Extracto
Antecedentes y objetivos
La pancreatitis crónica y el cáncer de páncreas son caracterizada por fibrosis extensa mediada por células estrelladas, y el desarrollo terapéutico actual incluye la orientación del estroma cáncer y tumor-huésped interacciones pancreáticas. La evidencia reciente ha sugerido que circulan células madre derivadas de la médula ósea (BMDC) contribuyen a órganos sólidos. El objetivo fue definir la función de hacer circular las células hematopoyéticas en el páncreas normal y enfermo.
Métodos
toda la médula ósea fueron cosechadas a partir de ratones donantes β-actina-EGFP macho y hembra se trasplantan en receptores irradiados ratones C57 /BL6. La pancreatitis crónica se indujo con inyecciones repetidas de caerulein, mientras que la carcinogénesis fue inducida con una inyección intrapancreática de dimetilbenzantraceno (DMBA). Fenotipo de las células derivadas del donante injertadas dentro del páncreas se evaluó por inmunohistoquímica, inmunofluorescencia y
In situ
hibridación.
Resultados
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Conclusiones
Este estudio demuestra que BMDC puede incorporar en el páncreas y adoptar el estado diferenciado del compartimiento exocrina. BMDC que contribuyen a la población PASC activado en la pancreatitis crónica y el cáncer de páncreas tienen diferentes fenotipos, y puede jugar un papel importante en estas enfermedades. Además, el trasplante de médula ósea puede proporcionar un modelo útil para el estudio de las interacciones tumor-huésped en el cáncer y pancreatitis
Visto:. Scarlett CJ, Colvin EK, Pinese M, Chang DK, Morey AL, Musgrove EA, et Alabama. (2011) reclutamiento y la activación de las células pancreáticas estrelladas de la médula ósea en el cáncer de páncreas: un modelo de interacción tumor-huésped. PLoS ONE 6 (10): e26088. doi: 10.1371 /journal.pone.0026088
Editor: Hana Algül, Technische Universität München, Alemania |
Recibido: 19 Agosto, 2010; Aceptado: 19 de septiembre de 2011; Publicado: 14 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Scarlett et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto de cáncer de Nueva Gales del Sur (CINSW), el Nacional de Salud y Consejo de Investigación médica (NHMRC) de Australia, el Consejo del cáncer de Nueva Gales del Sur, Fundación Clínica de San Vicente, el Real Colegio australiano de Cirujanos, el cáncer de Australia Fundación para la Investigación y la RT Salón de confianza. AVB, CJS, DKC, EAM y EKC son apoyados por becas de la CINSW. SPI es un compañero Senior Principal de la NHMRC y titular de la Cátedra de Petre Breast Cancer Research. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de páncreas (CP) sigue siendo uno de los cánceres más devastadores, y es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en las sociedades occidentales con una tasa de supervivencia de menos del 5% [1]. Nada aparte de la resección pancreática en una proporción de pacientes (10-20%), ofrece a cualquier potencial curativo, con agentes quimioterapéuticos que satisfacen un éxito limitado [2]. pancreatitis crónica es un factor de riesgo significativo para el desarrollo de cáncer de páncreas y ambos se caracterizan por fibrosis extensa mediada por las células estrelladas, que en el caso de cáncer de páncreas facilita la progresión del cáncer y la metástasis [3], [4]. Recientemente, Olive
et al
[5] demostrado que, por la orientación del estroma usando inhibidores de la señalización hedgehog, mejora significativamente el suministro de agentes quimioterapéuticos al compartimiento epitelial del tumor, y aunque el efecto fue transitorio, mejoró eficacia global. Además, Kraman
et al
demostró que la orientación subpoblaciones específicas de células estromales de destrucción podría eliminar su efecto inhibidor sobre la respuesta inmune del huésped al tumor [6].
Las observaciones realizadas en los últimos años han demostrado que las células madre adultas tienen una notable flexibilidad en sus repertorios de diferenciación. Esta plasticidad permite que las células madre adultas, en particular los de origen de médula ósea, que se injertan alternativa ubicaciones no hematopoyéticas y transdifferentiate en tipos de células apropiadas para su nuevo nicho. Esto es particularmente evidente cuando el órgano destinatario está dañado [7], [8]. las células derivadas de la médula ósea (BMDC) pueden injertarse ya sea o fusible de adoptar o ser reprogramado, al estado diferenciado de los epitelios particular, [9] (revisado en [10]). Esto sugiere que la célula madre endógenas de un órgano, y su papel en el crecimiento y la regeneración, no se limita a cada órgano específico, pero puede ser un sistema dinámico que implica que circula BMDC con el vástago entornos nicho de células que regulan el reclutamiento, proliferación y diferenciación [7], [11]. Esto puede tener implicaciones importantes en relación con la evolución de los tipos de cáncer en muchos órganos sólidos, incluyendo el páncreas. Houghton
et al
demostró que en un modelo de
Helicobacter felis
inducida por la carcinogénesis gástrica, el desarrollo de metaplasia y displasia estaba relacionado con el injerto y la expansión de la población BMDC, el tiempo dando lugar a gástrica adenocarcinoma [12]. Las observaciones en las mujeres que recibieron trasplantes de médula ósea de donantes masculinos, y que posteriormente desarrollaron un cáncer, identificado que miofibroblastos (equivalente de las células estrelladas pancreáticas) dentro de estos tumores se derivaron de donantes de médula ósea [13].
La mayoría de las estudios previos que evaluaron el papel de BMDC en la regeneración y reparación de páncreas se han centrado en la restauración de la función endocrina después de una lesión de células de los islotes [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Pocos estudios se han centrado en la contribución de BMDC para el crecimiento y la regeneración del páncreas exocrino, o su papel en el cáncer de páncreas. Wang
et al
[22] describen la contribución de BMDC a la formación del conducto pancreático en ratones neonatales, Marrache
et al
[23], y Watanabe
et al
[24 ] demostrar en un modelo de caerulein inducida pancreatitis crónica que BMDC contribuyen a la población de células estrelladas de páncreas sugiriendo un papel en la reparación de tejidos, mientras que más recientemente Pan
et al
[25] identificó una contribución de BMDC a la stellate pancreático población de células en un modelo de rata de la carcinogénesis química.
Aquí generamos un modelo robusto de toda trasplante de médula ósea para mostrar que en la carcinogénesis pancreática, y en la pancreatitis crónica, BMDC contribuye significativamente a la de las células estrelladas pancreático activado (PASC ) población. Aquellos asociados con el cáncer pancreático expresan genes característicos de las células estrelladas peritumoral, en comparación con los no asociados a tumores malignos, lo que sugiere que BMDC puede desempeñar un papel importante en el apoyo a la carcinogénesis pancreática. Además, estos modelos de trasplante de médula ósea pueden ser útiles en la investigación de las interacciones tumor-huésped
in vivo
.
Métodos
Declaración de Ética
Todos los animales trabajo fue aprobado por el Instituto Garvan de Investigación médica del Comité /San Vicente hospital de Ética Animal (Protocolo#06/53).
Trasplante de médula ósea
Toda la médula ósea se extrae de macho C57 /BL6 -TgN (ACTbEGFP) IOsb /J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, EE.UU.; en lo sucesivo, la β-actina-EGFP ratón) mediante el lavado de las tibias y fémures con Dulbecco Modificado de Eagle (DMEM; Invitrogen, Eugene, O, EE.UU.) utilizando una aguja 26G. Las células se filtraron a través de un filtro de células de 70 mM, se contaron, después se lavaron y se resuspendieron en PBS. 5 × 10
6 células de médula ósea β-actina-EGFP fueron trasplantadas en irradiados (950 rads; Gammacell 40 Exactor; Nordion International Inc. Canadá) receptor de 4-8 semanas de edad C57 /B6 ratones a través de la vena de la cola. Los ratones recibieron agua antibiótico (40 mg /5 ml trimetoprim + 200 mg /5 ml sulfametoxazol) durante 14 días. Mientras que el uso de la proteína verde fluorescente (GFP) se ha convertido en el marcador de elección para muchos tipos de trasplante de células y experimentos de marcado de linaje, no es claro que el GFP se expresa en células madre de médula ósea continuaría que se expresa en no hematopoyéticas tejidos siguientes reprogramación nuclear [26], [27], [28]. En consecuencia, hemos realizado trasplantes de género no coincidentes para rastrear el destino de las células derivadas del donante utilizando el cromosoma Y marcador genotípico para validar los resultados observados con el reportero GFP.
Normal páncreas
Los ratones fueron sacrificados a las 3 (n = 12), 6 (n = 12), 9 (n = 12) y 12 (n = 11) meses después del trasplante (Figura 1). En cada punto de tiempo, se cosechó el páncreas, reduce a la mitad o colocarlo en un 10% de formalina tamponada neutra y luego se incluyeron en parafina, o incrustado en frío compuesto Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA, EE.UU.) y se congeló en N líquido
2. fenotipo celular de células derivadas de donantes dentro del páncreas se evaluaron por inmunohistoquímica, inmunofluorescencia y
In situ
hibridación para el cromosoma Y. Para supervisar el injerto del donante β-actina-EGFP médula ósea, sangre periférica se evaluó para la positividad de GFP mediante fluorescencia de células activadas (FACS) a 1 mes después del trasplante, a continuación, en el sacrificio (Tabla 1).
5 × 10
6 células de médula ósea de ratones β-actina-EGFP masculinos fueron trasplantadas en femenino letalmente irradiados ratones B6 C57 /. Para la evaluación de los páncreas normal, páncreas fueron cosechadas a los 3, 6, 9 y 12 meses después del trasplante. Para la pancreatitis crónica, los ratones se les administró por vía intraperitoneal caerulein durante 10 semanas, y luego sacrificado tras el cese del tratamiento, así como 3, 6 y 9 meses post-tratamiento para evaluar la regeneración. Para el cáncer de páncreas, en 1 mes ratones post trasplante se administraron una inyección intrapancreática de 7,12-dimetilbenzoantraceno (DMBA) y se sacrificaron por 4, 8, 12 o & gt; 12 meses después del tratamiento con DMBA o cuando se detectó una masa pancreática
la pancreatitis crónica
Un mes después del trasplante, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con 50 mg /kg de ceruleına (# 152860; MP Biomedicals Inc., Solon, OH, EE.UU.) 5 veces más de 4 horas consecutivas, dos veces a la semana durante 10 semanas como se describe anteriormente [29]. Se sacrificaron los ratones tras la finalización del tratamiento caerulein (n = 8) y 3 (n = 8), 6 (n = 8) y 9 (n = 8) meses después de caerulein tratamiento para evaluar la regeneración de páncreas. Un brazo adicional evaluó la regeneración del páncreas en ratones tratados con ceruleına a los 6 meses después del trasplante y se sacrificó a los 3 meses después del cese del tratamiento ceruleına (n = 4) (Figura 1).
Modelo química de cáncer de páncreas
un mes después del trasplante, los ratones fueron anestesiados con isofluorano y se realizó una incisión subcostal lateral izquierdo de la pared abdominal y el bazo exteriorizado para revelar el cuerpo y la cola del páncreas. se disolvió en PBS /0,1% Tween y se inyecta en la cola del páncreas usando una aguja 25G como se describe anteriormente [30; 1 mg /50 l de 7,12-dimetilbenzantraceno (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU. DMBA) ]. El bazo y el páncreas fueron devueltos a la cavidad abdominal y se suturaron el peritoneo capas /músculo y la piel se cerraron. Los ratones fueron sacrificados entre 1-4 (n = 16), 5-8 (n = 6), (n = 4) y & gt 9-12; (n = 2) semanas después del tratamiento DMBA o cuando se detectó una masa pancreática 12 tras la palpación abdominal (Figura 1). Al igual que con el modelo de pancreatitis crónica, un brazo adicional evaluó la contribución de BMDC a la carcinogénesis pancreática después de la inducción con DMBA en tanto 6 (n = 10) y 9 (n = 10) meses después del trasplante.
análisis FACS
se analizaron las células de la sangre y de médula ósea periféricos para la expresión de GFP usando células activadas por fluorescencia (FACS) (Tabla 1).
sangre periférica.
a 1 mes después trasplante y en el sacrificio, se recogió la sangre a través de sangrado de la cola y se recoge en BD Microtainers con litio /heparina (BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.). Después, se añadió 1,000 l FacsLyse (1X) y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los tubos se centrifugaron a 1000 g durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 200 l de PBS frío en hielo hasta su análisis.
médula ósea.
La médula ósea se lavó abundantemente de la fémures de ratones trasplantados con PBS frío utilizando una aguja 26G, se filtró a través de un filtro de células de 70 mM y se mantuvo en hielo hasta su análisis. análisis de clasificación de células (FACS) activadas por fluorescencia se realizó utilizando un BD FACS Canto (BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.).
La inmunohistoquímica /Inmunofluorescencia /hibridación
La inmunohistoquímica in situ.
embebidos en parafina secciones de tejido pancreático (4 micras) se de-encerado y rehidratada antes de H & amp; e tinción para evaluar la morfología histológica. Por inmunohistoquímica, desenmascarar el antígeno se logró utilizando solución de recuperación de destino (s2367, pH 9,0: Dako Corporation, Carpenteria, California, EE.UU.) durante 30 minutos en un baño de agua hirviendo. La actividad peroxidasa endógena se inactivó con peróxido de hidrógeno 3% (5 minutos), se enjuagaron en tampón DAKO (DAKO Corporation) a continuación, los portaobjetos se bloquearon con Protein bloque DAKO (10 minutos; DAKO Corporation). Las secciones se incubaron a continuación durante 60 minutos con el anticuerpo primario (véase más adelante) y luego se utilizó un anti-conejo marcado con sistema de detección de polímero peroxidasa de rábano (30 minutos; DAKO Corporation; Envision + anti-conejo) se utilizó y 3,3'-diaminobencidina como una sustrato. Counter-tinción se realizó con hematoxilina de Mayer (DAKO Corporation).
inmunofluorescencia.
Para el análisis de inmunofluorescencia, 4 micras, de secciones de parafina se de-encerado, rehidratada y el antígeno recuperados como se describe anteriormente. Las secciones se bloquearon a continuación con el bloque de proteínas (10 minutos), a continuación, se incubaron los anticuerpos primarios (véase más adelante) durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó en tampón DAKO (3 x 5 minutos) y se incubaron en anticuerpos secundarios (véase más adelante) durante 1 hora a temperatura ambiente. La tinción fluorescente de las membranas apicales de las células acinares exocrinas se realizó utilizando aglutinina de cacahuete conjugado con rodamina (ANP; 1:200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Los portaobjetos se aclararon a continuación, por contraste y se montaron en Vectashield difícil establecer con DAPI medio de montaje (H-1500; Vector Laboratories)
Los anticuerpos primarios:. GFP policlonal de conejo (A11122; Invitrogen, Eugene, Oregón, EE.UU.; 1: 1000 IHC, 1:200 SI), GFP policlonal de cabra (ab5450; Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.; 1:1000), amilasa policlonal de cabra (C-20; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.; 1 :200 SI), desmina (Thermo Scientific, Fremont, CA, EE.UU.; 1:200 IHC), músculo liso α-actina monoclonal de ratón (clon 1A4; A5228; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.; 1: 1: 500 IHC /SI), vimentina (SP-20; Epitomics, Burlingame, CA, EE.UU.; 1:200 IHC), citoqueratina 5/6 (D-13; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.; 1: 100 IHC), proteína ácida glial fibrilar (GFAP) policlonal de conejo (Z0334; Dako Corporation, Carpenteria, California, EE.UU.; 1:50), células pre-B del factor de transcripción 1 de leucemia (PBX1) policlonal de conejo (ab12001; Abcam, Cambridge , MA, EE.UU.; 1:100), cadherina EGF LAG de siete pasadas receptor de tipo G 3 (CELSR3) policlonal de conejo (ab12958; Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.; 1:100)
Los anticuerpos secundarios:. Cy5 anti-conejo (1:250;#711-176-152; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE.UU.), Cy5 anti-cabra (1:250;#705-175-003; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE.UU.), Cy3 anti-cabra (1:500;#715-166-147; Jackson ImmunoResearch), anti-ratón Cy3 (1:500;#715- 166-150; Jackson ImmunoResearch) guía empresas
Star * FISH,
la hibridación in situ del ratón entero Y sonda de cromosoma marcado con fluoresceína (# 1189-YMF-01;. se aplicó Cambio Ltd). a 3 secciones de parafina um siguientes desparafinación en xileno, pre-tratamiento con solución de DAKO target Retrieval (TRS: 30 minutos a 95 ° C), la digestión de la proteasa a 37 ° C durante 15 minutos y después de la fijación en formalina tamponada neutra durante 10 minutos. sitio de hibridación fue seleccionado por referencia a una sección en serie teñidas con H + E. 3.5 sonda l se aplicó bajo un cubreobjetos mm 15 × 15 sellado con cemento de goma. Co-desnaturalización a 90 ° C fue seguido por la hibridación durante la noche a 37 ° C en un bloque termociclador. Después de la hibridación posterior enjuaga en 2X SSC /0,3% NP-40 (2 x 2 min a 72 ° C), los portaobjetos se secaron y se contratiñeron con DAPI. La señal fue analizada con un microscopio Zeiss Axioscope II con AxioCam digital y software AxioVision.
Resultados
reconstitución con éxito de la médula ósea en ratones trasplantados fue demostrable en la sangre periférica en 1 mes después del trasplante usando análisis FACS para la expresión de GFP. Además, el injerto a largo plazo se verificó en el momento del sacrificio. GFP positividad de sangre periférica y la médula ósea en cada punto de tiempo era comparable a la de la β-actina de donantes-EGFP ratón (Blood, 70,07% ± 3,90 SEM; ósea, 30,87% ± 1,60 SEM). (Tabla 1)
BMDC y el páncreas exocrinas normales
a partir de 3 meses después del trasplante, individual, se observaron células positivas GFP derivadas del donante dentro del compartimiento epitelial pancreática exocrina de los ratones de control trasplantados no tratados (figura 2A). Las pequeñas células GFP positivos que tenían la morfología celular de huso similares, o inmunológico, se dispersaron por el intersticio (datos no mostrados), mientras que en raras células GFP positivas con morfología acinar estaban presentes en el compartimiento exocrina. Un examen más detallado utilizando co-inmunofluorescencia, estas células fueron positivas para GFP, amilasa y aglutinina de cacahuete (Figura 2C, 2D), marcadores específicos para las células acinares pancreáticas, lo que sugiere que BMDC puede incorporar en el páncreas adulto y adoptar el estado diferenciado de la exocrina compartimiento. grupos cohesivos de 2-3 células fueron observadas a partir de 6 meses después del trasplante, mientras ocasionales unidades acinares enteros que consisten de células positivas GFP derivadas del donante también fueron evidentes (Figura 2B, 2E, 2F).
GFP inmunohistoquímica de páncreas identificado GFP + ve individuo células derivadas del donante con la morfología de las células acinares de 3 meses después del trasplante (A), y las unidades acinares enteras ocasionales (B), se observó a partir de 6 meses después del trasplante. Inmunofluorescencia imágenes de GFP derivada del donante + ve células acinares co-tinción positiva tanto para GFP y amilasa (C, E); y GFP y PNA (D, F).
BMDC y páncreas lesiones
Un brazo experimental para evaluar el injerto del donante BMDC en el páncreas lesión específica (pancreatitis crónica) y la regeneración fue también establecido. Después de 10 semanas de tratamiento caerulein, los ratones tenían páncreas que se habían atrofiado y fibrosis peri-acinar desarrollado como una fina malla a través de la glándula exocrina. lumina intra-acinares se dilata. Algunas unidades acinares parecían desarrollar un fenotipo ductal con la pérdida de gránulos de zimógeno y los núcleos más céntricos. Estos complejos tubulares consistían en cilindros de una amplia luz revestida por una monocapa de células de los conductos-como aplanados (figuras S1 B, E) [31], [32]. páncreas de control eran histológicamente normales (Figura S1 A). Sirius tinción con rojo de colágeno intersticial fue más prominente en los ratones tratados caerulein, indicativa de una lesión crónica. La tinción en los animales de control fue localizada principalmente alrededor de los conductos, los vasos sanguíneos pequeños con hilos finos que se extiende entre los lóbulos más grandes, y las unidades acinares no alrededor individuales. En los animales tratados caerulein periacinar colágeno aumentó, que rodea unidades acinares individuales, similar a la observada en fibrosis (S1D figuras, E) con pancreatitis crónica humana.
Tras el cese del tratamiento caerulein (3 meses después del trasplante inmediatamente después de una lesión) hubo una mayor BMDC contratación en el páncreas (Figura 3A). Esto incluía el reclutamiento de células inflamatorias GFP positivos tales como linfocitos (positivos para la expresión CD45; datos no mostrados) y los macrófagos, mientras que algunos BMDC encuentra intersticial fueron positivas para desmina, y las células peri-acinar de huso como poseía la morfología de las células estrelladas pancreáticas ( PASC de; Figura 3C). No se identificaron las células acinares ser donante de derivados (GFP positivo) en este punto de tiempo temprano.
Tenga en cuenta el aumento de la presencia de células GFP positivas dentro del intersticio del páncreas heridas, incluso infiltrado inflamatorio (A), en comparación con el páncreas regenerada (B); así como las células GFP positivas de huso como (flechas negras) con una morfología de las células estrelladas de páncreas (C) que rodean las unidades acinares (a); (D) del cromosoma Y FISH confirmó la contribución mínima de BMDC a la regeneración del parénquima exocrina, mientras que se observaron algunos linfocitos Y positivo en todo el parénquima (flechas blancas).
BMDC y páncreas regeneración
Tras el cese del tratamiento caerulein, los animales se dejaron recuperar para evaluar la contribución de BMDC a la regeneración de páncreas. Después de 3 meses de la recuperación después del cese del tratamiento caerulein, páncreas de los animales tratados volvió a un fenotipo normal histológicamente (Figura S1C), se asemeja a la de los animales no tratados. Una reducción del colágeno intersticial y periacinar también era visible (Figura S1F). En cuanto a páncreas normal, sólo en raras ocasiones grupos individuales y pequeños de células acinares GFP positivos que muestran la amilasa y la positividad de la ANP se observó, lo que sugiere que BMDC podría adoptar el estado diferenciado del compartimiento exocrina pancreática durante la regeneración. células inflamatorias GFP positivos intersticial fueron disminuidos en número como tiempo de regeneración aumenta (Figura 3B). Se observaron resultados similares para los ratones que fueron tratados con caerulein siguientes injerto a largo plazo (6 meses después del trasplante) y se dejaron recuperar.
In situ
hibridación para el cromosoma Y confirmó que no hubo un aumento en la contribución de BMDC al páncreas exocrino con la regeneración (Figura 3D).
BMDC y cáncer de páncreas
Dos semanas después de la inyección de DMBA, complejos tubulares estaban presentes de manera focal entre las células acinares con metaplasia ductal adyacente al tejido acinar normal, observada en un 1 mes. De 1 mes después del tratamiento con DMBA, las lesiones precursoras pancreáticas (mPanIN) con diversos grados de displasia estaban presentes. Los focos de adenocarcinoma en relación con mPanIN se observaron en el páncreas de 2 meses después de DMBA, mientras que el adenocarcinoma ductal (variante sarcomatoide) desarrolló a los 3-4 meses (Figuras S1G-I). Este fenotipo se parecía a la observada en un modelo similar utilizado por Kimura et al [30].
Se evaluó la contribución de BMDC al estroma desmoplásico, en particular, a la población de las células estrelladas pancreáticas, mediante la evaluación de co- expresión de GFP y la de las células estrelladas marcadores selectivos desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), α-músculo liso actina (αSMA), la co-expresión de la cual define las células estrelladas activadas [3], [33], [34] ( revisado en [35]). Estos marcadores, identificados originalmente como PASC específica, se utilizan para distinguir de PASC de fibroblastos normales debido a la co-expresión de la proteínas de filamentos intermedios desmina y GFAP [33], [34], mientras que la expresión de αSMA en PASC de fue descrito originalmente como una fuente de fibrosis en la pancreatitis crónica y el cáncer de páncreas, designando activa de PASC [3], [36]. No fue significativa reclutamiento BMDC al estroma circundante lesiones precursoras después del tratamiento con DMBA, con la contribución de BMDC a la población activado stellate pancreático de células (GFP, desmina y αSMA positiva; Figura S2A, C, E). co-análisis de inmunofluorescencia demostró también que los donantes derivados BMDC positiva tanto para GFP y αSMA estaba presente en las células directamente adyacentes a la neoplasia intraepitelial pancreáticos (mPanIN) lesiones (Figura S2B, D, F). También se observó el desarrollo de un tumor citoqueratina grandes, poco diferenciados e invasivo positivo /vimentina negativo adenocarcinoma ductal (sarcomatoide) con una población BMDC significativa (Figura 4A, 4B), que incluía una extensa infiltrado inflamatorio de donantes derivada, demostramos mediante FISH para el del cromosoma y (y-FISH; Figura 4C), así como de la médula ósea células derivadas activados pancreáticas estrelladas (Figura 4D), visualizado por co-inmunofluorescencia de GFP con αSMA (Figura 4D). No se observaron células tumorales epiteliales derivadas de la médula ósea. Se cuantificó la proporción de BMDC dentro del microambiente del tumor en 5 campos de aumento de potencia alta (400X) y determinamos que el 41,8% (± 2,77 SEM) de las células se derivan de la médula ósea (Figura 4). Se observaron resultados similares cuando se administró después de DMBA injerto a largo plazo (6 meses después del trasplante)
(A) H & amp;. E que muestra el tumor pancreático pobremente diferenciado, invasivo; (B) GFP IHC y (C) FISH cromosoma Y, demostrar la amplia médula ósea derivada población de células dentro del tumor; (D) Co-inmunofluorescencia de GFP con células estrelladas activadas αSMA identificado derivadas de médula ósea dentro del tumor (punta de flecha).
Más recientemente, Erkan
et al
[37] utiliza la transcripción perfiles para identificar marcadores para diferenciar de PASC asociado con pancreatitis crónica frente a los de cáncer de páncreas, con el objetivo de subtipificación de PASC en inflamación o asociada a cáncer. -De células B Pre factor de leucemia de transcripción 1 (PBX1) se upregulated en PASC asociado con la inflamación de comparación con PASC del asociado a un tumor, mientras que cadherina EGF LAG de siete pasadas de tipo G receptor 3 (CELSR3) expresión se upregulated en comparación de PASC asociado a tumor a la de PASC de la inflamación asociada a [37]. Examinamos 5 secciones cada uno de 3 ratones que se desarrollaron adenocarcinoma y observó que GFAP, PBX1 y CELSR3 expresión era co-localizada con GFP en de PASC asociado a tumor (Figura S3A, S3B, S3C respectivamente), y aunque PBX1 (pero no CELSR3) se detectó en el estroma en la pancreatitis, que no co-localizar con GFAP, lo que sugiere que no se expresa en las células estrelladas activadas.
Discusión
-género no coincidentes trasplantes de médula ósea toda demostraron que migran BMDC al páncreas y expandirse a medida que las unidades clonales para adoptar los estados diferenciados del compartimento exocrina. Aunque hubo reclutamiento mínima a la población de células acinares, que no aumentó con la lesión, la regeneración, o la carcinogénesis, hubo reclutamiento significativo al estroma. Aunque la mayoría de células reclutadas durante la lesión aguda y el cáncer eran células inflamatorias, una proporción diferenciarse en células estrelladas. Los asociado con el cáncer expresan marcadores característicos de células estrelladas asociados a tumores que sugieren que fueron cooptado, y alterada por el microambiente tumoral.
Mientras que la capacidad de regeneración se mantiene en el páncreas exocrino adulto, el origen de la regeneración de restos de epitelio claro [38]. Recientemente, un mecanismo de desarrollo clonal de acinos pancreáticos se ha descrito con evidencia a condición de que una única célula progenitora, ya sea una célula acinar maduro o una célula madre multipotentes, da lugar a todas las células exocrinas de un acino [39]. Además, los estudios de linaje rastreo proporcionan evidencia de que las nuevas células acinares se generan a partir de células acinares pre-existentes siguiente pancreatectomía parcial [40] y caerulein pancreatitis inducida por [41]. Teniendo en cuenta estos datos, y nuestras observaciones en el páncreas normal, la hipótesis de que BMDCs contribuyen a la regeneración del compartimento exocrina. A pesar de utilizar diferentes protocolos lesiones puntos de tiempo no hemos podido demostrar un aumento significativo de la contribución BMDC a la población de células acinares. Y los datos cromosoma FISH excluidos silenciamiento GFP [42], [43], [44] como una posible causa de la falta de expresión de GFP, y la distribución de células positivas GFP reflejada.
de PASC son células parecidas a miofibroblastos residentes existentes en el espacio periacinar del páncreas exocrino, y cada vez hay más pruebas que sugieren que son participantes clave en la patogénesis de enfermedades pancreáticas exocrinas, en particular en la producción de estroma fibroso abundante, que es una característica de cáncer de páncreas [3]. Aunque no fue significativa reclutamiento BMDC al infiltrado inflamatorio en el momento de la lesión pancreática consistente con informes anteriores [45], [46], esto fue números transitorios y de células disminuido con el tiempo a niveles bajos cuando la regeneración fue completa. Sin embargo, las células estrelladas se mantuvieron entre la población residual de BMDC. Esta observación sugiere que BMDC jugar un papel en el apoyo al proceso de regeneración, pero no transforman a contribuir a la propia epitelio regenerativo. Tumor asociados BMDC PASC de puede ser retenido en el estroma peritumoral, mientras que los asociados con la pancreatitis no lo son. Aunque el número de la médula ósea derivada PASC fue ligeramente menor en la configuración de la pancreatitis en comparación con el cáncer, serían necesarios puntos de tiempo más largos para determinar si BMDC fueron retenidos preferentemente en el páncreas en el entorno de cáncer.
Como en crónica pancreatitis, hubo una mayor contratación de BMDC al páncreas después del tratamiento con DMBA. De nuevo, esto incluye un infiltrado inflamatorio y activa de PASC. Es importante destacar que, la expresión de CELSR3 en BMDC asociado con tumor sugiere que hubo modificación de estos de PASC por el microambiente tumoral. Esto es apoyado por estudios recientes en los que las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea preferentemente se localizan en las regiones de crecimiento del tumor de páncreas [47] y se ha demostrado para transformar en miofibroblastos asociados a tumores en insulinomas [48]. cáncer de páncreas células secretan factores de crecimiento tales como TGF-β1, PDGF y VEGF, así como extracelulares inductores de metaloproteinasas de matriz (ECM) que transforman las normalmente quiescentes de PASC en un fenotipo de tipo miofibroblastos activados y secretan cantidades excesivas de ECM y enzimas degradan la matriz [ ,,,0],3], [4], [49] (revisado en [50]).