Extracto
El desarrollo de terapias novedosas se ha convertido en un foco de investigación importante para el tratamiento del cáncer de pulmón. Nuestro estudio previo ha demostrado leptomycin B (LMB) inhibe la proliferación significativamente de las células de cáncer de pulmón; Sin embargo, p53 de tipo salvaje células de cáncer de pulmón eran resistentes a la LMB. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue desarrollar y evaluar una nueva estrategia terapéutica para sensibilizar a las células del cáncer de pulmón LMB resistentes mediante la combinación de LMB y doxorrubicina (DOX). Entre los diferentes regímenes de tratamiento, el tratamiento previo con DOX (pre-DOX) y posterior tratamiento con LMB a células A549 se redujo significativamente la concentración inhibitoria 50% (CI50) en comparación con la de LMB solo (4,4 nM
vs.
10,6 nM,
P Hotel & lt; 0,05). Análisis de ciclo celular y la apoptosis por citometría de flujo confirmó aún más los datos citotóxicos. Para investigar los mecanismos moleculares de estos efectos de combinación de fármacos, las vías de p53 se analizaron por Western blot, y el proteoma nuclear se evaluó mediante electroforesis bidimensional en diferencias en gel (2D-DIGE) y espectrometría de masas. En comparación con los grupos de control, los niveles de p53, fosfo-p53 (Ser15), y las proteínas p21 se incrementaron significativamente mientras fosfo-p53 (Thr55) y survivina se redujo significativamente después de los tratamientos de pre-DOX y LMB (
P
& lt; 0,05). El análisis 2D-DIGE /MS identificado que Sequestosome 1 (SQSTM1 /p62) tuvieron un aumento significativo de pre-DOX y las células tratadas con LMB (
P
& lt; 0,05). En conclusión, nuestros resultados sugieren que las células de cáncer de pulmón resistentes a los medicamentos con p53 de tipo salvaje podría ser sensibilizados a la muerte celular por el tratamiento combinado previsto de DOX y LMB a través de la activación y la restauración de p53, así como potencialmente otra vía (s) de señalización que implica Sequestosome 1.
Visto: Lu C, Shao C, E Cobos, Singh KP, Gao W (2012) quimioterapéutico sensibilización de las células del cáncer de pulmón resistentes Leptomycin B mediante tratamiento previo con doxorrubicina. PLoS ONE 7 (3): e32895. doi: 10.1371 /journal.pone.0032895
Editor: B. Ashraf Abdel-Naim, Facultad de Farmacia, Universidad de Ain Shams, Egipto
Recibido: 13 de diciembre de 2011; Aceptó 7 de febrero de 2012; Publicado: 7 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Lu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de cáncer. muerte en el mundo y en los Estados Unidos [1]. cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) sigue siendo la forma predominante de cáncer de pulmón (cerca del 85% de todos los cánceres de pulmón), entre los que adenocarcinoma de pulmón (AC) es el subtipo histológico más frecuente para todos los sexos y razas combinado [2]. El pronóstico del cáncer de pulmón es muy pobre, con una tasa de supervivencia a 5 años de menos del 15% en los Estados Unidos. La quimioterapia sigue siendo el tratamiento más frecuente para prolongar la supervivencia y mejorar la calidad de vida [3], [4], [5], [6].
La quimioterapia del cáncer ha sido utilizado con éxito en una variedad de circunstancias que implican tumores malignos, sin embargo, su eficacia ha sido a menudo limitada por la resistencia a fármacos y los efectos secundarios [7]. Terapias centradas en molécula específica (s) /vía (s) tienen el potencial de superar estas limitaciones [7]. Leptomycin B (LMB) y /o sus derivados, que pueden inhibir eficazmente la exportación nuclear mediante la inhibición específica de mantenimiento región del cromosoma 1 (CRM1), ha sido reconocida como una nueva clase de terapias contra el cáncer [8], [9], [10], [11], [12]. CRM1, el mejor receptor de exportación nuclear caracterizado, juega un papel esencial en canónica señal de exportación nuclear (NES) de exportación nuclear dependiente, incluyendo las principales proteínas supresoras de tumor (PAT), tales como p53, FOXO, pRb, p21, p27, etc., como así como el inhibidor de NF-kappa B, es decir, I-kappa B [9], [13]. Estudios recientes han informado de que CRM1 se expresa a un nivel significativamente más alto en el cáncer de cuello de útero en comparación con el tejido normal [14] y podría servir como factor pronóstico para el cáncer de ovario [15] y el osteosarcoma [16]. Nuestro recientemente publicado
in vitro
estudios que utilizan normal de las células epiteliales del pulmón [17] y un modelo de ratón bitransgenic [18] han sugerido que CRM1 juega un papel crítico en el desarrollo del cáncer de pulmón. Además, CRM1 fue sobre-expresan en un modelo de ratón AC de pulmón inducidos por carcinógenos del tabaco, y de pulmón humano de CA (datos no publicados). Estos hallazgos sugieren CRM1 podría servir como una diana molecular para el tratamiento del cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón.
LMB es un inhibidor muy específico y potente de la función de CRM1 mediante la unión irreversible con el grupo sulfhidrilo de un residuo de Cys cerca o dentro de la carga dominio de unión de CRM1 (alquilación de Cys 528) [19], [20]. Por lo tanto, podría evitar LMB localización citoplasmática y modular las vías específicas de cáncer, tales como la inactivación de los supresores de tumores p53 importantes como [10]. Nuestro estudio reciente demostró que la línea celular A549 de pulmón de CA (p53 de tipo salvaje) fue más resistente a la LMB que otras líneas celulares con el mutante p53 o null [12]. Es bien sabido que p53 juega un papel importante en la promoción de la estabilidad genómica, la detención del ciclo celular, apoptosis, reparación del ADN, y la senescencia. Los estudios han sugerido que las funciones de p53 de tipo salvaje en la detención del crecimiento celular y la reparación del ADN podrían aumentar la resistencia a la radio- o quimio agentes terapéuticos; que también es propensa a potenciar la apoptosis en respuesta a graves daños en el ADN [21], [22], [23]. Por lo tanto, para sensibilizar a las células del cáncer de pulmón con el efecto quimioterapéutico del LMB, que en este documento se propone una estrategia terapéutica combinada con LMB con otros fármacos mediante la inducción de graves daños en el ADN y la activación de p53 que eventualmente podría conducir a un aumento de la función de p53 en la apoptosis en lugar de en la reparación del ADN. La doxorrubicina (DOX) es un agente quimioterapéutico ampliamente utilizado que induce la apoptosis en diversas células de cáncer a través de la activación de p53. Se ha utilizado en el tratamiento de una variedad de tumores sólidos. Sin embargo, la resistencia a fármacos en regímenes que contienen DOX es un problema importante que impide mejores tasas de respuesta y los remedios y efectos secundarios cardiotóxicos se han reportado en pacientes con cáncer tratados con DOX [24], [25], [26]. tratamientos individuales de DOX resultaron en una fuerte resistencia en muchas líneas celulares de cáncer, incluyendo el A549, debido a varios mecanismos, incluyendo la biodisponibilidad del fármaco [27], [28] o la activación de NF-kappa B [29]. Si DOX se combina con otros fármacos quimioterapéuticos, dosis más bajas pueden ser utilizados no sólo para reducir los efectos secundarios, sino también aumentar la eficacia [30].
En este estudio, hemos tratado de revertir la resistencia a fármacos de DOX y /o LMB en células A549 a través de diferentes regímenes terapéuticos de un co-tratamiento de DOX y LMB, así como evaluar sus mecanismos moleculares posibles. Se encontró que el tratamiento previo de DOX con el posterior tratamiento de LMB sensibiliza las células A549 resistentes a los medicamentos para el efecto quimioterapéutico de LMB. Estos cambios pueden ser el resultado de la activación inicial de p53 mediante tratamiento DOX y en consecuencia el bloqueo de la función CRM1 mediante tratamiento LMB para acumular p53 activada en el compartimento nuclear. Por otra parte, las vías de señalización que implican a moléculas distintas de p53 también podrían desempeñar un papel importante en la promoción de los efectos terapéuticos del tratamiento combinado de DOX y LMB.
Materiales y Métodos
Reactivos
La doxorrubicina (DOX) y dimetilsulfóxido (DMSO) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, MO. LMB (1 mM) se adquirió de LC Labs, Woburn, MA. Las existencias de DOX (10 mg /ml) y LMB se diluyeron a la concentración requerida inmediatamente antes de su uso con medios de cultivo. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) se adquirió de USB Corporation. RPMI-1640, penicilina /estreptomicina y suero fetal bovino (FBS) se adquirieron de Thermo Scientific, Logan, UT. Los anticuerpos primarios, incluyendo p53, p53 fosfo-(Ser15), fosfo-p53 (Thr55), p21, Sequestosome 1 (SQSTM1 /p62), y survivina, fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. policlonal de conejo primario anti-α-tubulina fue adquirido de Abcam, Cambridge, MA. peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con burro IgG anti-conejo y un kit de quimioluminiscencia potenciada (ECL) fueron adquiridos de GE Healthcare, Piscataway, NJ. ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) tampón de lisis se adquirió de Santa Cruz Biotechnology.
Células y cultivo celular
adenocarcinoma de pulmón humano epitelial líneas celulares A549 y NCI-H358 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC ). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 50 U /ml de penicilina, y 50 mg /ml de estreptomicina. Las células se incubaron a 37 ° C en un incubador humidificado con 95% de aire y 5% de CO
2 en volumen. Las células se subcultivaron o chapada para su posterior tratamiento hasta que se acercaron a aproximadamente el 80% de confluencia.
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT como se describe anteriormente [17]. Brevemente, las células se sembraron a 5 x 10
3 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Sobre la base de la citotoxicidad de DOX o LMB observada en este estudio y los informes anteriores [9], [12], [26], [31], [32], [33], 0,5 LMB nM o 0,5 M DOX fue seleccionado para co -tratamiento o tratamiento previo. Se trataron las células con lo siguiente: 1) DOX sola (0-5 M) durante 24 y 48 h; 2) LMB solo (0-10 nM) durante 24 y 48 h; 3) co-tratamiento de 0,5 nM y LMB DOX (0-5 M) simultáneamente (DOX + LMB (0,5 nM)) durante 24 y 48 h; 4) co-tratamiento de DOX 0,5 M y LMB (0-10 nM) de forma simultánea (LMB + DOX (0,5 M)) durante 24 y 48 h; 5) tratamiento previo de 0,5 LMB nM durante 24 h (pre-LMB) y la posterior DOX (0-5 M) durante 48 h (pre-LMB + DOX); y 6) el tratamiento previo de 0,5 M DOX durante 24 h (pre-DOX) y la posterior LMB (0-5 nM) durante 48 h (pre-Dox + LMB). El etanol (EtOH, 0,1%) se utilizó como el control de vehículo para LMB. Tres horas antes del final de cada punto de tiempo, se añadió 15 l de MTT (10 mg /ml) a cada pocillo y se incubó a 37 ° C. En cada punto de tiempo, cuando precipitado púrpura era claramente visible bajo el microscopio, se añadieron 100 l de 100% de DMSO a todos los pocillos y la viabilidad celular se determinó midiendo la absorbancia a 570 nm (longitud de onda de referencia = 630 nm) usando un SpectraMax Plus espectrometría fotómetro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se analizaron seis repeticiones en cada punto de concentración y tiempo. Los experimentos se realizaron de forma independiente por triplicado. controles y los blancos tratados con vehículo se incubaron en la misma placa en las mismas condiciones. absorbancia fraccional se calculó utilizando la siguiente fórmula:.% de viabilidad celular = absorbancia media en pocillos de ensayo /absorbancia media en pocillos de control × 100
Análisis de ciclo celular y apoptosis por citometría de flujo
Células se les dio primero pretratamiento de 0,5 M DOX durante 24 h y luego fueron tratados con LMB para adicional 48 h. Por lo tanto, las células se recogieron después de un total de 72 h de tratamiento. Basado en el ensayo de viabilidad celular, un total de 6 grupos de células A549 con diferentes tratamientos se analizaron, incluyendo el control, 0,5 M DOX (pre-DOX), 1 nM LMB (LMB1), pre-DOX y LMB 1 nM (pre- DOX + LMB1), 5 nM LMB (LMB5), y pre-DOX y 5 nM LMB (pre-DOX + LMB5). Para el análisis del ciclo celular, un total de 2 × 10
se recogieron y se fijaron en etanol al 70% durante más de 24 horas a 4 ° C 5 células de cada grupo de tratamiento. Las células se tiñeron con el Reactivo de guayaba Ciclo Celular (Millipore) y se ejecutará en un citómetro de flujo EasyCyte ™ guayaba (Millipore). Un total de 5 × 10
3 eventos se contaron, y el porcentaje de células en la pre-G1, G0 /G1, S y G2 /M fases del ciclo celular se determinaron utilizando software GuavaSoft (Millipore). Para el análisis de apoptosis, se realizó el ensayo para determinar ViaCount células viables y muertas. En resumen, la suspensión de células (5 × 10
5 células /ml) se mezcló con Guava ViaCount reactivo (Millipore), y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos para teñir las células. Las muestras de células teñidas se ejecutan en un citómetro de flujo EasyCyte ™ guayaba (Millipore). Un total de 5 × 10
3 eventos se contaron y los datos fueron adquiridos utilizando el software de guayaba ViaCount (Millipore). Cada muestra se realizó por triplicado y cada experimento se repitió tres veces.
Western Blot
Se analizaron los mismos grupos 6 de tratamiento de las células A549 como se describe en la citometría de flujo para la transferencia de Western. Las células en cada grupo se lisaron en tampón de lisis RIPA en hielo. Los lisados se sometieron a ultrasonidos y después se centrifugaron a 13.000 xg durante 5 min a 4 ° C para recoger el sobrenadante. Las concentraciones de proteínas se midieron usando el ensayo de proteínas Bio-Rad Bradford. Un total de 30 g de proteína por muestra se separó mediante electroforesis en gel de 12% SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y después se transfirió a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Las proteínas inmovilizadas fueron incubadas durante la noche a 4 ° C en tampón de bloqueo que contenía 3% de leche descremada en polvo en 1 × tampón fosfato salino (PBS) y 0,1% de Tween 20 (1 × PBST). Después del bloqueo, las membranas se probaron con el anticuerpo primario durante 1 h. Unión de los anticuerpos se detectó con burro anti-IgG de conejo-HRP a una dilución de 1:1,000 durante 1 h a temperatura ambiente. Después de una breve incubación con ECL, las señales de las membranas se expusieron a películas de rayos X (Fujifilm Corporation, Tokyo). análisis digital densitométrico relativo de las bandas de proteínas se determinaron utilizando software Quantity One (Bio-Rad) y se normalizó por la intensidad de la limpieza de genes (α-tubulina, 1:10,000 dilución) para cada muestra.
Efectos de DOX y LMB sobre la proteína nuclear Profile @
Para evaluar los efectos de DOX y LMB en proteínas, además de los de la vía de p53, un enfoque proteómico a base de gel, electroforesis en gel bidimensional-diferencia (2D-DIGE), fue el primer realizado para investigar los perfiles de proteínas nucleares después del tratamiento LMB. manchas de proteínas que muestran los cambios principales fueron identificados por espectrometría de masas por cromatografía líquida (LC /MS /MS) y confirmados por Western blot. Los cambios en la proteína (s) fueron evaluados en las células con el tratamiento combinado de DOX y LMB por Western blot.
extracción de proteínas nucleares.
Para el análisis proteómico, proteínas nucleares se extrajeron siguiendo los protocolos como descrito por Lu
et al
[34]. En breve, basado en nuestro estudio anterior [12], las células A549 o NCI-H358, tratados con control de vehículo (0,1% EtOH) o 20 nM LMB durante 24 h (por duplicado), se lavaron con PBS helado, se recogieron, y suspendido en helado de tampón a que contiene 10 mM Tris-HCl (pH: 7,4, Bio-Rad), 8 M urea (Bio-Rad), 4% (w /v) de 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propanesulfonato (CHAPS, Bio-Rad), 0,5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, Bio-Rad), mM MgCl
2 (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ), 0,5 mM PMSF (Santa Cruz Biotechnology), 1 2,5 × cóctel inhibidor de proteasa (Roche, Basilea, Suiza), y 1% (v /v) NP-40 (USB Corporation, Cleveland, OH). La mezcla se homogeneizó con una aguja de calibre 21, seguido por centrifugación del homogeneizado a 700 x g durante 10 min a 4 ° C para precipitar los núcleos. Se recogieron los extractos citoplasmáticos en los sobrenadantes y los pellets se resuspendieron en 1 ml de helado de tampón B (20 mM Tris-HCl, pH 8,5 y 1 × proteasa cóctel inhibidor), se sonicó en hielo, y se mezcla con 0.737 g de urea, 0,267 g tiourea y 0,07 g (w /v) de CHAPS. Después de la incubación en hielo durante 1 h, los sobrenadantes que contienen extractos nucleares se recogieron por centrifugación a 100.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. Las concentraciones de proteína se midieron por el ensayo de Bradford (Bio-Rad). Se determinó la calidad de extracción nuclear, y la proteína identificada fue confirmada por Western blots. α-tubulina (presente en el citoplasma) y la histona 3 (presente en el núcleo) se utilizaron para validar y confirmar la pureza de las fracciones de proteínas.
2D-DIGE.
extracciones de proteínas nucleares de 2D- DIGE se realizaron como se describe anteriormente [35]. En breves, extracciones de proteínas nucleares de A549 o células NCI-H358 con o sin tratamiento LMB (por duplicado) se marcaron en sentido inverso con Cy3 y Cy5, respectivamente (GE Healthcare). Los tubos que contienen 50 g de cada muestra se combinaron con 1 l de Cy3 o Cy5 diluida (400 pmol /l en N, N-dimetilformamida, Sigma). Después de la centrifugación, la mezcla se dejó en hielo durante 30 min sin exposición a la luz. A continuación, la reacción se detuvo mediante la adición de 1 l de lisina 10 mM (Sigma) y la colocación de las muestras en hielo durante 10 min en la oscuridad. Las muestras (que contienen 100 mg proteínas) marcadas con Cy3 y Cy5, se diluyeron a 300 l mediante la adición de tampón de rehidratación 2D (BioRad) que consiste en 8 M urea, 0,5% de CHAPS, ditiotreitol 10 mM (DTT, Bio-Rad), 0,2% biolytes anfolito, y traza de azul de bromofenol. Las muestras se aplicaron a tiras de 17 cm inmovilizado pH lineal 3-10 gradiente (IPG) (BioRad) para rehidratación durante la noche. El enfoque isoeléctrico se realizó a 250 V durante 20 minutos, aumentando gradualmente a 10 000 en 2,5 h, y se mantuvo a 10 000 V para un total de 50.000 horas de tensión (VH). tiras IPG se equilibraron posteriormente con tampón I (6 M urea, 2% SDS, 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20% de glicerol, DTT 130 mM, y trazas de azul de bromofenol) y tampón urea II (6 M, 2% SDS, 375 mM Tris-HCl, 20% de glicerol, 135 mM yodoacetamida, y trazas de azul de bromofenol). Las proteínas se separaron a continuación con 12% en geles de SDS-PAGE y se visualizaron usando un Typhoon Trio Imager (GE Healthcare) a longitudes de onda de excitación de 532 y 633 nm para Cy3 y Cy5, respectivamente. Las imágenes fueron manipuladas y se analizaron por DeCyder y software ImageQuant (GE Healthcare); Se calcularon las diferencias de intensidad de proteína por cada punto en cada gel.
En la digestión-gel.
Los geles se tiñeron con 2D-SYPRO Ruby (Bio-Rad). Puntos de interés fueron aislados utilizando un selector de punto, y se colocaron en un tubo Eppendorf de 0,5 ml para la digestión de tripsina en un ProGest (Genomic Solutions) de estaciones de trabajo [35]. En breve, los tapones de gel se lavaron con DIH
2O, y se trataron con acetonitrilo (ACN) durante 15 min. Las piezas de gel se rehidrataron con DTT 10 mM y bicarbonato de amonio 0,1 M (NH
4HCO
3) durante 30 min a 60 ° C en baño de agua. Tras la contracción de nuevo con ACN, una solución que contiene 55 mM de yodoacetamida (Bio-Rad) y 0,1 M de NH
4HCO se añadió
3 durante 20 minutos sin exposición a la luz, luego reemplazado por 0,1 M NH
4HCO
3 por 15 min. Los tapones de gel se lavaron posteriormente en 0,1 M NH
4HCO
3 por 5 min, mientras que la adición de un volumen igual de ACN durante 5 min. Después de repetir la etapa de lavado dos veces, las piezas de gel fueron deshidratadas por ACN, y después se secaron durante 30 min. piezas de gel individuales se rehidrataron en tampón de digestión que contiene 12,5 ng /l de tripsina (Promega), 40 mM NH
4HCO
3, y 10% de ACN en 37 ° C durante 4 h. Se añadió ácido fórmico para detener la reacción y el sobrenadante se analizó directamente.
LC /MS /MS de Identificación.
péptidos Trypsinized se analizaron mediante nano LC /MS /MS en un ThermoFisher LTQ Orbitrap SG. En resumen, 30 l de hidrolizado se cargó en una ID 5 mm x 75 micras C12 (Jupiter Proteo, Phenomenex) ventila la columna a una velocidad de flujo de 10 l /min. La elución en gradiente se llevó a cabo en un 15 cm por 75 m columna de ID C12 a 300 nL /min. Se empleó un gradiente de 30 min. El espectrómetro de masas fue operado en un modo dependiente de los datos, y se seleccionaron los seis iones más abundantes para MS /MS. resultados de la espectrometría de masas se realizaron búsquedas utilizando la mascota (www.matrixscience.com). Las muestras fueron procesadas en el algoritmo de Andamios usando archivos DAT generados por la mascota. Los parámetros para los datos LTQ XL Orbitrap requieren un mínimo de 2 Resultados por péptido proteína con probabilidades mínimas de 90% a nivel de proteínas.
Análisis estadísticos
ANOVA factorial se realizó para probar los efectos de DOX y /o concentraciones y tiempos de incubación LMB sobre la viabilidad celular. Se utilizó el análisis Probit para calcular los 50% las concentraciones inhibidoras (CI50). Para los datos obtenidos a partir de citometría de flujo, los porcentajes de células promedio se calcularon y se determinó la significación estadística mediante ANOVA de una vía y las pruebas post hoc. Para los niveles de expresión de proteínas entre el control, pre-DOX, LMB1, pruebas post hoc de pre-DOX + LMB1, LMB5, y pre-DOX + LMB5, ANOVA de una vía y de Tukey se utilizó para comparar la intensidad densitométrica de las muestras individuales entre los grupos. Para 2D-DIGE, análisis de imágenes se realizó con software DeCyder (GE Healthcare) y el software ImageMaster. Para el software DeCyder, el diferencial en gel módulo de análisis (DIA) se utilizó para procesar un par de imágenes de un solo gel, y realizar la detección in situ y la cuantificación. Se empleó el análisis de la variación biológica (BVA) para calcular los coeficientes entre las muestras y controles mediante la realización de un juego de gel a gel del par de mapas de puntos de cada gel. Las manchas con más de un cambio de dos veces en experimentos duplicados marcado inversa-en comparación con los controles fueron considerados como proteínas diana. Todos los análisis se realizaron utilizando el software SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE.UU.) y las diferencias con
P
. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
se llevó a cabo la citotoxicidad de DOX o LMB
El ensayo MTT para determinar la viabilidad celular en cada punto de tiempo. Como se muestra en la Figura 1A y 1B, tanto DOX y LMB proliferación celular significativamente inhibido de A549 en la dosis y de forma dependiente del tiempo (
P
& lt; 0,001). Las CI50 de DOX y LMB a las 48 h fueron 2,2 mM y 10,6 nM, respectivamente (Tabla 1). Del mismo modo, tanto DOX y LMB proliferación celular, inhibió de NCI-H358 de la dosis y de manera dependiente del tiempo (
P Hotel & lt; 0,001, Figura S1 A y S1B)
A, citotóxica. efectos de DOX solos y DOX + LMB sobre la viabilidad celular de las células A549 como se determina por el ensayo MTT. Los datos se expresan como el porcentaje en comparación con el control de vehículo para DOX y LMB (0,5 nM) para DOX + LMB. Los valores se representan como media ± SD, n = 6. B, los efectos citotóxicos de la LMB solos y LMB + DOX sobre la viabilidad celular de las células A549 como se determina por el ensayo de MTT. Los datos se expresan como el porcentaje en comparación con el control de vehículo para LMB y DOX (0,5 M) para LMB + DOX. Los valores son medias ± SD, n = 6. C, los efectos citotóxicos de DOX solos y pre-LMB + DOX sobre la viabilidad celular de las células A549 a las 48 h como se determina por el ensayo de MTT. Los datos se expresan como el porcentaje en comparación con el control de vehículo para DOX y pre-LMB para pre-LMB + DOX. Los valores son medias ± SD, n = 6. D, los efectos citotóxicos de la LMB solo y pre-DOX + LMB sobre la viabilidad celular de las células A549 a las 48 h como se determina por el ensayo de MTT. Los datos se expresan como el porcentaje en comparación con el control de vehículo para LMB y pre-DOX para pre-DOX + LMB. Los valores son medias ± SD, n = 6. Los experimentos realizados por triplicado dieron resultados similares.
citotoxicidad de Co-tratamiento de DOX y LMB
Al igual que en DOX o LMB grupos, DOX + LMB (0,5 nM) o LMB + DOX (0,5 M) inhibió la proliferación de A549 de la dosis y de forma dependiente del tiempo (
P
& lt; 0,001, Figura 1A y 1B). Sin embargo, los tratamientos simultáneos de DOX + LMB (0,5 nM) o LMB + DOX (0,5 M) no cambiaron los efectos citotóxicos en las células A549 en comparación con DOX solo o LMB sola en ambos 24 y 48 h (
P
& gt; 0,05, Figura 1A y 1B). Las CI50 de DOX + LMB (0,5 nM) y LMB + DOX (0,5 M) a las 48 h fueron 2,1 mM y 10,4 nM, respectivamente (Tabla 1). Del mismo modo, los tratamientos simultáneos de DOX + LMB (0,5 nM) o LMB + DOX (0,5 M) no cambiaron los efectos citotóxicos en las células NCI-H358 en comparación con DOX solo o LMB sola en ambos 24 y 48 h (
P
& gt;. 0.05, Figura S1A y S1B)
citotoxicidad de pre-LMB + DOX o pre-DOX + LMB
Como se muestra en la Figura 1C, LMB pretratamiento de 0,5 nM no potenciar los efectos citotóxicos de DOX en células A549 a las 48 h en comparación con DOX sola (
P
& gt; 0,05). Las CI50 de 48 h de pre-LMB + DOX y DOX solos eran 2,8 y 2,2 M, respectivamente (Tabla 1). Sin embargo, el tratamiento previo de 0,5 M DOX aumentó significativamente el efecto citotóxico de LMB en células A549 a las 48 h (
P
& lt; 0,05, Figura 1 D). El IC50 en 48 h de pre-DOX + LMB era 4,4 nM, que fue significativamente menor que la de LMB solo (10,6 nM,
P
= 0,037, Tabla 1). Por otra parte, ya sea antes de LMB o pre-DOX no mejoraron los efectos citotóxicos de DOX o LMB sobre las células NCI-H358 (
P Restaurant & gt; 0,05, Figura s1c y S1D).
Efectos de DOX y LMB en el ciclo celular y la apoptosis
inhibición de la proliferación de la célula
podría ser el resultado de cualquiera de la detención del ciclo celular o apoptosis, por lo tanto estos dos aspectos se examinaron por citometría de flujo análisis de las células A549 después de LMB y tratamiento DOX. El análisis del ciclo celular reveló que el porcentaje de células en G2 /M fueron 15,1 ± 0,4, 26,9 ± 2,8, 22,7 ± 1,0, 22,9 ± 4,2, 22,5 ± 2,8, y 18,6 ± 1,3 en el control, pre-DOX, LMB1, pre -DOX + LMB1, LMB5, y pre-DOX + LMB5, respectivamente (Tabla 2). Pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, y pre-DOX + LMB5 todos dieron lugar a una acumulación en la fase G2 /M versus control (
P
& lt; 0,05, Figura 2 y la Tabla 2 ). Además, el análisis del ciclo celular reveló que el porcentaje de células en pre-G1 fueron 5,4 ± 2,2, 9,0 ± 2,1, 8,2 ± 2,0, 18,6 ± 7,1, 10,2 ± 4,7, y 27,5 ± 2,8 en el control, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, y pre-DOX + LMB5, respectivamente (Tabla 2). Pre-DOX + LMB1 y pre-DOX + LMB5 dieron lugar a una acumulación definitiva en la fase de pre-G1 en comparación con el control no sólo, sino también LMB solo (
P Hotel & lt; 0,01, Figura 2 y Tabla 2). Análisis de apoptosis reveló que el tratamiento con LMB indujo significativamente la apoptosis de células (
P
& lt; 0,01, Tabla 2). La apoptosis se incrementó aún más después de las células fueron co-tratado con pre-DOX y LMB en comparación con LMB solo (
P
& lt; 0,01, Tabla 2). El porcentaje de células apoptóticas fueron 13,2 ± 1,6, 15,8 ± 2,6, 19,2 ± 2,4, 27,1 ± 0,6, 22,4 ± 4,0 y 29,6 ± 2,1 en el control, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, y pre -DOX + LMB5, respectivamente (Tabla 2).
histogramas representativos de los análisis del ciclo celular en células A549 DOX y tratados con LMB. Control, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, y pre-DOX + LMB5 se recogieron y se marcaron con Reactivo Ciclo Celular Guava (Millipore) y se analizaron por citometría de flujo (pre-G1, G0 /G1, S, y G2 /M). El eje y muestra el número de células contadas y el eje x muestra una cantidad cada vez mayor de guayaba Reactivo Ciclo Celular incorporación /célula (de izquierda a derecha). Los experimentos realizados por triplicado dieron resultados similares. LMB1: 1 nM LMB, LMB5:. 5 nM LMB
Los análisis de transferencia Western de p53, p53 fosfo-(Ser15), fosfo-p53 (Thr55), p21, y la expresión de la proteína survivina después de DOX y Tratamiento LMB
los niveles de expresión de p53, fosfo-p53 (Ser15), y p21 (una diana aguas abajo de p53) se incrementaron significativamente en las células tratadas con pre-DOX + LMB que los de los controles y mostró un efecto dosis-respuesta significativa (Figura 3A). Los niveles relativos de expresión de proteína de p53 (unidades arbitrarias) fueron 0,02 ± 0,00, 0,03 ± 0,00, 0,07 ± 0,00, 0,13 ± 0,03, 0,45 ± 0,01 y 0,44 ± 0,00 en el control, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, y pre-DOX + LMB5, respectivamente (Figura 3B,
P
. & lt; 0,05, LMB1
vs
control;
P Hotel & lt; 0,01, pre -DOX + LMB1, LMB5, o pre-DOX + LMB5
vs.
control). Los niveles relativos de expresión de proteínas de fosfo-p53 (Ser15) (unidades arbitrarias) fueron 0,06 ± 0,00, 0,06 ± 0,00, 0,13 ± 0,03, 0,15 ± 0,01, 0,21 ± 0,01 y 0,77 ± 0,04 en el control, pre-DOX, LMB1 , pre-DOX + LMB1, LMB5, y pre-DOX + LMB5, respectivamente (Figura 3B,
P Hotel & lt; 0,05, LMB5
vs
control;.
P
& lt; 0,01, pre-DOX + LMB5
vs
control).. Por otra parte, la sobre regulación de fosfo-p53 (Ser15) en pre-DOX + LMB5 fue significativa en comparación con el grupo LMB5 (
P Hotel & lt; 0,01). Niveles relativos de expresión de proteína de p21 (unidades arbitrarias) fueron 0,29 ± 0,08, 0,69 ± 0,01, 0,85 ± 0,09, 1,07 ± 0,03, 1,14 ± 0,08 y 1,57 ± 0,02 en el control, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1 , LMB5 y pre-DOX + LMB5, respectivamente (Figura 3B,
P Hotel & lt; 0,01, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, y pre-DOX + LMB5
vs.
control). Por otra parte, la sobre regulación de p21 en la pre-DOX + LMB5 fue significativa (
P Hotel & lt; 0,05). Comparado con el grupo LMB5
A, Efectos de pre-tratamiento DOX + LMB en la expresión de la proteína de p53, fosfo-p53 (Ser15), fosfo-p53 (Thr55), p21, y la survivina en A549. Las células se trataron con 0,5 mM DOX 24 h antes del tratamiento con LMB (1 nM o 5 nM). Después de 48 h de tratamiento LMB, se recogieron las células para el análisis de Western blot para determinar los niveles de proteína. Blots también se probaron para la α-tubulina para confirmar la igualdad de la carga de proteínas. B, Las intensidades relativas de proteína de p53, fosfo-p53 (Ser15), fosfo-p53 (Thr55), p21, y la survivina en comparación con la intensidad de α-tubulina. La intensidad de cada banda se cuantificó usando Quantity One software. Los datos son medias ± SD, n = 3. Los experimentos se realizaron por triplicado. LMB1: 1 nM LMB; LMB5: 5 nM LMB; *,
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control; **,
P
& lt; 0,01 en comparación con el control; #,
P Hotel & lt; 0,05, comparado con LMB5; ##,
P
. & Lt; 0,01, comparado con LMB5
A diferencia de p53, fosfo-p53 (Ser15), y los niveles de expresión de p21, p53 fosfo-(Thr55) y survivin (otro objetivo aguas abajo de p53) los niveles de expresión fueron significativamente dependiente de la dosis y disminuyó en las células tratadas con pre-DOX + LMB en comparación con los de los controles (Figura 3A). Los niveles relativos de expresión de proteínas de fosfo-p53 (Thr55) (unidades arbitrarias) fueron 0,67 ± 0,06, 0,56 ± 0,01, 0,65 ± 0,01, 0,57 ± 0,00, 0,56 ± 0,01 y 0,42 ± 0,00 en el control, pre-DOX, LMB1 , pre-DOX + LMB1, LMB5, y pre-DOX + LMB5, respectivamente (Figura 3B,
P
. & lt; 0,01, pre-DOX + LMB5
vs
control). Los niveles relativos de expresión de proteínas de survivina (unidades arbitrarias) fueron 0,28 ± 0,02, 0,23 ± 0,03, 0,23 ± 0,05, 0,14 ± 0,01, 0,12 ± 0,05 y 0,08 ± 0,00 en el control, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, y pre-DOX + LMB5 grupos, respectivamente tratadas (Figura 3B,
P
. & lt; 0,05, pre-DOX + LMB5
vs
control).
Efectos de DOX y LMB sobre el perfil de proteínas nucleares
extracción de proteínas nucleares.
la pureza de las proteínas nucleares y citoplasmáticas se puso a prueba utilizando el análisis de Western blot con anti-histona 3 y anti-α-tubulina . La mayoría de α-tubulina se encontró sólo en la fracción citoplásmica de A549 y las células NCI-H358; histona 3 se encontró sólo en la fracción nuclear de células A549 y NCI-H358, lo que sugiere que la preparación se enriquece en proteínas nucleares (Figuras 4A y S2A).
A, transferencia de Western de las extracciones de proteínas nucleares y citoplasmáticas de A549; α-tubulina sirve como un control interno para las proteínas citoplásmicas, y la histona 3 sirvió como control para las proteínas nucleares. B, 2D-DIGE análisis de proteínas nucleares en células A549 y vistas en 3D de SQSTM1 en células A549 con el control del vehículo o el tratamiento LMB. proteínas nucleares tratados con LMB o vehículo de control se marcaron con Cy3 (canal verde) y Cy5 (canal rojo), respectivamente. proteínas nucleares fueron separados sobre la base de punto isoeléctrico (PI, eje horizontal) y el peso molecular (MW, eje vertical).