en tejidos de carcinoma gástrico avanzado (derecha). (B) las células SNU-638 fueron transfectadas transitoriamente con
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siRNA o control de siRNA. Dos días después de la transfección, las células se incubaron en ausencia o presencia de IFN-γ (10 ng /ml) durante 8 h. proteína de IP-10 a partir de los sobrenadantes de cultivo se analizó por ELISA y se normalizaron por la concentración de proteína de la célula. La concentración relativa se calculó como la cantidad normalizada dividido por la cantidad normalizada de células SNU-638 que fueron transfectadas transitoriamente con siARN de control en presencia de IFN-γ, y la concentración de las células parentales se fijó arbitrariamente en 100%. (C) SNU-638 células de cáncer gástrico fueron transfectadas transitoriamente con el vector vacío o bien o PML IV vector de expresión. Día después de la transfección, las células fueron tratadas con o sin IFN-γ (10 ng /ml) durante 8 h y sobrenadantes de cultivo se obtuvieron y se sometieron a ELISA como se describe en la expresión de proteínas B. PML se verificó para cada ensayo por inmunotransferencia. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos. Bares, Dakota del Sur. *
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IP-10 de neutralización disminuye la migración de las células T
como SNU-638-
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células que contienen el siRNA que expresan niveles reducidos de la proteína PML mostró mejora de reclutamiento de células T y la secreción de IP-10 en respuesta a IFN-γ (figuras 2 y 4), el próximo examinó si un aumento de IP-10 niveles facilitó la migración de células T hacia el medio acondicionado a partir de 638 SNU-células de cáncer gástrico estimuladas por IFN-γ. SNU-638-
Pml
células siRNA se cultivaron en ausencia o presencia de IFN-γ por 8 h, y los sobrenadantes recogidos se trataron previamente con un anticuerpo neutralizante anti-IP-10 o el control de IgG no específica para 1 h, antes del comienzo del ensayo transwell. sobrenadantes de anticuerpos neutralizantes o IgG que contienen se colocaron en las cámaras inferiores, y se analizó la migración de las células Jurkat de superior a las cámaras inferiores mediante el examen de las células recolectadas de las cámaras inferiores. La inclusión de IP-10-anticuerpos neutralizantes inhibió la migración de las células T Jurkat hacia medio condicionado de SNU-638-
Pml
siRNA células (Figura 5A). Estos resultados son consistentes con los datos obtenidos a partir de células NIH3T3; un anticuerpo IP-10 neutralizantes inhibió EL-4 migración de células T hacia medio condicionado de NIH3T3-
Pml
células siRNA (Figura 5B).
(A) SNU-638-
Pml
células siRNA se cultivaron en ausencia o presencia de IFN-γ (10 ng /ml) durante 8 h, y se recogió y se trataron previamente con IP-10 anticuerpos neutralizantes (5 mg /ml) o IgG sobrenadante (5 g /ml) durante 1 h antes de la iniciación del ensayo de migración transwell. El número de células Jurkat que migran obtenidos de la cámara inferior se analizó por fluorescencia de conteo mediada por recuento de grano en un citómetro de flujo. (B) la migración Transwell de células EL-4 de los sobrenadantes del cultivo de células NIH3T3 transfectadas de forma transitoria con
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siRNA en presencia de neutralizar IP-10 anticuerpo o control IgG. migración celular relativa se determinó por el número de las células migradas dividido por el número de células que migran a sobrenadantes sin IFN-γ, y el valor de las células parentales se fijó arbitrariamente en 1. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos. Bares, Dakota del Sur. *
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caída PML mejora IP-10 promotor de activación
Como IP-10 expresión se incrementó en las células PML desmontables, seguir explorando si la expresión de la proteína PML afectada IP-10 la actividad promotora. El IP-10 promotor murino contiene un elemento GAS-como putativo que se encuentra entre -246 y -238 NTS (TTN
5AA) (Figura 6A). Hemos informado anteriormente de que la PML regula negativamente la actividad transcripcional de STAT-1 [17]. Para determinar si la LMP afectó inducida por IFN-γ IP-10 la expresión génica
a través de un mecanismo que implica
STAT-1, se aisló y se generó una construcción de reporte que comienza en la posición -330 del promotor IP-10 murino que contiene el putativo elemento similar al gas, tal como se describe en Materiales y Métodos. La IP-10
luc
reportero que contiene el elemento GAS-como se transfectó transitoriamente en células NIH3T3 se incubaron con o sin IFN-γ durante 24 h, y posteriormente se ensayó la actividad de luciferasa. inducida por IFN-γ IP-10 la actividad del promotor fue significativamente mayor en las células NIH3T3 transfectadas con
Pml
siRNA, en comparación con las células que reciben el control de siRNA (Figura 6B). Tras la transfección de las células NIH3T3 con el vector de expresión LMP IV, inducida por IFN-γ IP-10 la activación del promotor fue reprimida significativamente. Regulación a la baja de la expresión de PML utilizando
Pml
siRNA y la sobreexpresión de la LMP por PML IV vector de expresión fueron verificados por inmunotransferencia. Para determinar si se ha producido el efecto inhibidor de PML en inducida por IFN-γ actividad promotora IP-10 en gástricas líneas de células cancerosas, hemos realizado experimentos similares con SNU-638 células de cáncer gástrico. Los patrones de aumento y disminución de la actividad de luciferasa en SNU-638 fueron similares a la de las células NIH3T3 (Figura 6C). El nivel de expresión de la proteína PML en células SNU-638 transfectadas con cualquiera de
Pml
siRNA o PML IV vector de expresión se verificó mediante inmunotransferencia (datos no mostrados).
(A) El murino IP- 10 contiene un elemento promotor GAS-como putativo (subrayado). (B) las células NIH3T3 se co-transfectadas con el reportero de IP-10-luc que contiene un elemento GAS-similares y /o
Pml
siRNA, o el vector de expresión de la proteína PML IV. Las células se dejaron sin tratar o tratados con IFN-γ murino (10 ng /ml) durante 24 h, y luego se determinó la actividad de luciferasa. El vector pCMV-β-galactosidasa se incluyó para normalizar la eficiencia de transfección. La actividad de luciferasa se normaliza a la actividad en ausencia de IFN-γ y la actividad de las células parentales se establecieron arbitrariamente en 100% (RLA, la actividad relativa de luciferasa). El aumento o la reducción de expresión de la proteína PML en lisados de células transfectadas con el vector de expresión, ya sea PML IV o
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siRNA se verificó mediante inmunotransferencia, respectivamente. (C) SNU-638 células de cáncer gástrico fueron co-transfectadas con el reportero IP-10-luc que contiene un elemento GAS-similares y /o
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siRNA, o el vector de expresión de la proteína PML IV y se analizaron como se describe en B. los valores son la media ± desviación estándar de tres experimentos separados. Bares, Dakota del Sur. *
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PML aumenta desmontables IFN-γ inducida por STAT-1 ADN vinculante a la IP -10 promotor
el efecto de la LMP en IFN-γ inducida por STAT-1 vinculante para el promotor IP-10 se examinó el ADN. PML sobreexpresión de la proteína en las células NIH3T3, después de la transfección transitoria con el vector de expresión LMP IV, parcialmente bloqueado IFN-γ inducida por ADN STAT-1 de unión al promotor de IP-10, que incluye la secuencia en -246 a -238 (Figura 7A, comparar carriles 3 y 5). Competencia utilizando un exceso de oligonucleótido no marcado 100-molar que codifica el promotor IP-10 abrogó la formación de complejos (carril 6). Los niveles de PML y STAT-1 expresión de la proteína en lisados de células enteras (CMT) y el grado de STAT-1 fosforilación de la tirosina en extractos nucleares (NE) se verificaron mediante inmunotransferencia. Utilizando NE de NIH3T3-
Pml
células siRNA obtenidos después de 0,5 h de tratamiento con IFN-γ, fuerte unión a la IP-10 promotor murino se observó (Figura 7B, panel superior, carril 5), en comparación con la unión visto en células de siRNA de control NIH3T3 (carril 3). Los mismos elementos de red se expusieron al consenso oligonucleótido STAT-1, y la unión de STAT-1 DNA se mejoró en el NE de NIH3T3-
Pml
células siRNA (Figura 7B, panel central, comparar los carriles 3 y 5). Usando 638 SNU-células de cáncer gástrico, también encontramos unión que STAT-1 DNA de
Pml
células SNU-638 siRNA transfectadas se mejoró en comparación con la de las células transfectadas de control siRNA, después del tratamiento con IFN-γ (Figura 7C, comparar los carriles 3 y 5). Estos datos indican que PML inhibe parcialmente STAT-1 de unión al promotor de IP-10, y que este efecto se correlaciona con la inducida por IFN-γ aumento de IP-10 de la transcripción en ausencia de PML.
(A) los extractos nucleares (NE) a partir de células NIH3T3 transfectadas de forma transitoria con el vector de expresión de la proteína PML IV y tratados con IFN-γ (10 ng /ml) durante 30 min, se incubaron en presencia de una sonda de ADN radiomarcada que contiene el elemento GAS-como de la IP-10 promotor, y se sometió a ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA). complejos de sonda-proteína desplazadas se indican mediante la flecha. Aumento de la expresión de la proteína PML en lisados de células enteras (CMT) transfectadas con el vector de expresión de PML IV fue verificado por inmunotransferencia. La cantidad de histona en NE se muestra como un control. (B) los NE de células NIH3T3 transfectadas de forma transitoria con cualquiera de
Pml
siRNA o ARNsi de control y tratados con IFN-γ (10 ng /ml) durante 30 min, se incubaron en presencia de sondas de ADN marcadas radiactivamente que contienen el GAS- como elemento del promotor de IP-10 o una secuencia de consenso STAT-1, y después se somete a EMSA. especificidad de unión se puso a prueba mediante la adición de concentraciones crecientes de sonda fría (competidor). supresión eficaz siRNA mediada por la expresión de proteínas de PML se verificó para cada ensayo mediante inmunotransferencia. SNU-638 células de cáncer gástrico (C) se transfectaron transitoriamente con cualquiera
Pml
siRNA o ARNsi de control y tratados con IFN-γ (10 ng /ml) durante 30 min. Se obtuvieron los NE, se incubaron en presencia de sondas de ADN marcadas radiactivamente que contienen una secuencia de consenso STAT-1, y luego se analizaron para EMSA como se describe en B. Los niveles de PML y STAT-1 expresión de la proteína en la CMT y el alcance de STAT-1 tirosina fosforilación en el NE se verificaron mediante inmunotransferencia. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos.
Discusión
Estudios histopatológicos han demostrado que el microambiente inflamatorio de los tumores se caracteriza por la presencia de infiltrados de células mononucleares, tanto en el apoyo estroma y tumorales regiones. Sin embargo, los mecanismos precisos por los cuales las células mononucleares se infiltran dentro y se sustentan en los tejidos de cáncer son actualmente no se comprenden totalmente. En el presente estudio, se aporta evidencia de que la pérdida de expresión de la proteína supresora de tumores, PML, contribuye a elevar la infiltración de linfocitos en el tejido de cáncer gástrico,
a través de
regulación de la expresión de IP-10.
Se examinó la función de la LMP con respecto al reclutamiento de linfocitos a partir de muestras de tejido de cáncer gástrico humano,
Pml
+ /+ y
Pml
- /- MEF, y el PML desmontables en tanto NIH3T3 y células SNU-638. Los datos obtenidos de las dos pruebas de tejido humano y los ensayos de migración transwell mostraron que la pérdida de la LMP promueve el tráfico de linfocitos; por lo tanto, buscamos mecanismos que posiblemente podrían explicar estas observaciones. Se demuestra que un aumento en los niveles de IP-10 en las células cancerosas que expresan niveles bajos de PML contribuye a reclutamiento de linfocitos.