Extracto
Antecedentes
γ-radiación es un tratamiento eficaz para el cáncer. Hay pruebas de que la radioterapia apoya inmunidad específica de tumor. Se describió que la irradiación induce la síntesis de proteínas de novo y mejora la presentación de antígenos, por lo que investigó si los resultados γ-radiación en aumento de la expresión de antígenos de cáncer de testículo-(TC) y MHC-I, lo que permite control inmunológico eficiente. Esto es relevante porque la expresión de antígenos CT-I y MHC-en las células tumorales puede ser muy heterogéneo. Hemos encontrado que los cambios inducidos por la radiación γ-promover el reconocimiento inmunológico del tumor, que se ilustra por la infiltración aumentado por los linfocitos después de la radioterapia.
Métodos /Hallazgos
Se comparó la expresión de CT-antígenos y MHC-I en diversas líneas celulares de cáncer y biopsias frescas antes y después de
in vitro
irradiación (20 Gy). Además, se compararon las biopsias que fueron tomadas antes y después de la radioterapia de pacientes con sarcoma emparejado. Para investigar si la expresión cambiada de CT-antígenos y MHC-I es específico para γ-radiación o es parte de una respuesta de estrés generalizado, se analizó el efecto de la hipoxia, hipertermia y el estrés genotóxico en la expresión de CT-antígenos y MHC YO.
In vitro
irradiación de líneas celulares de cáncer y de biopsias de tumores frescos indujo una o la moda superior de novo expresión de diferentes antígenos CT-y una mayor expresión de MHC-I en un tiempo y dependiente de la dosis. Es importante destacar que, se muestra que la irradiación de las células cancerosas aumenta su reconocimiento por las células T CD8 + específicos de tumores. El análisis de las biopsias pareadas tomadas de una cohorte de pacientes con sarcoma antes y después de la radioterapia confirmado nuestros resultados y, además mostró que la irradiación produjo una mayor infiltración de linfocitos. Otras formas de estrés no tuvieron un impacto en la expresión de CT-antígenos o MHC-I.
Conclusiones
Nuestros hallazgos sugieren que la radiación γ-promueve el reconocimiento inmunológico del tumor. Por tanto, proponemos que la combinación de radioterapia con tratamientos que apoyan la inmunidad tumoral específica puede resultar en una mayor eficacia terapéutica
Visto:. Sharma A, B Bode, Wenger RH, Lehmann K, Sartori AA, Moch H, et al. (2011) γ-radiación Promueve Inmunológico El reconocimiento de las células del cáncer a través de la expresión aumentada de cáncer de testículo antígenos
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 6 (11): e28217. doi: 10.1371 /journal.pone.0028217
Editor: Ilya Ulasov, Universidad de Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 2 de mayo de 2011; Aceptó 3 de noviembre de 2011; Publicado: 29 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Sharma et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Ludwig para la Investigación del cáncer /Instituto de Investigación del cáncer (cáncer antígeno Descubrimiento de colaboración), Atlantic Philanthropies, el Instituto de Investigación del cáncer, la Fundación Hanne Liebermann, la Fundación Hartmann Muller, la Fundación Terry Fox y la Fundación Ellinger, Universidad Med Alumini de Zurich (www.alumuni.uzh.ch). Alessandro A. Sartori es apoyado por la Fundación Vontobel-y por una beca ambizione de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (FNS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
γ-radiación o radioterapia es uno de los tratamientos más usados para el cáncer [1]. La irradiación induce la muerte de las células tumorales [2], [3], pero no hay pruebas de que la inmunidad adaptativa contribuye significativamente a la eficacia de la radioterapia [4]. Por ejemplo, los tumores irradiados en pacientes y en ratones son más a menudo infiltradas por leucocitos que los tumores no irradiados [5], [6], [7] y los estudios muy recientes en modelos preclínicos mostraron que la eficacia de la radioterapia depende de la presencia de CD8 células
+ T [8]. El hecho de que los tumores están dirigidos y controlados por CD8
+ células T se sugiere por el aumento de la incidencia de tumores en pacientes inmunodeprimidos [9], [10], [11] y por el hecho de que la inmunidad específica de tumor se puede detectar en pacientes con cáncer [12], [13], [14], [15]. A medida que el reconocimiento de células tumorales por
células CD8 + T depende de la presentación de antígenos asociados a tumores (TAA) en el contexto de moléculas MHC-I, la expresión a menudo heterogénea de TAA y /o MHC-I dentro de una tumor impacta negativamente sobre la eficacia de la inmunidad específica de tumor. En el presente estudio se preguntó a la pregunta específica si la irradiación induce o hasta regula la expresión de un grupo prominente de los AAT, los llamados CT-antígenos. El CT-antígenos forman una familia de antígenos que se expresan en una gran variedad de tumores malignos, pero están ausentes de tejido sano a excepción de los testículos y la placenta [16], [17]. Los pacientes de cáncer a menudo desarrollan respuestas inmunes espontáneas hacia CT-antígenos, lo que ilustra su inmunogenicidad [18]. Debido a su inmunogenicidad y el patrón restringido de expresión, CT-antígenos se consideran objetivos prometedores para la inmunoterapia en pacientes con cáncer [19], [20]. Hemos observado que la irradiación indujo un mayor o un
de novo
expresión de diferentes CT-antígenos, así como una regulación de MHC-I de expresión en varias líneas celulares de cáncer y en fresco,
ex vivo
irradiado biopsias de tumores. Es importante destacar que la comparación de las secciones del tumor pareadas obtenidas de pacientes con sarcoma antes y después de la irradiación mostró hasta reguladas o
de novo
expresión de MHC-I y CT-antígenos y el consiguiente incremento de la infiltración
+ células T CD8 , lo que sugiere que la irradiación moviliza, respuestas inmunes específicas de tumores locales. Por otra parte, nuestros resultados indican que una combinación de radioterapia y la inmunización activa con CT-antígenos relevantes puede ser una modalidad de tratamiento con una mayor eficacia en comparación con la terapia sea solos.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el comité de ética "comité ético del cantón de Zurich" específicamente aprobado este estudio (estudio nº: EK-1017)..
Células
las líneas celulares
MDA-MB-469, 7 (líneas celulares de cáncer de mama) MDA-MB-231 y MCF, MCF 10A (línea de células de mama normales, inmortalizadas, no transformadas), SAOS, LM5, 143B, HOS, HU09, y M132 (líneas de células de osteosarcoma), A549, H460, Calu1 y, SK-MEL-37 (línea de células de melanoma) y PC3 y DU145 (líneas celulares de cáncer de próstata) se obtuvieron de American Type Culture Collection Calu3 (líneas celulares de cáncer de pulmón) (Manassas, VIRGINIA). Las líneas celulares de osteosarcoma fueron un regalo del Dr. Bruno Fuchs (Departamento de Ortopedia de la Universidad Clínica Balgrist, Zurich). Todas las líneas celulares y biopsias se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO), L-glutamina y antibióticos. PC3 y DU145 se cultivaron en medio DMEM (Invitrogen), que contiene 10% de FBS, L-glutamina y antibióticos.
células humanas primarias.
queratinocitos de prepucio humano en forma de un regalo del doctor Onur Boyman (Departamento de Dermatología, hospital Universitario de Zurich) y se cultivaron en queratinocito medio libre de suero (K-SFM; Invitrogen), suplementos (EGF humano recombinante y pituitaria bovina extracto; Invitrogen), L-glutamina y antibióticos como se describe [21] . Fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) se obtuvieron de PromoCell GmbH (Heidelberg, Alemania). Se obtuvieron células endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1) como un regalo del Dr. Teresa Resink (Departamento de Biomedicina, Hospital Universitario de Basilea) y se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen) suplementado con FBS al 5% (Sigma-Aldrich ) y antibióticos. fibroblastos de pulmón humano (MRC-5) se obtuvieron como un regalo del doctor Giancarlo Marra (IMCR, Zurich) y se obtuvieron originalmente de Coriell Cell Repositories (Camden, Nueva Jersey) y se cultivaron en medio MEM (Invitrogen), que contiene 15% de SFB, L-glutamina y antibióticos. Se establecieron células ZT-821 (células renales primarias) en nuestro laboratorio a partir de una suspensión de células de tejido del riñón sano. Las células NHDF y ZT-821 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen) que contiene 10% de FBS (Sigma-Aldrich), L-glutamina y antibióticos.
El tratamiento de células
radiación ionizante.
Las células y las biopsias de tumores frescos fueron expuestos a radiación gamma de una
fuente de 60Co. Las dosis de radiación utilizadas se describen en cada experimento.
hipertermia.
Las células fueron incubadas a 42 ° C durante 1 hora o 5 h y se cultivaron a continuación durante 72 horas a 37 ° C. Las células tratadas y no tratadas se procesaron a continuación para el análisis por RT-qPCR.
hipoxia.
Las células se incubaron en condiciones hipóxicas (1% O
2 vol /vol) en una estación de trabajo hipóxica (InVivoO
2-400, Ruskinn Tecnología, Leeds, Reino Unido) para diferentes puntos de tiempo (8 h, 48 h o 72 h). Las células tratadas y no tratadas se procesaron a continuación para el análisis por RT-qPCR.
estrés genotóxico.
Las células se trataron a 37 ° C con 1 mg /ml de cisplatino (Sigma-Aldrich Corp . St. Louis, MO) durante 24 h o con 15 M etopósido (Sigma-Aldrich) durante 1 h o con 150 bleomicina mu M (Sigma-Aldrich) durante 1 h. Este punto de tiempo se consideró como T
0. Al final del tratamiento, el medio se reemplazó con medio de cultivo fresco sin la droga. Las células se cultivaron a continuación para otras 72 h a 37 ° C. Los cultivos de control se trataron bajo condiciones experimentales similares en ausencia de la droga.
inhibidores de moléculas pequeñas de proteína quinasa.
Una concentración de stock de 10 mM en 100% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) especificar inhibidores de la ataxia telangiectasia mutada (ATM), KU 55933 (Tocris biociencia, Ellisville, MO) y ADN dependiente de la proteína quinasa subunidad catalítica (DNA-PKcs), NU7441 (Tocris Bioscience) se diluyeron a una concentración de trabajo de 10 M en el 1% DMSO. Se añadieron los inhibidores de 1 h antes de la irradiación, y se dejaron en la cultura durante todo el experimento. Los cultivos de control se trataron bajo condiciones experimentales similares en ausencia de la droga con 1% de DMSO.
biopsias de tumores
Las biopsias se obtuvieron del Hospital de la Universidad de Zurich. Todos los pacientes fueron sometidos a cirugía como parte del tratamiento estándar y firmaron el consentimiento informado. El comité de ética "comité ético del cantón de Zurich" específicamente aprobado este estudio (estudio nº: EK-1017). Inmediatamente después de la resección, las biopsias fueron cortadas en pedazos múltiples de 2-4 mm
3. Las piezas fueron asignados al azar en dos grupos y se ponen en medio de cultivo. Un lote se irradió con una dosis única de 20 Gy, mientras que el otro lote sirvió como control. Las piezas tumorales se cultivaron durante 72 h después de
ex vivo
radiación y la expresión génica se determinó por análisis RT-qPCR. biopsias pareadas por sarcoma de antes y después de la irradiación se recogieron para otro propósito y por lo tanto los puntos de tiempo de recogida después de la radioterapia varió entre 2-6 semanas. Los tumores fueron irradiados
in vivo
con un acelerador lineal y recibió una dosis de 50-64 Gy.
La extracción de RNA y preparación de ADNc
El ARN total fue extraído utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) y se digirió posteriormente con ADNasa I (Invitrogen). La concentración y la pureza se evaluó utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). 150 ng de ARN transcrito fue inversa utilizando la alta capacidad de cDNA transcripción reversa Kit (Applied Biosciences, Foster City, CA). El cDNA se utilizó inmediatamente para reacciones de RT-qPCR o se almacenaron a -20 ° C hasta su uso. Todos los kits se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
RT-qPCR
La expresión de antígenos CT-I y MHC-se analizó utilizando cebadores TaqMan análisis de genes y TaqMan 1x mezcla maestra universales (Applied Biosystems) en un termociclador RotoGene (Corbett Research, Sydney, NSW). La mezcla de reacción (10 l) consistía en 1 l de cDNA, agua 3,5 l, 0,5 l de imprimación y 5 l TaqMan 1x mezcla maestra universal. Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclo: 2 min 50 ° C, 10 min 95 ° C, 45 ciclos de 15 s a 95 ° C, 1 min 60 ° C. El cambio en los niveles de expresión de CT-antígenos y MHC-I se da como el aumento de veces en la expresión mediante la comparación de los valores de delta-Ct del tratado a la de las muestras no tratadas después de la normalización de 18S rRNA. Los valores de Ct & gt; 38 ciclos se interpretaron tal que el gen no se expresa y una expresión pliegue & lt; 2 se consideró como ningún cambio. Cada una de las líneas celulares de cáncer de mama y de osteosarcoma se ensayaron en dos experimentos independientes y el carcinoma de pulmón y las líneas celulares de carcinoma de próstata en uno. Cada muestra se cargó en los duplicados /triplicados para cada uno de los experimentos de RT-qPCR.
citometría de flujo
Las células se tiñeron con marcado con PE anti-HLA-A, B, C (clon G46 -2,6, 1:100), marcado con FITC anti-β2-microglobulina (TU99 clon, 1:100) (BD Pharmingen, San Diego, CA) y yoduro de propidio (PI; Sigma). Las muestras se midieron con un FACS Calibur (BD) y se analizaron con el software FlowJo (TreeStar) después de gating en células vivas (PI-negativas). Se utilizaron controles de isotipo apropiados.
La inmunohistoquímica
fijados con formalina, secciones de tejido incluidas en parafina pareadas obtenidas de pacientes con sarcoma antes y después de la irradiación se tiñeron con anticuerpos monoclonales anti-ratón humanos contra CD4 (clon 1F6, 01:30, Zymed Laboratories Inc.), CD8 (clon C8 /114B, 1:100, DAKO A /S, Carpinteria, CA), granzima B (clon Gr B-7, 01:25, DAKO A /S ), MHC-I (clon C21, 1:1000, Research Diagnostics RDI, Inc.), CT7 (clon CT7-33, 1:80, Dako A /S), CT10 (policlonal de conejo, 1:500, Proteintech Grupo, Inc.), NY-ESO-1 (clon E978, 01:50, Zymed) y perforina (clon 5B10, 1:20, Novocastra Laboratories Ltd). Las secciones se contratiñeron con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron. Todas las secciones se tiñeron bien con el sistema Ventana Benchmark automatizado de tinción (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) utilizando reactivos Ventana de todo el procedimiento de NY-ESO-1, CT7, granzima B, CD4, CD8 y perforina y BondMax (Vison BioSystems , Newcastle upon Tyne, Reino Unido) para CT10 y MHC-I. UView (Ventana) o Refinar DAB (Vision BioSystems) fueron utilizados como cromógenos contra los anticuerpos primarios. Las imágenes de las secciones teñidas fueron adquiridas en Zeiss Axiovert-200 M (Carl Zeiss Microscopía de Luz Göttingen, Gearmany) Microscopio inversa utilizando el sistema de formación de imágenes Carl Zeiss Axiovision CD28. Las tinciones se puntuaron en una escala de 0 a 5 para la expresión de NY-ESO-1, MAGE-C1 /CT7, y MAGE-C2 /CT10 como un porcentaje, basado en el número de células positivas que expresan el antígeno al total número de células en un campo de alta potencia (HPF) utilizando una lente objetivo de 40X. La puntuación para MHC-I de expresión se realiza en base a la intensidad de la tinción. Los infiltrados tumorales se calcularon como el número de células que expresan CD4, CD8 y granzima por HPF utilizando un objetivo 40X. Cada sección teñida se evaluó en cinco regiones diferentes (para una lista detallada de las puntuaciones ver Tabla S4). Tres individuos realizan el marcador a ciegas y de forma independiente para las tinciones de MHC-I y dos individuos realizaron el marcador a ciegas para las otras coloraciones.
inmunofluorescencia
Las células (células en 10'000-20'000 1 ml de medio) se sembraron en portaobjetos de cultivo compartimentados (BD Biosciences) adherir durante la noche. Las células fueron fijadas con 4% de paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente, se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) durante 5 min a temperatura ambiente, seguido de bloqueo con 10% de BSA /PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Las células fueron incubadas con anticuerpos de ratón monoclonales contra NY-ESO-1 (clon E978, 1:500, Invitrogen) o MAGE-C1 /CT7 (clon CT7-33, 1: 500, Dako) en 10% de BSA /PBS durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad, seguido de incubación con FITC de cabra marcada con anticuerpo secundario anti-ratón IgG1 (Poly4053, 1:2000, Biolegend) durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Los portaobjetos se contratiñeron con 4 ', 6'-clorhidrato diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:500) durante 2 minutos en la oscuridad y se inspeccionaron utilizando un Zeiss Axiovert-microscopio 200 inversa M y un sistema de imágenes Carl Zeiss Axiovision CD28.
Western blot análisis
irradiado y las células no irradiadas fueron revisados para la expresión de la proteína usando anticuerpos monoclonales de ratón contra NY-ESO-1 (clon E978, 1:500, Invitrogen) o MAGE C1 /CT7 (clon CT7-33, 1: 500, Dako) y β-actina (clon 4i374, 1:8000,
Santa Cruz Biotech
, CA). El efecto de los agentes genotóxicos y DNA-PKcs y la inhibición de ATM, en la expresión génica inducida por γ-irradiación en las células se evaluó mediante el uso de anticuerpos contra pS2056-DNA-PKcs (policlonal de conejo a fosfo S2056-DNA-PKcs, 1:300, Abcam Inc, MA), FANC-D2 (clon FL17, 1:200,
Santa Cruz Biotech
, CA), pS1981-ATM (EP1890Y clon, 1:5000, Eitomics, CA) y PS15-p53 (clon 16G8, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA). Seguido de incubación con el anticuerpo secundario, anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG1 de ratón HRP (Poly4053, 1:10000, Biolegend) o policlonal de cabra HRP anti-conejo (1:10000, Abcam). ECL reactivo (Amersham, Reino Unido) se utilizó como sustrato de luminiscencia.
CD107a desgranulación Ensayo
El reconocimiento de las células que expresan NY-ESO-1 después de la irradiación por antígeno específico CD8
+ células T se ensayó usando el ensayo de desgranulación de CD107a. Tres x 10
5 NY-ESO-1
157-165 /HLA-A2-específica clonado CD8
+ células T (generadas como se describe [22]) se incubaron con 10
6 CFSE- marcada (1 M) HLA-A2
+ MDA-MB-469 células - que eran o no se irradiaron con 20 Gy 72 h antes - en una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos en un volumen final de 200 l RPMI + 10 % de FCS y antibióticos en presencia de marcado con PE anti-CD107a (1:20, BioLegend, SD, California). Como control positivo, las células MDA-MB-469 se cargaron con 10
-6 M NY-ESO-1 157-165 péptido
. Dos clones independientes de las células T (2A7 y 2B5) se utilizaron y se realizaron todas las culturas por duplicado. La incubación se realizó a 37 ° C durante 4 h. Se recogieron las células y se lavaron en 2 ml FACS-buffer (FB), seguido por tinción con azul Pacífico marcado con anti-CD8 (BioLegend) en 50 l FB durante 30 min a 4 ° C. Las células se lavaron una vez con 2 ml FB y se resuspendieron en 200 l FB. Las muestras se midieron en cian ADP9 (Beckman Coulter, FL, EE.UU.) y se analizaron con el software FlowJo (TreeStar).
Resultados
in vitro
γ-radiación ascendente regula la transcripción de CT-antígenos y moléculas MHC-I
mama, osteosarcoma, cáncer de pulmón y de próstata y células primarias normales fueron expuestos a una radiación de una sola dosis de 20 Gy, después de 72 h se recogieron y analizaron las células para la expresión de CT-antígenos y MHC-I por RT-qPCR. La mayoría de estas líneas celulares de cáncer expresaban niveles indetectables o muy bajos de CT-antígenos bajo condiciones de cultivo estándar. En contraste, las células gamma-irradiado mostraron
de novo o la expresión regulada hasta de varios CT-antígenos de forma aleatoria (Figura 1A-D). En un panel de los tipos de líneas celulares de cáncer de cuatro, se encontró γ-radiación para tener el efecto más profundo en las líneas celulares de cáncer de mama y el osteosarcoma y el menos en las líneas celulares de cáncer de próstata. La regulación de MHC-I y CT-antígenos sobre γ-radiación parece ser una característica específica de las células malignas, ya que esto no se observó en ninguna de las células primarias normales que hemos probado aquí (ZT-812, prepucio humano queratinocitos , HMEC-1, MRC-5, NHDF y MCF 10A, Figura S1 A, S1B). La línea celular de melanoma SK-MEL-37 es conocida para expresar todas CT-antígenos de la prueba en condiciones de cultivo normales y por lo tanto se incluyó como control positivo. La irradiación de esta línea celular dio lugar a una clara regulación de todos los antígenos CT y MHC-I (datos no mostrados). Hemos detectado un aumento de la expresión de CT-antígenos y MHC-I tan pronto como 24 h después de la irradiación en algunos casos y no se observó un aumento constante en la expresión génica de hasta 96 h después de la irradiación. Como se observó muerte celular sustancial a las 96 h después de la irradiación, se realizó un análisis de todo aún más a las 72 h después de la irradiación. A medida que la radioterapia se puede administrar como una sola dosis alta (20 Gy) o como dosis fraccionadas, irradiamos líneas celulares seleccionadas (las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-469 y MCF7, así como las líneas celulares de osteosarcoma SAOS, HOS, LM5 y 143B, con 2 Gy por día en 10 días consecutivos. Este protocolo resultó en cambio similar de CT-antígeno y la expresión de MHC-I como se ha observado con una dosis única de 20 Gy (Figura S2A, S2B). una sola dosis de 20 Gy se utilizó en todos los experimentos posteriores.
líneas celulares de cáncer de la empresa fueron expuestos a la radiación sola dosis de 20 Gy y la expresión de mRNA de CT-antígenos MHC-I y se determinó 72 h más tarde por RT-qPCR. (a ) líneas celulares de cáncer de mama, líneas celulares de cáncer de próstata (B) líneas celulares de osteosarcoma, (c) líneas de células de cáncer de pulmón, (D). Todos los valores de Ct se normalizan a 18S rRNA y los datos se presentan como el incremento de veces de la expresión en irradiado en comparación con las muestras no tratadas correspondientes. Dado que la expresión veces no se puede calcular para los genes que están
de novo
expresada tras la irradiación, ponemos los símbolos en tales casos por encima de la línea horizontal fina en (a).
in vitro
γ-radiación hasta regula CT-antígenos y moléculas MHC-I a nivel de proteínas
Para confirmar la expresión inducida por irradiación de CT-antígenos en el nivel de proteínas, se tiñeron irradiados y no irradiados células MDA-MB-469 con anticuerpos contra NY-ESO-1 y CT7 y analizamos la expresión de CT7 y NY-ESO-1 en diferentes puntos de tiempo después de la irradiación mediante microscopía de inmunofluorescencia y mediante transferencia Western. La línea celular de melanoma SK-MEL-37 expresa constitutivamente NY-ESO-1 y CT7 y se utilizó como control positivo. Observamos la
de novo
expresión tanto de los CT-antígenos tras la irradiación que aumentó con el tiempo (Figura 2A, 2B), lo que confirma los datos obtenidos por RT-qPCR. La irradiación de la línea celular normal de mama MCF10A no dio lugar a un aumento de los niveles de NY-ESO-1 o CT7 proteína (Figura 2B). Para estudiar el efecto de γ-radiación en la expresión de superficie de MHC-I en el nivel de proteínas, irradiamos múltiples líneas celulares de cáncer (carcinoma de mama y de osteosarcoma) y células primarias normales de diferentes orígenes, seguido de la detección de citometría de flujo de la superficie de MHC-I , y observó que la irradiación resultó en un incremento dependiente del tiempo de MHC-I superficie expresión en diferentes líneas celulares de cáncer (Figura 2C, 2D), pero no en las células primarias normales (Figura S1B).
(a) inmunofluorescencia de MDA-MB-469 y las células expuestas a una sola dosis de irradiación de 20 Gy y se tiñeron con anticuerpos contra NY-ESO-1 y CT7 en diferentes puntos temporales después de la irradiación 37 SK-MEL-. (B) MDA-MB-469, SK-MEL-37 y MCF 10A líneas celulares se expusieron a una única dosis de 20 Gy y la expresión de NY-ESO-1 y CT7 se analizó por transferencia Western 72 h más tarde. (C) el cáncer de mama y las líneas celulares de osteosarcoma (D) fueron expuestos a la irradiación sola dosis de 20 Gy y la expresión de HLA-ABC y β
2microglobulin se cuantificó en diferentes puntos de tiempo después de la irradiación por citometría de flujo. RAD: indica γ-radiación
reconocimiento de células T La irradiación de células de cáncer de mejora
in vitro
Con el fin de determinar si inducida por la irradiación sobre regulación de. CT-antígenos y los resultados de MHC-I en un mayor reconocimiento por parte específica del antígeno CD8
+ células T, que miden la degranulación [23] - [24] de NY-ESO-1
157-165 /HLA-A2- + células T CD8 específicas clonado
tras la incubación con irradiado y no irradiado HLA-A2
+ MDA-MB-469 células de cáncer de mama. MDA-MB-469 células son negativas para NY-ESO-1, pero se vuelven positivos tras la irradiación (Figura 1A, 2A, 2B). Se encontró que sólo irradia células MDA-MB-469 inducidos degranulación de los dos independientes NY-ESO-1
157-165-específica CD8
clones de células T + (2A7, 2B5) (Figura 3). La irradiación no aumentó aún más la desgranulación cuando se utilizaron células MDA-MB-469 cargadas con péptido (datos no mostrados), indicando que no la cantidad de MHC-I pero la cantidad de NY-ESO-1
157-165 presentó por MHC-I era el factor limitante en las células no irradiadas MDA-MB-469, que se ajusta el hecho de que la irradiación induce
de novo
expresión de NY-eSO-1 en las células MDA-MB-469 (Figura 1A, 2).
10
6 marcado con CFSE HLA-A2-469 MDA-MB células de cáncer de mama + se irradiaron o no con una sola dosis de 20 Gy y se incubaron 72 h después con 3 × 10
5 NY-ESO-1
clones de células T CD8 + 157-165 /HLA-A2-específicos (clon 2A7 y 2B5 clon) en el marcado con PE presencia anti-CD107a-PE durante 4 horas a 37 ° C. Las células fueron teñidas con azul marcado con anti-CD8 durante 30 minutos a 4 ° C Pacífico. células MDA-MB-469 cargadas con péptido se utilizaron como control positivo. Se llevaron a cabo todas las culturas por duplicado. La desgranulación se midió como porcentaje CD107a
+ células de CD8
+ células después se active en las células CFSE-negativas mediante citometría de flujo.
Ex vivo
la irradiación de productos frescos biopsias tumorales induce sobre regulación de la CT-antígenos MHC-I y
para ampliar nuestros hallazgos a los materiales clínicamente relevante, se recogieron biopsias tumorales frescas procedentes de 23 pacientes de cáncer diferentes, cortamos los que en al menos 50 trozos pequeños, y ellos al azar en dos grupos experimentales. Irradiamos un grupo de biopsias con 20 Gy, mientras que los otros sirvieron como control, y se analizaron la expresión de CT-antígenos MHC-I y 72 h más tarde por RT-qPCR e inmunohistoquímica. Estos resultados confirman las conclusiones que obtuvimos con líneas celulares de cáncer, que γ-radiación a menudo inducida por aumento de la expresión de CT-antígenos y /o MHC-I (Figura 4A, 4B, Tabla S1). Es importante destacar que, nuestros resultados sugieren que la expresión heterogénea de CT-antígenos y /o MHC-I puede convertirse en más homogénea a la radioterapia, que apoya obviamente control inmunológico del tumor.
explantes tumorales frescas de diferentes pacientes con cáncer (n = 23) fueron irradiados o no con una dosis única de 20 Gy. El diagnóstico de los pacientes individuales se muestra en el cuadro complementario S1. (A) Después de 72 h, se analizaron los explantes irradiados y de control para la expresión de NY-ESO-1 y MHC-I por RT-qPCR. (B) Secciones representativas (número de pacientes 9 y 20) que representan la expresión de NY-ESO-1 y MHC-I mediante técnicas de inmunohistoquímica (magnificación 20X). NR indica no irradiado y RAD indica secciones irradiadas correspondiente.
En vivo
la irradiación de los resultados de sarcoma humanos en una mayor expresión de CT-antígenos y MHC-I y en la infiltración de linfocitos
Finalmente, se comparó la expresión de CT-antígenos MHC-I y la infiltración de linfocitos en 15 secciones de parafina-pareadas obtenidas de pacientes con sarcoma antes y después de la radioterapia mediante técnicas de inmunohistoquímica. Se encontró que la radioterapia resultó en la regulación de hasta sustancial o
de novo
expresión de CT-antígenos y /o moléculas MHC-I, que fue acompañado por un aumento de la infiltración por linfocitos y la expresión de la granzima en 7/15 y 12 /15 muestras, respectivamente (Figura 5A-D, Tabla S2, S3).
parafina embebido en secciones de tejidos emparejados obtenidos a partir de pacientes con sarcoma (n = 15) antes y después de la irradiación se analizaron por inmunohistoquímica para (a) presencia de CD8
+, CD4
+ y granzima
+ células, (B) la expresión de CT7, NY-ESO-1 y CT10 y MHC-I de la expresión (C). El CT-antígenos se anotó como el porcentaje medio de células vivas que expresan el antígeno al número total de células en cinco campos de alta potencia (objetivo 40X). La infiltración de linfocitos fue tomada como la media contando el número de células que expresan CD4, CD8 y granzima en cinco campos de alta potencia, y MHC-I se obtuvo en base a la intensidad de la tinción. (D) Secciones representativas que muestran la expresión de CT-antígenos y MHC-I y la infiltración de linfocitos antes y después de la radioterapia por inmunohistoquímica. Se representan: paciente F para la expresión de CT7, el paciente A para CT10, K paciente para NY-ESO-1, D paciente para CD4 y MHC-I y E paciente para la expresión de CD8. NR indica no irradiado y RAD indica secciones irradiadas correspondiente. Pt: indica el número de paciente. La información del paciente se enumeran en la Tabla S2 complementario.
Otras formas de estrés no tienen impacto en la expresión de CT-antígenos MHC-I o
in vitro
el estrés y alteraciones ambientales inducen cambios en el perfil transcripcional con el fin de hacer frente a estas agresiones [25], [26], [27]. A medida que la irradiación induce daños en el ADN, se investigó si la expresión regulada en marcha de MHC-I y CT-antígenos también se produciría después de la exposición de las líneas celulares a otros tratamientos que inducen daños en el ADN, tales como cisplatino, etopósido y bleomicina, fármaco radio. MDA-MB-469 y las células SK-MEL-37 se trataron por separado con cada uno de los agentes que dañan el ADN y los niveles de ARN fueron controlados a diferentes puntos de tiempo después del tratamiento. Nuestros resultados muestran que ninguno de estos agentes regulada hasta-la expresión de CT-antígenos y MHC-I (Figura S3 B-D). Sin embargo, los genes sello PS15-p53 y FANC-D2 son regulados hasta después del tratamiento, lo que indica que estos agentes inducen estrés a la concentración utilizada (Figura S3 A). Por otra parte, hemos probado si otros tipos de estrés relacionado con el cáncer, incluyendo temperaturas elevadas o niveles bajos de oxígeno, inducida por aumento de la expresión de CT-antígenos y /o MHC-I. Se encontró que ninguno de estos tratamientos impactados en la expresión de antígenos CT-I y MHC-CA9 mientras que el gen firma fue hasta reguladas (Figura S4A, S4B). En conjunto, estos resultados sugieren que el aumento de la expresión de CT-antígenos y MHC-I por las líneas celulares de cáncer es una respuesta específica a radiación gamma y no se produce después de la exposición a otros inductores de las diversas vías de respuesta al estrés.
las vías de señalización ATM y DNA-PK son prescindibles para la expresión inducida por γ-radiación de CT-antígenos y MHC-I
la activación de las vías de punto de control de reparación de daños en el ADN como una respuesta a insulto genotóxico ayuda a mantener la la integridad genómica en células de mamífero [28]. daño del ADN provoca la activación de varias quinasas de serina /treonina proteína, que constituyen los transductores primarios en la cascada de señalización y de los cuales, la ataxia telangiectasia mutada (ATM) y las proteínas quinasas dependientes de ADN (DNA-PKcs) son de suma importancia [29] . La proteína quinasa ATM es un intermediario crítico en un número de respuestas celulares a radiación gamma y otras formas de estrés [30]. por tanto, se investigó si la sobre regulación de CT-antígeno y la expresión de MHC-I en respuesta a la radiación gamma depende de la activación de ATM y /o DNA-PKcs.