Extracto
Objetivo
tetramérico α
2- macroglobulina (α
2 M), un inhibidor de panproteinase plasma, se activa tras la interacción con una proteinasa, y experimenta un cambio conformacional importante la exposición de un sitio de reconocimiento de receptor en cada una de sus subunidades. α activados
2 M (α
2 M *) se une a la superficie de las células cancerosas GRP78 y desencadena la señalización proliferativa y antiapoptóticos. Hemos estudiado el papel de α
2 M * en la regulación de mTORC1 y TORC2 señalización en el crecimiento de las células de cáncer de próstata humano.
Métodos
El empleo de técnicas de inmunoprecipitación y Western Blot, así como ensayos de quinasa, la activación de la mTORC1 y complejos mTORC2, así como los objetivos de aguas abajo fueron estudiados. RNAi se empleó también para silenciar la expresión de Raptor, Rictor, o GRP78 en estudios paralelos.
Resultados
La estimulación de las células con α
2 M * promueve la fosforilación de mTOR, TSC2, S6- quinasa, 4EBP, Akt
T308, y Akt
S473 de una manera concentración y dependiente del tiempo. Rheb, Raptor, y Rictor también aumentaron. α
2 M * el tratamiento de células elevados de actividad de la quinasa mTORC1 según lo determinado por ensayos de quinasa de mTOR o Raptor inmunoprecipitados. actividad mTORC1 era sensible a LY294002 y rapamicina o transfección de las células con GRP78 dsRNA. La regulación por disminución de la expresión Raptor por RNAi reducido significativamente α
2 M * inducida por la fosforilación de la quinasa S6-T389 y en la actividad quinasa en inmunoprecipitados Raptor. α
2 M * células tratadas demostrar sobre un incremento de dos veces en la actividad quinasa mTORC2 como se determina mediante el ensayo de quinasa de Akt
fosforilación y los niveles de p-Akt
S473 en mTOR y Rictor inmunoprecipitados S473. actividad mTORC2 era sensible a LY294002 y transfección de células con GRP78 dsRNA, pero insensible a la rapamicina. La regulación por disminución de la expresión Rictor por RNAi reduce significativamente α
2 M * fosforilación de Akt inducida
fosforilación S473 en inmunoprecipitados Rictor.
Conclusión
La unión de α
2 M * a próstata GRP78 superficie de células de cáncer regula positivamente la activación mTORC1 y mTORC2 y promueve la síntesis de proteínas en las células de cáncer de próstata
Visto:. Misra Reino Unido, Pizzo SV (2012) receptor-Reconocido α
2-macroglobulina se une a la célula asociada a la superficie GRP78 y activa mTORC1 y mTORC2 señalización en las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (12): e51735. doi: 10.1371 /journal.pone.0051735
Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 19 Junio, 2012; Aceptado: 5 Noviembre 2012; Publicado: 14 Diciembre, 2012
Derechos de Autor © 2012 Misra, Pizzo. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La capacidad de las células cancerosas para prosperar
in vivo
depende de muchos factores entre los que son el repertorio de proteínas que modulan su entorno. Mientras que el hígado produce grandes cantidades del inhibidor de proteinasa α
2-macroglobulina (α
2 M) que es producida por las células de cáncer y está vinculada con el crecimiento del tumor [1]. α
2M también se produce localmente en el tejido del estroma tumoral como el asociado con el cáncer de próstata [2]. Es un inhibidor de pan-proteinasa que reacciona con metaloproteinasas de la matriz derivadas del tumor y antígeno específico de próstata (PSA). Mientras PSA está más estrechamente identificado con el cáncer de próstata, sino que también es producido por otros tumores como el de mama [3]. Cuando proteinasas atacan la "región cebo" en cada uno de los cuatro α
subunidades 2M, ésteres de tiol se rompen y la proteína se somete a un gran cambio conformacional exponiendo sitios de reconocimiento de los receptores en cada subunidad [4]. Además de la exposición de proteinasas, α
2 M a pequeñas aminas primarias o amoniaco, por ataque directo a los ésteres de tiol, también induce un gran cambio conformacional exponiendo estos sitios de reconocimiento del receptor [4]. Estas formas activadas se designan α
2 M *. Aunque GRP78 (proteína glucosa regulada de D. ~78000) es conocido principalmente como un chaperón retículo endoplásmico residente, como aparece en la superficie celular de muchos tipos de células malignas [5] - [10]. La unión de α
2 M * a un tumor GRP78 de la superficie celular provoca su autofosforilación [11], [12] activación aguas abajo pro-proliferativa y anti-apoptótica cascadas incluyendo RAS /MAPK y la señalización PI 3-kinase /Akt [5] - [10]. Se ha, por lo tanto, se ha sugerido que la regulación positiva de GRP78 superficie de la célula es parte del fenotipo agresivo en diversos cánceres incluyendo el de próstata y melanoma [8]. Consistente con esta hipótesis, los autoanticuerpos contra el NH
dominio 2-terminal de GPR78 aparecen en el suero de cáncer de próstata y pacientes con melanoma en los que son un marcador biológico de la conducta agresiva [13], [14]. Estos anticuerpos son agonistas que se unen a la misma región de GRP78 donde α
2 M * se une [15]. En contraste, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el dominio carboxilo-terminal de GRP78 son antagonistas de α
2 M * y anti-GRP78-NH anticuerpos
2-terminal de dominio en el cultivo de células y ratones [10], [12], [16] - [20]. Sobre la base de estas y otras observaciones, que postula que el α activados
2M funciones como un factor de crecimiento celular y GRP78 asociada a la superficie como un factor de crecimiento-like receptor [5] - [10].
Panel A . α
2 M * la síntesis de proteínas dependiente de la concentración. Panel B. Modulación de la α
2 M * la síntesis de proteínas en las células inducida por 1-LN. Las barras son: (1) tampón; (2) α
2 M * (50 pM); (3) wortmannin 30 nM /20 min y después α
2 M * (50 pM); (4) LY294002 (20 M /20 min), entonces α
2 M *; (5) La rapamicina (100 nm /20 min), entonces α
2 M *; (6) La actinomicina D (5 mg /ml /15 min), entonces α
2 M *. Los valores en el panel A y B son la media ± SE de cuatro experimentos independientes. Valores significativamente diferentes al nivel del 5% para α
2M * tratados con células marcadas con un asterisco (*).
Akt es una quinasa Ser /Thr expresado como isoformas, Akt1, Akt2, y Akt3, codificada por tres genes diferentes [21]. Estas isoformas son casi idénticos en secuencia de aminoácidos; sin embargo, su expresión relativa difiere en varios tejidos de mamífero [21]. Akt es el principal efector aguas abajo en la vía PI 3-quinasa y se regula la supervivencia celular, proliferación y metabolismo. PI 3-quinasa fosforila PIP2 para generar PIP3 que se une a Akt promoviendo así su translocación a la membrana plasmática donde se fosforilada en Thr308 en el dominio catalítico de PDK1 y Ser473 en el dominio hidrófobo motivo por mTORC2 [21] - [24]. Se requiere la fosforilación en estas dos posiciones para la activación completa de Akt1. Akt1 también es fosforilada co-translocationally en Thr450 en el motivo "giro" por mTORC2 [25] - [27]. La fosforilación de Akt a su vez motivo es esencial para la nueva síntesis Akt asumir su plegamiento y estabilidad adecuada. Las mutaciones de RAS que activan Akt, ocurren en ~ 30% de los tumores epiteliales y la amplificación del gen Akt también se produce en un subconjunto de cánceres humanos. Además, la ablación parcial de Akt es suficiente para inhibir el desarrollo de tumores en ratones PTEN +/- [28], [29]. En las muestras clínicas de cáncer de próstata la sobreexpresión y la activación de Akt1 se asocia con niveles elevados de PSA preoperatorios, mayores grados de Gleason, y menor tiempo de recaída de la enfermedad [29] - [32]. Los estudios inmunohistoquímicos muestran una tinción muy mejorada de p-Akt
S473 en el cáncer de próstata pobremente diferenciado [29], [32].
En el panel A se muestra el efecto del tiempo de incubación de las células con α
2 M * (50 pm) y el panel B se muestra el efecto de diferentes concentraciones de α
2 M * durante 25 minutos sobre la expresión de: p-mTOR
T2481 (O); Raptor (▵); Rictor (▴); GβL (□); p-TSC (•); y Rheb (▪) tal como se determina por transferencia de Western. A inmunoblot representativo de tres a cinco experimentos se muestra para cada proteína en el Panel A y Panel B. La expresión de estas proteínas se muestra en unidades de fluorescencia arbitrarias y se expresa como la media ± SE de tres a cinco experimentos independientes. controles de proteínas de carga, ya sea o no fosforilados proteínas diana actina, se realizaron tanto para el Grupo A y Grupo B se muestran a continuación los respectivos inmunotransferencias.
diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR), un conservadas evolutivamente Ser /Thr quinasa, es un regulador clave de la fosforilación de Akt (ver revisiones [33] - [37], y las referencias en él). Existe un creciente interés en la orientación de mTOR en el tratamiento de cánceres como el de próstata [28], [33], [34], [36], [37]. Este objetivo puede ser complicado por el hecho de que la mTOR está presente en dos complejos de proteínas distintas física y funcionalmente designados como mTORC1 y mTORC2, respectivamente (ver comentarios 33-37, y las referencias en él). Estos dos complejos difieren en su regulación, objetivos de abajo, y la sensibilidad a la rapamicina inhibidor. mTORC1 es un homodímero que contiene mTOR Raptor, y GβL; que es sensible a la rapamicina. mTORC1 activado promueve el crecimiento celular en parte mediante la fosforilación directamente los reguladores traduccionales S6-quinasa y eIF4E proteína (4EBP) (35) de unión. fosforilación de Akt inducida de PRAS40 y DEPTOR provoca su disociación de Raptor y promueve el reclutamiento de sus sustratos aguas abajo S6-Kinase1 y 2, 4EBP1, y 4EBP2 (ver revisiones [33] - [37] y las referencias en él). La unión de GTP a Rheb • resultados mTORC1 en la activación mTORC1, mientras que la unión a Rheb • PIB en su inhibición. La fosforilación de Akt1 por TSC2 inhibe su actividad GTPasa lo que aumenta la carga de GTP en Rheb y el consiguiente aumento de la actividad mTORC1 (ver revisiones [33] - [37] y las referencias en él). S6-quinasa regula mTORC1 a través de una vía de señalización de realimentación negativa que fosforila e inhibe IRS PI 3-quinasa y la activación de Akt. El complejo mTORC2, además de mTOR, contiene Rictor, GβL, DEPTOR, Protor, y mSIN1 y es insensible a la inhibición aguda rapamicina (véase [33] - [37] y las referencias en él). Sin embargo, la exposición prolongada a mTORC2 rapamicina inhibe mTORC2 en algunos tipos de células [24], [33] - [35]. Protor se une fuertemente a Rictor, pero no se requiere para la actividad mTORC2 [33] - [35]. Tanto mTORC1 y mTORC2 son activadas por factores de crecimiento como la insulina y la insulina como factor de crecimiento [33] - [35]. Sin embargo, los mecanismos por los cuales los factores de crecimiento activan mTORC2 no se entienden claramente [33] - [37]. mTORC2 asociados con ribosomas y esto puede servir como un mecanismo de regulación aguas arriba [38], [39]. estimulación de la insulina de las células normales y cancerosas promueve mTORC2 unión a ribosomas y PI de señalización 3-quinasa [38], [39]. GβL une mTORC1 y mTORC2 cerca del dominio de quinasa y se requiere para la integridad mTORC2. DEPTOR también se une tanto a mTORC1 y mTORC2 cerca del dominio quinasa y negativamente regula tanto la actividad mTORC2 [33] mTORC1 y -. [37]
En nuestros estudios anteriores se demostró que α
2 M * -NH
2 la unión a GRP78 asociada a la superficie celular en células de cáncer de próstata desencadena la proliferación y señalización anti-apoptóticas. El pretratamiento de las células con los inhibidores de estas vías de señalización, el tratamiento previo con anticuerpos contra el dominio carboxi-terminal de GRP78, o la transfección de células con dsGRP78 ARN, profundamente inhibe estas vías de señalización [10], [12], [16] - [20] . La estimulación de las células del cáncer de próstata con α
2 M * también induce la síntesis de GRP78 que en parte está mediada por el factor de transcripción TFII-I ya que la transfección de células con dsTFII ARN-I suprime significativamente GRP78 regulación positiva [40]. Este tratamiento también inhibe la translocación de la superficie celular de TFII-I, promovido la entrada de calcio, y la señalización de apoptosis [40]. La estimulación de las células de cáncer de próstata con α
2 M * también causa la regulación positiva de la transcripción y de la traducción de la síntesis de PSA [10], que es secretada y complejos con α
2M. El tratamiento de células con α
complejo 2M-PSA promueve la síntesis de ADN y de proteínas y regula al alza RAS /MAPK y PI 3 quinasa /Akt vías similares a los observados en α de señalización
2M-NH
2 células estimuladas [10 ]. Al igual que α
2 M-NH
2, α
2 M-PSA, provoca un aumento de la expresión de p-S6-quinasa, p-Akt
T308 y p-Akt
S473, el efector componentes de mTORC1 activado y mTORC2 [10] de señalización. En vista del papel crucial de la mTOR señalización en el crecimiento tumoral y la metástasis, y nuestras observaciones sobre α
2 M * inducida por el crecimiento de células de cáncer de próstata, la proliferación celular y la regulación positiva de la PI 3-kinase /Akt señalización [6], [7 ], [9], [10], [12], [16], [17], [18], hemos evaluado el papel de mTORC1 y mTORC2 vías de señalización en las células del cáncer de próstata estimuladas con α
2 M *. Para evaluar la especificidad de GRP78 superficie celular en α
2 M * inducida por eventos de señalización, que han silenciado la expresión de GRP78 por RNAi así como pretratamiento de las células con anticuerpos contra el dominio carboxilo-terminal de GRP78. Para determinar la especificidad de mTORC1 en la activación de su sustrato aguas abajo S6-quinasa y de mTORC2 en la fosforilación de Akt
S473, hemos empleado el tratamiento Raptor y Rictor RNAi, respectivamente. Aquí mostramos que α
2 M * activa mTORC1 quinasa como se determina por S6-quinasa y la fosforilación 4EBP1 y mTORC2 quinasa como se determina por Akt
S473 fosforilación. Silenciamiento de la expresión de genes GRP78 por RNAi o el tratamiento con anticuerpos GRP78 α enormemente suprimidos
2 M * activación inducida de mTORC1 y mTORC2 en estas células. Estos estudios demuestran además la función de la circulación α
2 M, un inhibidor de proteinasa pan, como un factor de crecimiento y de la chaperona GRP78 como un receptor del factor de crecimiento importante para el crecimiento celular en entornos fisiopatológicos.
A inmunoblot representativo de p-S6-quinasa (O) y p-4EBP1 (•) de tres a cinco experimentos se muestra para cada proteína en los paneles a y B. p-S6-quinasa (O) y p-4EBP1 (•) se expresan en unidades de fluorescencia arbitrarias como las medias ± SE de tres a cuatro experimentos independientes. El control de la carga de proteínas para el Grupo A y Grupo B se muestran a continuación los respectivos inmunotransferencias.
Materiales y Métodos
Materiales
Los medios de cultivo se adquirieron de Invitrogen. α-receptores de reconocido
2 M * fue producido por reacción de α
2 M con metilamina como se describe anteriormente [9). Los anticuerpos contra mTOR, p-mTOR
S2481, GβL, p-TSC2
T1462, Rheb, S6-quinasa, p-S6-quinasa
T235 /236, p-S6-quinasa
T389, p-S6-quinasa
T229, 4EBP1, p-4EBP1
T37 /46, Akt1, p-Akt
T308, p-Akt
S473 fueron adquiridos de Señalización celular Tecnología (Danvers, MA) . Los anticuerpos contra el Raptor, Rictor, Protor eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). El anticuerpo anti-mSIN1 era de Bethyl Laboratories, Inc (Montgomery, TX). El anticuerpo anti-actina fue de Sigma (St. Louis, MO). PHAS-1 (4EBP1) era de Stratgene. GST-quinasa S6-constructo se expresó y purificó de acuerdo con el protocolo proporcionado por el profesor Blenis (Universidad de Harvard Medical School). Los anticuerpos contra el dominio carboxilo-terminal de GRP78 eran de Aventa biofarmacéutica Corp (San Diego, CA). [
3H] leucina (actividad específica 115,4 Ci /mmol) y [
33P] -γ-ATP (actividad específica 3000Ci /mmol) eran de Perkin-Elmer Life Sciences. La rapamicina y LY294002 eran de Biomol (Plymouth, PA). Todos los demás materiales eran de calidad analítica y se adquirieron localmente.
•) como se determina por transferencia de Western. Un inmunoblot representativo de p-Akt
T308 y p-Akt
S473 de tres a cuatro experimentos se muestra debajo del gráfico. La expresión de estas proteínas se muestra en unidades de fluorescencia arbitrarias y se expresa como la media ± SE de tres a cuatro experimentos. Los controles de carga de proteínas para Grupo A y Grupo B se muestran a continuación los respectivos inmunotransferencias.
líneas celulares de cáncer de próstata
En un informe anterior, se estudiaron dos líneas de cáncer de próstata 1-LN y DU-145, que expresan GRP78 en su superficie celular y la línea de cáncer de próstata PC-3, que expresa poco GRP78 en su superficie celular [10], [12]. La línea celular de 1-LN altamente metastásico se deriva de la línea de PC-3 y fue una especie de regalo del Dr. Phillip Walther (Duke University Medical Center, Durham, Carolina del Norte). Las líneas de células DU-145 PC-3 y se obtuvieron de la American Type Culture Collection. La línea celular de 1-LN se derivó de un modelo de tumor en el flanco en el que se implantaron células PC-3 en ratones desnudos. Las células se obtuvieron a partir de una metástasis de los ganglios linfáticos en estos ratones. Debido a que esta línea celular expresa GRP78 en la superficie celular y ninguno o muy poco LRP, hemos utilizado ampliamente esta línea para estudiar el papel de GRP78 de la superficie celular en el crecimiento celular del cáncer. Esta línea celular está disponible para cualquier investigador que desee usarlos. Dependiendo de los experimentos, se cultivaron estas células ya sea en 6, 12, 24 o 48 pocillos hasta la confluencia en medio RPMI que contiene 10% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, 12,5 unidades /ml de penicilina, 6,5 mg /ml de estreptomicina y 10 nM de insulina (RPMI-S) en un humidificado de CO
2 (5%) de la incubadora. Al 90% de confluencia se aspiró el medio. Las monocapas se lavaron con HHBSS enfriado con hielo, un nuevo volumen de medio añadido y las células utilizadas para los experimentos descritos a continuación.
Un inmunoblot representativo de tres a cuatro experimentos de mTOR, Raptor, GβL, mSIN1, y Rictor se muestra presencia Protor en estos respectivos inmunoprecipitados. Las células fueron tratadas con: (1) tampón y (2) 50 pM de α
2 M * durante 25 minutos
Determinación de los efectos de α
2 M * en la síntesis de proteínas. Las células en 1-LN
1-células LN (300 × 10
3 células /pocillo) en placas de 48 pocillos se cultivaron en medio RPMI-S en una atmósfera humidificada de CO
2 (5%) incubadora a 37 ° C. En aproximadamente el 90% de confluencia, el medio se aspiró un volumen de RPMI-S se añadió seguido de la adición de tampón o α
2 M * (50 pM). Se añadió a cada pocillo [
3H] leucina (2 Ci /ml) y las células se incubaron durante la noche. Las reacciones se terminaron mediante la aspiración del medio y las monocapas se lavaron tres veces dos veces con helado de TCA al 5%, seguido de tres lavados con PBS enfriado con hielo. Las células se lisaron en un volumen de 1 NaOH (40 ° C /2 h), se estimó que la proteína y los lisados se contaron en un contador de centelleo líquido. En experimentos en los que la modulación de la α
se estudió la síntesis de proteínas inducida por * 2 M, las células se trataron previamente con el inhibidor de PI-3 quinasa LY294002 (20 M /20 min), la rapamicina inhibidor de mTOR (100 nM /15 min) o actinomicina D (5 mg /ml /20 min), antes de añadir α
2 M * (50 pM /noche). Otros detalles de la cuantificación [
3H] leucina incorporación en las proteínas celulares fueron como se describe [41].
La fosforilación de la quinasa S6-4EBP1 y se determinó por [
33P] ATP-incorporación -γ y autorradiografía (AR) y por inmunotransferencia (IB). Panel A. Un diagrama de barras que muestra α
2 M * la activación inducida por la mTORC1 y su modulación por LY294002 y rapamicina en inmunoprecipitados de mTOR como se determinó mediante autorradiografía. Las barras y los carriles en las autorradiografías son: (1) tampón; (2) α
2 M * (50 pm /25 min); (3) LY294002 (20 M /20 min), entonces α
2 M * (50 pm /25 min); y (4) la rapamicina (100 nM /15 min), entonces α
2 M * (50 pM /25 min). Una autorradiografía representativa (AR) de tres experimentos individuales se muestra debajo del diagrama de barras. La fosforilación de S6-quinasa (▪) y 4EBP1 (□) se expresa en unidades de fluorescencia arbitrarias y es la media ± de tres experimentos independientes. También se muestra a continuación Ar es un inmunoblot representativo (IB) de tres experimentos de p-S6-quinasa y p-4EBP1 obtenido a partir de inmunoprecipitados de mTOR de células tratadas como en el análisis de autorradiografía en el Panel A. Panel B. Un diagrama de barras que muestra el efecto de silenciar GRP78 expresión de RNAi en α
2 M * la activación inducida por la mTORC1 en immunopreciptates mTOR en las células LN-1 según se determinó mediante autorradiografía. Las barras y los carriles en la autorradiografía (AR) son: (1) lipofectamina + tampón; (2) lipfectamine + α
2 M (50 pm /25 min); (3) GRP78 ARN de doble cadena (100 nm /48h), entonces α
2 M * (a PM /25 min); y (4) revueltos ARN de doble cadena (100 nm /48h) que α
2 M * (a PM /25 min). Una autorradiografía representativa de S6 quinasa (▪) y 4EBP1 (□) de tres experimentos se muestra a continuación el diagrama de barras. La fosforilación de S6-quinasa (▪) y 4EBP1 (□) se expresa en unidades arbitrarias de fluorescencia como media ± SE de tres experimentos independientes. También se muestra debajo de la autorradiografía (AR) es un inmunoblot representativo (IB) de p-S6-quinasa y p-4EBP1 obtenida de mTOR inmunoprecipitados de células LN-1 tratadas como en el análisis de autorradiografía en el Panel B. Un representante de inmunotransferencia de tres experimentos mostrando también se muestra la expresión de GRP78 en células transfectadas con dsRNA GRP78. Los carriles en el inmunoblot son: (1) lipofectamina + tampón; (2) lipofectamina + α
2 M * (50 pm /25 min); (3) GRP78 ARN de doble cadena (100 nm /48h) + α
2 M *; y (4) revueltos dsRNAi (100 nm /48h) + α
2 M *. Panel C. Un diagrama de barras que muestra el efecto de la expresión GRP78 silenciar por RNAi en α
2 M * fosforilación inducida de S6-quinasa (▪) y 4EBP1 (□) en los inmunoprecipitados de células Raptor 1-LN como se determinó por autorradiografía. Las barras y los carriles en la autorradiografía (AR) son idénticos al diagrama de barras y autorradiografía en el Panel B. Una autorradiografía representativa (AR) de S6 quinasa y 4EBP1 de tres experimentos se muestra a continuación el diagrama de barras. La fosforilación de la quinasa S6-(▪) y 4EBP1 (□) se expresa en unidades arbitrarias de fluorescencia como la media ± DE de tres experimentos. También se muestra debajo de la autorradiografía (AR) es un inmunoblot representativo (IB) de tres experimentos de p-S6-quinasa y p-4EBP1 obtenido a partir de inmunoprecipitados de células Raptor 1-LN tratados como en el análisis de autorradiografía en el panel C. Panel D. autorradiografía que muestra α
2 M * fosforilación inducida por la quinasa S6-y 4EBP1 en DU-145 células de cáncer de próstata, pero no en las células PC-3 con cáncer de próstata. Los carriles en la autorradiografía son: (1) tampón; (2) α
2 M *. Para más detalles véase la sección "Procedimientos Experimentales". La autorradiografía se muestra es representativa de cuatro experimentos. Grupo E. Un diagrama de barras que muestra que los anticuerpos contra el dominio carboxilo-terminal de GRP78 inhibición α
2 M * fosforilación inducida por la quinasa S6-(▪) y 4EBP1 (□) en inmunoprecipitados de células de mTOR 1-LN. Las barras son: (1) tampón; (2) α
2 M * (50 pm /25 min); (3) anticuerpos contra el dominio carboxilo-terminal de GRP78 (3 mg /ml /1 h), entonces α
2 M *. La fosforilación de S6-quinasa y 4EBP1 se determinó por análisis de autorradiografía y se expresa en unidades arbitrarias y es la media ± SE de tres experimentos. Los valores significativamente diferentes al 5% para α
2 M * y revueltos células tratadas con dsRNA se indican con un asterisco (*) en todos los paneles de la A a la E.
Efectos de 1-LN la incubación de células con α
2 M * en la p-mTOR
S2481, p-TSC2
T1462, Rheb, Raptor, Rictor, GβL, p-S6-quinasa, p-4EBP1, p-Akt
T308, y p-Akt
S473
células
1-LN (300 × 10
3 células /pocillo) en medio RPMI-S medio en placas de 6 pocillos se incubaron como anteriormente. Al 90% de confluencia, el medio se aspiró, un volumen de medio RPMI-S a cada pocillo. En un conjunto de experimentos, las células se estimularon con concentraciones variables de α
2 M * y se incubaron durante 30 min. En otra serie de estudios, las células se estimularon con 50 pM de α
2 M * y se incubaron durante diversos tiempos a 37 ° C en un humidificado CO
2 (5%) de la incubadora. Las reacciones se terminaron mediante la aspiración del medio, un volumen de tampón de lisis A que contiene 50 mM Tris • HCl (pH 7,5), NaOH 120 mM, 0,1% de NP40, fluoruro de 25 mM de sodio, pirofosfato de sodio 1 mM, ortovanadato de sodio 0,1 mM, 1 mM PMSF, 1 mM de benzamidina, y leupeptina (10 mg /ml) y se colocan sobre hielo durante 15 min. Los lisados se transfirieron a tubos Eppendorf y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min a 4 ° C para eliminar los restos celulares. Se retiraron los sobrenadantes a tubos nuevos y sus contenidos de proteína determinaron [42]. Para la misma cantidad de proteína, un volumen de 4 x tampón de muestra añadido, tubos hierve durante 5 min y se centrifuga. Las muestras se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida (12,5%, 10% o 4-20% de geles de gradiente según se requiera). Las bandas de proteínas en los geles se transfirieron a membranas de Hybond-P y en las membranas experimentos separados inmunotransferencia con anticuerpos contra p-mTOR
S2481, p-TSC2
T1462, Raptor, Rictor, GβL, Rheb, p-S6-quinasa
S235 /236, p-4EBP1
T37 /46, p-Akt
T308 o p-Akt
S473 durante 16 horas a 4 ° C con rotación. La detección y cuantificación de inmunotransferencias de los respectivos antígenos se realizaron mediante ECF y Tormenta 860 PhosphorImager. Las respectivas membranas se volvieron a sondar para los controles de la carga de proteínas, la proteína diana no fosforilado o actina, en este y en los siguientes estudios. La especificidad de los anticuerpos empleados aquí y en los experimentos descritos a continuación se determinó mediante tratamiento de las células con anticuerpos no inmunes y los lisados celulares transformados como anteriormente. En las condiciones experimentales, no se observó reactividad de estos controles [10], [43], [44].
Panel A. diagrama de barras que muestra los niveles de Raptor en células transfectadas con dsRNA Raptor y estimuladas con α
2 M * o insulina. Las barras son: (1) lipofectamina + tampón; (2) lipofectamina + α
2 M * (50 pm /25 min); (3) lipofectamina + insulina (200 nM /20 min); (4) revueltos dsRNA (100 nM /48 h) + insulina; (5) Raptor ARN de doble cadena (100 nm /48 h); (6) Raptor ARN de doble cadena (100 nm /48 h), entonces α
2 M *; (7) Raptor dsRNA (100 nM /48 h) a continuación, la insulina (200 nM /20 min); (8) rapamicina (100 nM /20 min), entonces la insulina. Los valores son la media ± SE de tres a cuatro experimentos independientes y se expresan como unidades arbitrarias de fluorescencia. Los valores significativamente diferentes al nivel del 5% para α
2 M *, la insulina y la dsRNA revueltos células tratadas se indican con un asterisco (*). Un inmunoblot representativo de Raptor de tres a cuatro experimentos, junto con su carga de proteína actina de control A continuación se muestra el diagrama de barras. Panel B. Un diagrama de barras que muestra la activación mTORC1 en células tratadas con α
2 M * y la insulina y el efecto de la transfección con dsRNA Raptor en su activación tal como se mide mediante el ensayo de fosforilación de S6-quinasa por autorradiografía. Las barras y los carriles en autorradiografía son: (1) lipofectamina + tampón; (2) lipofectamina + α
2 M * (50 pm /25 min); (3) Raptor ARN de doble cadena (100 nm /48 h); (4) Raptor + ARN de doble cadena α
2 M *; (5) lipofectamina + insulina (200 nM /20 min); (6) revueltos dsRNA (100 nM /48 h) + insulina; (7) Raptor dsRNA (100 nM /20 min) a continuación, la insulina; (8) rapamicina (100 nm /20 min), entonces α
2 M *; (9) LY294002 (20 mM /20 min) a continuación, la insulina; (10) rapamicina (100 nM /20 min), entonces la insulina. Una autorradiografía representativos de tres experimentos de fosforilación S6-quinasa A continuación se muestra el diagrama de barras. Los valores son la media ± DE de tres experimentos y se expresan en unidades arbitrarias. Los valores significativamente diferentes a los 5 niveles% de α
2 M *, la insulina y la dsRNA revueltos células tratadas se indican con un asterisco (*). Grupo C. Un diagrama de barras que muestra los niveles de S6 quinasa fosforilada en T389 (▪); T229 (ver cuadro gris) y T 235/236 (□) en las células estimuladas con α
2 M * o insulina y transfectadas con dsRNA Raptor. Las barras son como en inmunotransferencias Grupo A. representativos de p-S6 quinasa-
T389, p-S6 quinasa-
T229 y p-S6 quinasa-
T235 /236 de tres experimentos, junto con su carga de proteínas control se muestra a continuación el diagrama de barras. Los valores son la media ± DE de tres experimentos y se expresan en unidades arbitrarias de fluorescencia. Los valores significativamente diferentes al nivel del 5% para α
2 M *, insulina o revueltos dsRNA se indican con un asterisco (*). Panel D. Un diagrama de barras que muestra los niveles de fosforilación de 4EBP1, en células tratadas con α
2 M * y la insulina o transfectadas con dsRNA Raptor. Las barras son como en el panel A. Un inmunoblot representativo de p-4EBP1 de tres experimentos, junto con su control la carga de proteínas se muestra a continuación el diagrama de barras. Los valores son la media ± DE de tres experimentos y se expresan en unidades arbitrarias de fluorescencia. Los valores significativamente diferentes al nivel del 5% para α
2 M *, insulina y revueltos células tratadas con dsRNA se indican con un asterisco (*).
Caracterización de los componentes de mTORC1 y mTORC2 Complejos en 1-LN células de cáncer de próstata estimuladas con α
2 M *
células 1-LN (3 × 10
6 por pocillo en placas de 6 pocillos) se incubaron durante la noche en medio RPMI-S se lavaron dos veces con -hielo frío HHBSS y un volumen de medio RPMI-S a cada pocillo. Después del equilibrado de la temperatura, de células en los pocillos se expusieron a tampón o α
2 M * (50 pM /25 min) y se incubaron como anteriormente. Las reacciones se detuvieron mediante la aspiración del medio y un volumen de tampón CHAPS lisis (Tampón B) que contiene Hepe 40 mM (pH 7,5), NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, 10 mM de pirofosfato de sodio, 10 mM β-glicerofosfato, ortovanadato de sodio 0,5 mM , se añadieron 0,3% de CHAPS y una tableta de cóctel inhibidor de proteasa de Roche (1 tableta /10 ml) y las células se lisaron sobre hielo durante 15 min. Los lisados se transfirieron a tubos Eppendorf de separar, se centrifugaron (1000 rpm /5 min /4 ° C) y los sobrenadantes utilizados para la estimación de la proteína y la inmunoprecipitación. Se utilizaron cantidades iguales de proteína de lisado (200-250 g) en experimentos separados para la inmunoprecipitación con anticuerpos Raptor (1:50, gato Santa Cruz#sc81537) anticuerpos, o Rictor (1:50, Santa Cruz cat#81538), seguido de la adición de 40 l de proteína a agarosa y contenido incubó con rotación durante la noche a 4 ° C. Raptor y Rictor inmunoprecipitados se recuperaron por micro-centrifugación (2000 rpm /5 min /4 ° C) y se lavaron dos veces con tampón de lisis frío B. Para Raptor y Rictor inmunoprecipitados un volumen de 4 x tampón de muestra se añadió, los tubos hirvieron durante 5 min , se centrifugaron, a electroforesis (4-20%, 12,5% o 10% geles de acrilamida), transferidos a membranas Hybond-P y las membranas inmunotransferencia con anticuerpos específicos para mTOR, Raptor, Rictor, GβL, mSIN1 y Protor. Las bandas de proteínas en las membranas fueron cuantificados como anteriormente [43], [44].
Panel A. Un diagrama de barras que muestra α
2 M * fosforilación de Akt inducida en el T308 (▪) y S473 ( □) en ensayos de quinasa de mTOR inmunoprecipitados. Las barras y los carriles en el inmunoblot son: (1) tampón; (2) α
2 M * (50 pm /25 min); (3) LY294002 (20 M /25 min), entonces α
2 M *; (4) la rapamicina (100 nm /20 min), entonces α
2 M *. Los valores son la media ± DE de cuatro experimentos independientes y se expresan como fmol [
33P] /mg de proteína celular incorporado -γ-ATP. Los valores significativamente diferentes al nivel del 5% para α
2 M * Las células tratadas se indican con un asterisco (*). Panel B. Un diagrama de barras que muestra α
2 M * fosforilación de Akt inducida en el T308 (▪) y S473 (□) en ensayos de quinasa de inmunoprecipitados Rictor. Las barras y los carriles en inmunoblot son: (1) tampón; (2) α
2 M * (50 pm /25 min); (3) LY294002 (20 mM /25 min), entonces α
2 M * y (4) La rapamicina (100 nM /20 min).