Extracto
El receptor de andrógenos (AR) es la diana terapéutica principal en el cáncer de próstata. Durante los últimos 70 años, la terapia de privación de andrógenos (ADT) ha sido el principal enfoque terapéutico. Sin embargo, algunos pacientes no se benefician, y aquellos tumores que responden inicialmente a ADT progresan con el tiempo. Un mecanismo recientemente descrito de tal efecto es el crecimiento y los efectos promotoras de la supervivencia de la AR que se ejercen de forma independiente de la AR ligandos, la testosterona y la dihidrotestosterona. Sin embargo, específicos para ligando independiente de los genes diana de AR que dan cuenta de este efecto no fueron bien caracterizados. Mostramos aquí que
c-Myc, España que es un mediador clave en el crecimiento del cáncer de próstata independiente de ligando, es un gen clave de destino AR ligando-independiente. Utilizando el análisis de microarrays, encontramos que
c-Myc
y los niveles de expresión de AR fuertemente correlacionados entre sí en los tumores de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) progresando a pesar de ADT. Se confirmó que regula directamente AR
c-Myc
la transcripción de una manera independiente de ligando, que
AR
y
c-Myc
supresión reduce el crecimiento de células de cáncer de próstata independiente de ligando , y que la expresión ectópica de c-Myc atenúa los efectos anti-crecimiento de supresión de AR. Es importante destacar que el tratamiento con el inhibidor de JQ1 bromodomain suprime la función de c-Myc y suprimió la supervivencia de células de cáncer de próstata independiente de ligando. . Nuestros resultados definen un nuevo enlace entre dos proteínas críticas en el cáncer de próstata - AR y c-Myc - y demuestran el potencial de AR y terapias para mejorar el control del cáncer de próstata c-Myc-dirigida
Visto: Gao L, Schwartzman J, Gibbs A, Lisac R, R Kleinschmidt, Wilmot B, et al. (2013) del receptor de andrógenos Promueve independiente de ligando del cáncer de próstata progresión a través de c-Myc Regulación al alza. PLoS ONE 8 (5): e63563. doi: 10.1371 /journal.pone.0063563
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Octubre, 2012; Aceptado: April 2, 2013; Publicado: 21 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Gao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta publicación fue posible gracias al apoyo de la clínica y traslacional del Instituto de Investigación de Oregon, el número de concesión KL2 RR024141 del Centro Nacional de Investigación de Recursos y el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación de los Institutos nacionales de Salud (JA). Este trabajo también fue apoyado por el /Instituto del Noroeste del Pacífico del cáncer de próstata SPORE Nacional del Cáncer (P50CA097186) (JA, PN, IC), el Departamento de Defensa (PC093509) (PSN), un premio científico clínico asistente de vuelo Instituto de Investigación Médica de Young (JA ), un Wayne D. Kuni & amp; Premio Joan E. Kuni Kuni Fundación Académico (JA), y una Fundación Premio al Investigador Joven del cáncer de próstata (JA). Con especial agradecimiento a Platt eléctrica, Bruce Burns, y el fondo de la familia de las quemaduras de la Fundación de la Comunidad de Oregon por su apoyo filantrópico de este trabajo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el cáncer más común en hombres en los Estados Unidos con 241,740 nuevos casos esperados de este año [1]. A pesar de la detección y el tratamiento precoz, el cáncer de próstata comúnmente se repite, y 28.170 hombres se prevé que mueren por cáncer de próstata este año [1]. Casi todas estas muertes por cáncer de próstata metastásico son atribuibles a, cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) que ha progresado a pesar de la terapia de privación de andrógenos (ADT) -. El tratamiento más común para los pacientes con cáncer de próstata avanzado o recurrente
ADT trabaja mediante la reducción de los niveles de la potente AR ligandos de la testosterona y la dihidrotestosterona (DHT) o interferir con la unión de ligandos de andrógenos al receptor de andrógenos de proteínas (AR), el objetivo terapéutico principal en el cáncer de próstata [2]. A pesar de ADT, incluyendo novela y los tratamientos más potentes, todos los cánceres de próstata finalmente progresan [3], [4]. En la progresión, la AR se expresa de forma ubicua [5], [6].
Hay varias explicaciones posibles para mecanismos AR dependiente de la progresión a pesar de la supresión o la interferencia con ligandos de andrógenos. Estos incluyen la síntesis de andrógenos intratumoral, la generación de variantes constitutivamente activas AR de transcripción, la amplificación del gen AR, AR, la activación de mutaciones o la activación de la AR por factores de crecimiento [7] - [16]. También es claro ahora que la proteína AR puede promover la activación de las vías de ligando-independiente AR distintas de las vías canónicas activados por ligando de AR en CRPC [17]. Sin embargo, los genes diana AR aguas abajo críticos de este tipo que dan cuenta de la supervivencia celular AR dependiente, independiente de ligando cáncer de próstata no se han aclarado por completo. El estudio de estos genes y mecanismos mediante los cuales diana AR AR regula su expresión va a mejorar nuestra comprensión de la castración-resistencia y conducir a la identificación de las proteínas dependientes de AR clave cuya actividad puede controlar el crecimiento y la supervivencia de las células CRPC. Tales objetivos y las vías, naturalmente, convertido en alta prioridad para el desarrollo de fármacos.
Para comprender genes que podrían explicar este efecto, nos centramos en
c-Myc
. Esto es debido a que: 1)
c-Myc
sobreexpresión promueve el desarrollo del cáncer de próstata [18]; 2)
c-Myc
es upregulated en el cáncer de próstata andrógeno dependiente de ligando y regulada al alza aún más en CRPC [19], [20]; y 3) los informes anteriores han demostrado que c-Myc, como AR, contribuye al crecimiento de células de cáncer de próstata independiente de ligando [21]. Nuestra revisión de los datos antes de que localizada AR sitios de unión en todo el genoma mediante inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) mostró que la AR se localiza en un elemento potenciador de la
c-Myc
gen [17]. Sin embargo, no estaba claro si
c-Myc
era un gen diana AR directa y si los ligandos de andrógenos eran necesarias para la regulación de AR
c-Myc
expresión.
determina que
c-Myc
regulación al alza en los tumores humanos se correlaciona con CRPC
AR
regulación al alza, y nos confirmó que
c-Myc
es un gen diana AR directa mediante inmunoprecipitación de cromatina (chIP ) ensayos.
c-Myc
supresión consigue los mismos efectos generales como
AR
supresión y
c-Myc
sobreexpresión atenúa los efectos anti-crecimiento de
AR
supresión. Mientras AR promueve
c-Myc
expresión, el tratamiento con andrógenos ligandos no aumentaron
c-Myc
expresión. Por lo tanto, AR promueve la expresión de
c-Myc
en un ligando de manera independiente, y
c-Myc
es un gen diana AR clave.
Finalmente, se trató las células del cáncer de próstata con el JQ1 BET bromodomain inhibidor que suprime la expresión de c-Myc [22], [23]. El tratamiento con JQ1 logra el mismo efecto general como
c-Myc
ARNi y redujo la supervivencia de células de cáncer de próstata en condiciones de andrógenos ligando-agotado.
Nuestros estudios aclaran que
c-Myc
es un andrógeno gen diana AR independiente de ligando clave que contribuye a la supervivencia de células de cáncer de próstata andrógeno independiente de ligando pero AR-dependiente. Nuestros resultados también demuestran el potencial de las terapias AR-dirigido o terapias dirigidas-c-Myc en el cáncer de próstata como adjuntos a ADT.
Resultados
AR y
c-Myc
Concordantemente se expresan en metastásico CRPC
tanto AR y c-Myc son las vías de supervivencia críticos en el cáncer de próstata, y los niveles de expresión de ambos
AR
y
c-Myc ¿Cuáles son comúnmente aumento en los tumores humanos CRPC que progresan a pesar de ADT [24], [25]. Sin embargo, no se sabía si la sobreexpresión de
AR
y
c-Myc
se relacionó con el otro en los tumores humanos CRPC. Por lo tanto, determinamos los niveles de expresión de
AR
y
c-Myc
utilizando microarrays de expresión génica en 140 tumores humanos CRPC frente a 15 muestras normales de la próstata. A continuación, se analizó la asociación de
AR
regulación al alza y
c-Myc
regulación al alza en los tumores humanos CRPC.
AR
niveles de mRNA en muestras CRPC fueron fuertemente asociados con niveles
c-Myc
ARNm (correlación de Pearson = 0,3698, 95% intervalo de confianza: desde 0,2172 hasta 0,5048, de dos colas p-value & lt; 0,0001 ) (Figura 1A). También se calculó el odds ratio para
c-Myc
y
AR
regulación al alza en estas muestras CRPC. Se observó una asociación estadísticamente significativa con
AR
regulación al alza y
c-Myc
regulación positiva (OR = 3,528, 95% intervalo de confianza: 1,347 a 9,240, valor p: 0,0108 por la prueba exacta de Fisher) (Figura 1B).
a) Z-score (a muestras normales de la próstata) de
AR
frente a
c-Myc
la expresión de ARNm en 140 metástasis CRPC humanos. El coeficiente de correlación de Pearson, la regresión lineal, y la prueba F para la pendiente significativamente distinto de cero se realizaron para cada par de genes. B) Relación de prueba y las probabilidades exacta de Fisher en la tabla de contingencia análisis de la co-ocurrencia de tumores con
AR
o
c-Myc
puntuaciones z mayor que 2.
Supresión AR reduce el crecimiento de las células del cáncer de próstata resistente a la castración dependiente de ligando y AR independiente de ligando AR
suprimió la expresión de la
AR
con ARNi en células de cáncer de próstata cultivadas en con carbón vegetal, suero andrógeno ligando-agotado.
AR
RNAi reduce el crecimiento celular tanto de las células LNCaP dependientes de ligando de andrógenos y sus derivados CRPC llamados LNCaP-abl (Figura 2A). Es de destacar que ambas células sólo expresan la AR larga duración transcripción.
AR
supresión de RNAi en la línea celular 22Rv1 CRPC que expresa tanto de larga duración AR y una variante AR transcripción consiguen el mismo efecto (Figura 2A). En todas las líneas celulares, la supresión de AR reduce el crecimiento celular sin inducir apoptosis (datos no presentados), lo que sugiere un defecto en la proliferación. Por lo tanto, a pesar del agotamiento ligando de andrógenos,
AR
supresión reduce aún más el crecimiento de células de cáncer de próstata.
A) LNCaP, abl y 22Rv1 células fueron transfectadas con 50 nM del control no específica (NTC) o
AR
RNAi oligonucleótidos. Las células se cambiaron a suero tratado con carbón vegetal en el día de la transfección. El crecimiento celular se determinó 5 días después de LNCaP y 6 días después de ABL y CRPC 22Rv1 con el método de exclusión con azul de tripano. B) por inmunotransferencia de la expresión del RA. Las bandas más bajas en el inmunoblot AR en 22Rv1 células reflejan la presencia de una variante de AR transcripción [7]. B) LNCaP, ABL y 22Rv1 células fueron transfectadas con 50 nM de NTC o
c-Myc
RNAi oligonucleótidos. Las células se cambiaron a suero tratado con carbón vegetal en el día de la transfección. El crecimiento celular se determinó 5 días más tarde para las células LNCaP y 6 días más tarde para abl y 22Rv1 con el método de exclusión con azul de tripano. Inmunotransferencia de expresión de la proteína c-Myc. C) Las células LNCaP con sobreexpresión estable del vector vacío (EV) o c-Myc se generaron. Estas células fueron transfectadas con 50 nM del control no específica (NTC) o oligonucleótidos AR siRNA. El crecimiento celular se determinó 6 días más tarde con el método de exclusión con azul de tripano. Inmunotransferencia de expresión de la proteína AR y c-Myc. Las bandas más altas en la inmunotransferencia de c-Myc en las células c-Myc-overexpressing representan la ectópica expresado-c-Myc. * Indica p & lt;. 0,05 en comparación con NTC
c-Myc represión recapitula el efecto de la supresión de AR, y c-myc atenúa la actividad anti-tumoral de AR represión
Para determinar si c-Myc también influenciado cáncer de próstata crecimiento celular independiente de ligandos de andrógenos, que suprime
c-Myc
utilizando RNAi. Al igual que
AR
regulación a la baja,
c-Myc
baja regulación suprimió el crecimiento independiente del ligando de LNCaP, abl, y 22Rv1 células (Figura 2B). Además, al mismo tiempo que suprimimos
AR
y
c-Myc Chat con ARNi. Co-supresión de las dos proteínas no redujo el crecimiento celular más de la supresión de cualquiera de
AR
o
c-Myc fotos: por sí mismo (Figura S1).
También demostraron que
c-Myc
sobreexpresión confiere un crecimiento independiente del ligando a las células LNCaP dependientes de ligando propagadas a largo plazo en condiciones de castración, que es concordante con un informe previo (Figura S2) [21]. A continuación, suprimimos
AR
con ARNi en células LNCaP que sobreexpresan vector vacío o
c-Myc
y el crecimiento celular cuantificada.
c-Myc
sobreexpresión era protector frente a los efectos supresores del crecimiento de
AR
RNAi (Figura 2C). Esto demuestra que
c-Myc
contribuye al menos en parte a los efectos de AR sobre la promoción de la supervivencia celular de cáncer de próstata independiente de ligando.
AR pero no andrógenos Promover c-Myc Expresión
el
c-Myc oncogén
es comúnmente regulados positivamente en el cáncer de próstata, y
c-Myc
regulación positiva promueve la supervivencia celular de cáncer de próstata independiente de ligando [21]. Sin embargo, la dependencia de los
c-Myc
expresión de AR no se había establecido. Por consiguiente, se examinaron los datos publicados previamente microarray chip que localiza AR en todo el genoma de las células LNCaP dependientes de ligando de andrógenos y sus derivados Abl CRPC [17]. Se informó de AR para ser unido a un elemento potenciador de la
c-Myc
gen en ambas líneas celulares. Por lo tanto, el próximo chip utilizado para confirmar estos resultados.
En primer lugar, nos hicieron crecer células en suero ligando-agotado tratado con carbón vegetal, andrógenos y se determinó el efecto del tratamiento con el ligando de andrógenos R1881 en ocupación AR y acetilación de histonas, una marca de transcripción activa, en el
c-Myc
elemento potenciador utilizando chip. También medimos los efectos del tratamiento con R1881 en el, activado por ligandos gen bien descrito
KLK3
. AR y altos niveles de acetilación de histonas estaban presentes en la
c-Myc
potenciador incluso cuando las células fueron cultivadas en suero ligando-agotado (Figura 3A). Además, la adición de R1881 a la cultura no mejoró la ocupación AR o la acetilación de histonas a
c-Myc
(Figura 3A). Esto contrasta con el efecto de R1881 en el
KLK3
gen enhancer- una mayor enriquecimiento de la AR y la acetilación de histonas (Figura 3A).
LNCaP, abl, y 22Rv1 células fueron cultivadas en tratado con carbón vegetal suero durante 72 horas y después se trató con 10 nM R1881 (o vehículo de etanol) durante 4 horas. A) Se llevó a cabo la inmunoprecipitación de la cromatina para determinar el enriquecimiento de la AR y la acetilación de la histona H3 (AcH3) en el
c-Myc Opiniones y
KLK3
elementos potenciadores. B) QRT-PCR se realizó para determinar los niveles de ARNm de
KLK3
y
c-Myc
relativa a la actina. C) La inmunotransferencia se realizó para determinar los niveles de proteína de AR, c-Myc, y la actina. * Indica p & lt; 0,05 en comparación con el vehículo
Se determinó siguiente, el efecto del tratamiento con R1881 sobre la expresión de
c-Myc
o
KLK3
.. R1881 tratamiento aumentó
KLK3
expresión (Figura 3B). Sin embargo, el tratamiento con R1881 no aumentó
c-Myc
expresión. La Figura 3B, C).
A continuación, se trató células de cáncer de próstata con MDV3100, un potente, nuevo antagonista de andrógenos [26]. MDV3100 tratamiento suprime la expresión de
KLK3
pero no afectó la expresión de
c-Myc
. (Figura S3). Estos resultados apoyan la noción de que los ligandos de andrógenos no promueven la expresión de
c-Myc
.
Para determinar si el AR fue capaz de regular
c-Myc en un
ligando de manera independiente, se utilizó RNAi para suprimir la expresión de
AR
y medido
c-Myc
expresión. supresión de RNAi mediada de
AR
reduce c-Myc ARNm y proteínas expresión (Figura 4A, B). Realizamos ensayos de chip y confirmamos que
AR
RNAi reducido AR y acetilación de histonas de la
c-Myc
potenciador (Figura 4C). Esto fue más significativo en la línea celular 22Rv1, aunque también se observaron tendencias fuertes en las células LNCaP y Abl. Por lo tanto,
c-Myc
es un gen diana AR directa, y
AR
RNAi suprime
c-Myc expresión
al menos en parte por la disminución gradual de la acetilación de histonas y de AR
c-Myc
potenciador. También overexpressed AR en la línea celular de cáncer de próstata M12 que normalmente no expresan AR. AR sobreexpresión aumentó c-Myc mRNA y expresión de la proteína (Figura S4). Esto apoya la idea de que la AR se activa
c-Myc
expresión de una manera independiente de ligando.
LNCaP, abl y 22Rv1 células fueron transfectadas con 50 nM del control no específica (NTC) u oligonucleótidos AR RNAi. Las células fueron cultivadas en suero tratado con carbón vegetal durante 96 horas. Al final del tratamiento, se recogieron las células para extraer mRNA y proteína. A) QRT-PCR se realizó para determinar los niveles de
c-Myc
relación a
actina
. B) La inmunotransferencia se realizó para determinar los niveles de AR, c-Myc y actina. C) Los tratamientos se llevaron a cabo en paralelo y las células fueron reticulado y se procesaron para chip para determinar AR y la acetilación de la histona H3 enriquecimiento (AcH3) en el
c-Myc
potenciador. * Indica p & lt; 0,05 en comparación con NTC
Supresión AR recapitula el efecto de la supresión de c-Myc
A continuación se determinó si la supresión de
AR
RNAi mediada. recapitula el efecto de la supresión mediada por ARNi de
c-Myc
sobre la expresión del bien descrito
c-Myc
genes diana (Figura 5) [27], [28]. Tanto
c-Myc
ARNi y
AR RNAi
reducción de la expresión de la
c-Myc
gen activado por
E2F1
; por el contrario,
c-Myc
y
AR
ARNi tanto el aumento de la expresión de la
c-Myc
genes reprimidos
CDKN1A gratis (Figura 5). Informes recientes demuestran que los genes mitótico, incluyendo
KIF11
,
AURKB
, y
TPX2
, son los principales objetivos de c-Myc genes [29] - [31].
AR
RNAi recapitula el efecto de c
myc
ARNi y también redujo la expresión de estos genes (Figura 5). Esto demuestra que la supresión AR altera la función de c-Myc y la expresión del bien establecidas genes diana c-Myc.
células LNCaP y abl fueron transfectadas con 50 nM de control no específica (NTC) y, o bien A)
AR
o B)
c-Myc
RNAi oligonucleótidos. Las células se cambiaron a suero tratado con carbón vegetal en el día de la transfección y se recogieron 96 horas más tarde. QRT-PCR se realizó para determinar los niveles de acuerdo con
c-Myc
genes diana en relación con
actina
. * Indica p & lt; 0,05 en comparación con NTC
El BET bromodomain Inhibidor JQ1 Suprime c-Myc y Función Celular Reduce AR ligando-independiente de la supervivencia del cáncer de próstata
Nuestros resultados demuestran que
c-Myc
es un gen diana AR importante, pero que
expresión de c-Myc de búsqueda: 's no es activada por ligandos androgénicos. Actualmente, las terapias para suprimir la expresión AR aún no están disponibles. Sin embargo, trabajos recientes demuestran que un inhibidor de BET bromodomain llamada JQ1 suprime la expresión de c-Myc y la función de c-Myc, porque
c-Myc
es un gen diana bromodomain [22], [23]. Por lo tanto, se trataron las células de cáncer de próstata con JQ1. tratamiento JQ1 reduce ARNm y los niveles de proteína de c-Myc (Figura 6A, B) y supresión de la función de c-Myc, medido por c-Myc expresión del gen diana (Figura 6B). Por último, como
c-Myc
RNAi, el tratamiento JQ1 con concentraciones nanomolares reducción de la supervivencia de células de cáncer de próstata independiente de ligando (Figura 6C).
LNCaP, abl, y 22Rv1 células fueron cultivadas en carbón vegetal despojado de suero y se trataron con vehículo, 50 nM, 250 nM o 500 nM JQ1 cada 24 horas durante 72 horas. A) La inmunotransferencia se realizó para determinar los niveles de proteína de c-Myc. B) QRT-PCR se realizó para determinar el nivel de ARNm de
c-Myc Opiniones y c-Myc apunta a genes
KIF11, CDKN1A, TPX2
, y
AURKB
en relación con
actina
. * Indica p & lt; 0,05 en comparación con vehículo. C) La viabilidad celular se determinó al final del tratamiento con el método de exclusión con azul de tripano. p. & lt; 0,01 para el 250 nM y 500 nM dosis vehículo frente en las tres líneas celulares
Discusión
Se aprecia bien-que la AR es un factor crítico de próstata la supervivencia de células de cáncer y que las cuentas de AR para la progresión a fatal CRPC a pesar del tratamiento con ADT [24]. En muchos casos los andrógenos persisten intracelularmente dentro de los tumores CRPC a pesar de los niveles séricos de castración de andrógenos [24], [32]. Sin embargo, se ha informado de mecanismos independiente de ligando pero AR-dependientes de andrógenos que también promueven la supervivencia de las células CRPC. Estos incluyen la activación de la AR por la IL-6, la amplificación del gen AR y AR transcripción variantes que carecen del ligando de andrógenos dominio de unión a [7] - [9], [15]. Todos estos mecanismos pueden contribuir a la progresión del cáncer de próstata a pesar de ADT ya que ninguno está directamente dirigido por ADT.
Recientemente, se demostró que la proteína de AR promueve la expresión de un programa de gen distinto de su dirigida-ligando de andrógenos canónica objetivos en células CRPC [17]. Un ejemplo es el gen diana AR
UBE2C
que promueve la proliferación del cáncer de próstata independiente de ligando [17]. Cuál de los demás productos de genes inducida por AR es crítico para la supervivencia de células de cáncer de próstata independiente de ligando ha sido poco claro. Nuestro trabajo demuestra que el
c-Myc
oncogén es un gen diana tales AR ligando-independiente.
c-Myc
que comúnmente se upregulated en el cáncer de próstata, y
c-Myc
sobreexpresión transforma las células epiteliales prostáticas normales en modelos de ratones genéticamente modificadas de cáncer de próstata y confiere supervivencia de las células del cáncer de próstata independiente de ligando, pero la dependencia de
c-Myc
expresión en la AR no estaba clara [18], [20], [21], [33]. Mostramos aquí que
AR
y
c-Myc ¿Cuáles son comúnmente aumentada en CRPC, y nos confirmó que
AR
y
c-Myc
regulación al alza fuertemente correlacionados entre sí en una gran serie de tumores de pacientes CRPC metastásicos (Figura 1).
Nos confirmó que
AR
supresión conduce a la pérdida de la expresión de c-Myc en líneas celulares de cáncer de próstata que expresan completa -length AR (LNCaP y ABL) y en otro 22Rv1 línea celular que expresa CRPC tanto de larga duración AR y una variante AR transcripción. Aunque no podemos excluir un papel para la variante AR transcripción in también la promoción de
c-Myc
expresión, nuestros resultados con AR RNAi en LNCaP y Abl y nuestros resultados con sobreexpresión AR en las células M12 demuestran que de larga duración es AR capaz de activar
c-Myc
expresión (Figura 4, Figura S4).
Al igual que
AR
ARNi,
c-Myc
RNAi reduce el cáncer de próstata la supervivencia celular en condiciones de andrógenos ligando-agotado mientras co-supresión de
AR
y
c-Myc
no era más efectiva que la supresión de cualquiera de proteína por sí sola (Figura 2, Figura S1).
c-Myc
sobreexpresión confiere la supervivencia independiente del ligando a las células de cáncer de próstata (figura S2), que coincide con un informe previo [21]. También demostramos que
c-Myc
sobreexpresión atenúa la actividad antitumoral de
AR
supresión de RNAi (Figura 2C). Por lo tanto, c-Myc contribuye a los efectos de la AR sobre la promoción de la supervivencia celular de cáncer de próstata independiente de ligando.
A pesar del hecho de que AR promueve la expresión de
c-Myc
, el tratamiento con ligando de andrógenos no aumentaron
c-Myc
expresión (Figura 3). Además, el tratamiento con ligandos de andrógenos no mejoró la ocupación AR en el
c-Myc
potenciador (Figura 3). Esto contrasta con los efectos de la estimulación androgénica sobre la expresión de la
KLK3
gen, un gen activado por andrógenos bien descrito, y la ocupación de AR en el
KLK3
potenciador (Figura 3). Para confirmar aún más que la AR promueve la expresión de
c-Myc
en un ligando de manera independiente, se trataron las células del cáncer de próstata con el nuevo antagonista potente andrógeno MDV3100 [26]. El tratamiento con MDV3100 en un reciente ensayo aleatorizado, controlado con placebo de fase III clínica mejoró la supervivencia global de los pacientes con CRPC [34]. Sin embargo, en algunos pacientes no hay respuesta del tumor, y en la progresión de la AR se mantiene en el núcleo [3], [6], [34]. Mientras que el tratamiento reduce el MDV3100 expresión de
KLK3
, el tratamiento MDV3100 tuvo ningún efecto sobre
c-Myc
expresión (Figura S3). Estos datos apoyan la noción de que AR promueve
c-Myc
expresión en un ligando de manera independiente.
c-Myc
es un factor crítico en la progresión del cáncer de próstata independiente de ligando (Figura 2, Figura S2) [21]. Por lo tanto, en el futuro, será importante medir
c-Myc
expresión y función en los tumores de pacientes CRPC progresando a pesar de la interferencia de andrógenos más completa con fármacos como MDV3100.
Debido a la importancia de
c-Myc
como factor que contribuye a los efectos aguas abajo de AR sobre la supervivencia de células de cáncer de próstata independiente de ligando, se trataron las células de cáncer de próstata con el inhibidor de JQ1 BET bromodomain, un fármaco conocido para suprimir la expresión de genes diana bromodomain; La más importante de los cuales fue
c-Myc
[22], [23]. En estudios previos, el tratamiento JQ1 in vitro e in vivo suprime la expresión y función de c-Myc y suprimió el crecimiento del tumor sin toxicidad apreciable [22], [23].
Se confirmó que el tratamiento JQ1 de células de cáncer de próstata utilizando nanomolar las concentraciones alcanzadas los mismos efectos generales como la supresión mediada por ARNi de
c-Myc
- c-Myc mRNA y el agotamiento de la proteína, la supresión de la función de c-Myc, y la supresión de la supervivencia de células de cáncer de próstata independiente de ligando (Figura 6 ). A la luz de la implicación de los
c-Myc Hoteles en procesos fisiológicos críticos, apuntando a la proteína c-Myc en general en múltiples tipos de células a través de la administración a largo plazo podría ser indeseable [35], [36]. Los ensayos clínicos serán necesarios para determinar la seguridad de la inhibición bromodomain. Sin embargo, los resultados hasta la fecha, incluyendo el nuestro, sugieren que esta es una estrategia antitumoral prometedora para el tratamiento de la CRPC (Figura 6) [22], [23].
Por último, que los controles AR expresión de sus genes diana tales como
c-Myc
de una manera específica de tejido sugiere que el agente ideal para la supresión de
c-Myc
expresión en células de cáncer de próstata específicamente apuntaría AR, en sí. De hecho, nuestros estudios aclaran que andrógeno independiente de ligando pero AR dependiente
c-Myc
upregulation gen es un mecanismo por el que la proteína de AR promueve la supervivencia independiente de ligando de las células de cáncer de próstata. Nuestros estudios apoyan la dignidad de los esfuerzos para suprimir la función independiente de ligando de AR y la expresión de importantes genes diana de AR ligando-independiente como
c-Myc gratis (Figura 7). Los fármacos capaces de suprimir la expresión del RA sólo ahora están empezando a entrar en la prueba. Estos medicamentos incluyen microorganismos degradadores AR selectivos y oligonucleótidos antisentido AR [37] - [40]. Estamos a la espera de los resultados de estos estudios clínicos para determinar la seguridad, la especificidad y eficacia de estos agentes en los hombres con cáncer de próstata avanzado.
Actualmente, la privación de andrógenos terapias que interfieren con la activación de ligando de andrógenos de la AR se utilizan principalmente para el tratamiento de esta enfermedad. Estas terapias suprimir la función dependiente de ligando de andrógenos de AR y suprimir la expresión de genes diana (AD) AR ligando-dependiente de andrógenos. Sin embargo, a pesar de estos tratamientos de la progresión del cáncer de próstata es inevitable. La AR también promueve la expresión de las vías ligando independiente de andrógenos tales como
c-Myc
. La
c-Myc
gen es upregulated comúnmente en el cáncer de próstata y contribuye a la progresión del cáncer de próstata andrógeno independiente de ligando. Este modelo sugiere que las terapias AR o c-Myc-dirigidos complementarían las estrategias actuales de privación de andrógenos.
Métodos
Cell Cultura y
LNCaP y 22Rv1 células fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron en suero bovino fetal tratado con carbón vegetal al 10% para todos los experimentos. Abl, un derivado del CRPC LNCaP, fueron una especie de regalo de Zoran Culig, PhD y se cultivaron en medio RPMI con suero bovino fetal despojado de carbón vegetal 10%. las células del cáncer de próstata que expresan el vector vacío M12 o AR fueron una especie de regalo de Stephen R. Plymate, PhD, y se cultivaron como se ha descrito anteriormente [9].
Para los experimentos de ARNi, LNCaP y células abl fueron transfectadas con oligonucleótidos RNAi (
AR
: 5'-GACCUACCGAGGAGCUUUCUU-3 ', y
c-Myc
: 5'-GAGCUAAAACGGAGCUUUUdTdT-3') mediante el uso de DharmaFECT 3 Dharmacon reactivo de transfección () para una concentración final de 50 nM [41]. 22Rv1 células fueron transfectadas con siRNA oligonucleótidos usando Lipofectamine2000 (Life Technologies) reactivo de transfección para una concentración final de 50 nM. Las células se recogieron en los puntos de tiempo indicados después de la transfección.
R1881 (Sigma) se resuspendió en 100% de etanol. MDV3100 fue comprado (Selleckchem) y se resuspendieron en DMSO. JQ1 se adquirió de Sigma y se resuspendió en DMSO. El crecimiento celular se determinó al final del tratamiento con el método de exclusión de azul de tripano (Life Technologies) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Todos los experimentos de cultivo celular se realizaron con muestras por triplicado biológicos y confirmados en experimentos repetidos.
células LNCaP con sobreexpresión estable de c-Myc o vector vacío se generaron mediante transfección de células LNCaP con pcDNA-DEST40-
c- myc gratis (proporcionado amablemente por Rosalie Sears, PhD) o pCMV6-AN-Su (Origene) y la selección con G418.
colonias de formación de Ensayo
200.000 células LNCaP con sobreexpresión estable de vector vacío (EV) o
c-Myc
se sembraron en placas de 10 cm. RPMI con 10% de suero bovino fetal tratado con carbón vegetal complementado con 300 ug /ml G418 y 10 ug /tratamiento bicalutamida ml se añadió a las células cada dos días durante 14 días. A continuación, las células se fijaron con 4% de formaldehído y se tiñeron con syto60 (Invitrogen). Las imágenes fueron tomadas con el sistema de imágenes Odyssey Licor.
inmunotransferencia
Se llevaron a cabo experimentos de inmunotransferencia como se describe anteriormente [42]. Las imágenes finales se obtuvieron con sistema de imagen Licor Odyssey. Los anticuerpos primarios utilizados fueron: AR (N-20, Santa Cruz); actina (Sigma) y c-Myc (Epitomics). Los anticuerpos secundarios fueron adquiridos de Licor.
QRT-PCR
Se extrajo ARN de los sedimentos celulares almacenados en reactivo RNAlater (Life Technologies) utilizando un kit de RNA total MagMAX aislamiento (Life Technologies) o Trizol ( Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN se determinó usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop). 250 ng-1 RNA ug (normalizado para cada experimento) fue inverso-transcrito utilizando un cDNA de transcripción inversa kit de alta capacidad (Life Technologies) con cebadores aleatorios. En tiempo real (QRT) -PCR se realizó utilizando un termociclador rápido 7500 (Life Technologies) con el siguiente programa de ciclos: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 95 ° C para la disociación 15 seg, 60 ° C durante 1 min recocido /extensión /leer. reacciones RT-PCR 10 l singleplex contenían 1X Taqman mezcla maestra estándar universal, sonda de hidrólisis 1X Taqman, y la plantilla de ADNc de ARN equivalente 10 ng. Se utilizó beta-actina humana (# 4326315E) como control endógeno. Primer información se incluye en la Tabla S1.