Extracto
Proteína Tirosina Fosfatasa localiza en la mitocondria 1 (PTPMT1) es una fosfatasa de especificidad dual localizada exclusivamente a la mitocondria, y recientemente se ha demostrado que es un componente crítico en la ruta de biosíntesis de cardiolipina. La regulación a la baja de PTPMT1 en las células beta del páncreas se ha demostrado que aumenta los niveles de ATP celular y la producción de insulina, sin embargo, el papel generalizado de PTPMT1 en células de cáncer no se ha caracterizado. Aquí mostramos que la regulación a la baja de la actividad PTPMT1 es suficiente para inducir la apoptosis de las células cancerosas. Además, el silenciamiento de PTPMT1 disminuye la concentración de cardiolipina en las células cancerosas, al tiempo que aumenta selectivamente los niveles de ATP en los medios glucolítica. Además, la regulación por disminución subletal de PTPMT1 efecto sinérgico con dosis bajas de paclitaxel para promover la muerte de células cancerosas. Nuestros datos sugieren que la inhibición de PTPMT1 causa una crisis metabólica en las células cancerosas que induce la muerte celular, y puede ser un mecanismo por el cual las células cancerosas se pueden sensibilizar a las terapias disponibles actualmente
Visto:. Niemi NM, Lanning NJ, Westrate LM, MacKeigan JP (2013) regulación a la baja de la fosfatasa mitocondrial PTPMT1 es suficiente para promover muerte de células cancerosas. PLoS ONE 8 (1): e53803. doi: 10.1371 /journal.pone.0053803
Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 21 de mayo de 2012; Aceptado: 5 de diciembre de 2012; Publicado: 10 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Niemi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de adjudicación número R01CA138651 del Instituto Nacional del cáncer para JP MacKeigan. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las mitocondrias, más comúnmente conocido como el "motor de la célula, 'contienen proteínas con extensas modificaciones post-traduccionales, incluyendo la fosforilación y la acetilación. Estas modificaciones a su vez influyen en la capacidad metabólica, la dinámica y la homeostasis global de los orgánulos [1], [2], [3], [4]. La localización de numerosos quinasas y fosfatasas dentro de las mitocondrias sugiere que la fosforilación es un proceso regulado activamente que juega un papel importante en la función de la proteína mitocondrial [5], [6]. A pesar de un amplio catálogo de eventos de fosforilación, así como las enzimas que pueden catalizar estos eventos, la regulación general de los procesos mitocondriales por la fosforilación, y cómo estos influyen en el destino de eventos celulares, sigue siendo oscuro.
PTPMT1 es una fosfatasa de especificidad dual localizada específica y exclusivamente a la mitocondria [7]. Está anclada dentro de la membrana mitocondrial interna con su dominio fosfatasa expuesto a la matriz, colocándolo proximal a numerosas enzimas responsables de la producción de energía y el metabolismo.
in vitro
estudios Curiosamente, sin embargo, iniciales usando recombinante PTPMT1 indicado que esta enzima tiene una clara preferencia por los sustratos lipídicos más de sustratos proteicos [8], lo que sugiere que PTPMT1 podría influir directamente en el compartimiento de los lípidos de la mitocondria. Un estudio reciente confirmó esta, lo que demuestra que las funciones de PTPMT1 como el fosfato de fosfatidilglicerol de mamífero (PGP) fosfatasa lipídica, que cataliza la penúltima etapa de la vía de biosíntesis de la cardiolipina [9]. Es importante destacar que la cardiolipina es sintetizado y utilizado exclusivamente dentro de la mitocondria, y se conocen las otras enzimas sintéticas críticos de esta vía para ser anclado en la membrana interna mitocondrial [10]. Esto coloca PTPMT1 específica y selectivamente en el lugar de la biosíntesis de cardiolipina, y sugiere que la modulación de este lípido puede ser una función crítica de esta fosfatasa.
Las perturbaciones en la homeostasis de la cardiolipina han sido previamente vinculado a la apoptosis. La cardiolipina dentro de la membrana mitocondrial interna se ha demostrado que se une al citocromo c, y se ha propuesto que se requiere la oxidación de este lípido para la liberación del citocromo c completo y posterior apoptosis mitocondrial dependiente de [11]. Además, la cardiolipina ha sido implicada en la orientación de numerosas proteínas pro-apoptóticas a las mitocondrias, incluyendo tBID, una proteína BH3-sólo conocido por inducir la liberación de citocromo c a través de la promoción de la permeabilización de la membrana mitocondrial externa [12]. Como un bloque en la apoptosis se considera que es una característica del cáncer [13], la desregulación de la cardiolipina podría afectar el potencial tumorigénico de las células influyendo en su capacidad para someterse a la muerte celular. Además, las alteraciones en la ruta biosintética de la cardiolipina también se han relacionado con la apoptosis. RNAi mediada desmontables de cardiolipina sintasa (CLS1; nombre de genes
CRLS1
). es suficiente para la liberación del citocromo c de la membrana mitocondrial interna, y sensibiliza las células cancerosas a los estímulos de apoptosis [14]
A pesar sorprendente homología entre PTPMT1 y otro fosfatasa lipídica, PTEN, dentro de sus dominios catalíticos [8], un enfoque de detección química identificó un compuesto, dihidrocloruro alexidina, que es específico para PTPMT1
in vitro
[15]. dihidrocloruro de alexidina es un compuesto bisbiguanida identificado inicialmente por sus propiedades anti-bacterianas, pero curiosamente también ha identificado como un inductor de la disfunción mitocondrial y la apoptosis [16]. Como PTPMT1 se localiza específicamente dentro de la mitocondria, dihidrocloruro de alexidina podría ser la modulación de la disfunción mitocondrial y la posterior pro-apoptótica afecta a través de la inhibición de la actividad fosfatasa PTPMT1
.
La función propuesta de la cardiolipina en el proceso de apoptosis normales, junto con la robusta de muerte celular que induce el fenotipo de dihidrocloruro de alexidina, nos llevó a formular la hipótesis de que la regulación negativa de la expresión génica PTPMT1 induciría un destino celular apoptótica en células de cáncer. Para explorar esta hipótesis, se utilizó RNAi desmontables PTPMT1 y determinar la consecuencia de la pérdida celular de este producto de genes específicos. Adicionalmente, hemos explorado los efectos de la PTPMT1 de metas de compuesto, dihidrocloruro de alexidina, en su capacidad tanto de inducir la muerte celular en las células cancerosas, así como para sensibilizar a estas células a agentes quimioterapéuticos a dosis subletales. Aquí, demostramos que el silenciamiento mediado por RNAi de PTPMT1 es suficiente para inducir la muerte de células cancerosas. Este fenotipo muerte celular se acopla con sorprendentes cambios metabólicos, incluyendo una regulación a la baja significativa de cardiolipina en la pérdida de PTPMT1, así como un aumento en los niveles de ATP selectivamente en medios que contienen glucosa. Estos datos iluminan un papel para PTPMT1 como un gen de supervivencia crítico en las células cancerosas, y sugieren que la orientación este fosfatasa podría ser una manera eficaz para sensibilizar a las células cancerosas a agentes quimioterapéuticos disponibles.
Resultados
RNAi actualmente Derribo de PTPMT1 mediada causa la muerte celular
Para examinar los efectos de derribar PTPMT1 sobre el destino celular, hemos utilizado dos únicas secuencias de siRNA dirigidos a las regiones que no se solapan de la fase de lectura abierta PTPMT1. Cada uno de estos siRNAs proporciona knockdown robusta de la PTPMT1 transcrito de ARNm 30 horas después de la transfección, tanto con PTPMT1 siRNAs dando más del 98% con respecto a GAPDH desmontables (Figura 1A). Para determinar si estos siRNAs interrumpir efectivamente la expresión de proteínas PTPMT1, se determinó la capacidad de cada siRNA para derribar sobreexpresado, la proteína marcada con FLAG (Figura 1B, panel superior), así como PTPMT1 endógena (Figura 1B, panel central). Estos experimentos demuestran claramente el silenciamiento de la expresión de proteínas PTPMT1 48 horas después de la transfección con cada siRNA.
(A) El análisis cuantitativo de RT-PCR de los niveles de mRNA en PTPMT1 células HeLa después de caída con dos que no se solapan siRNAs PTPMT1-specfic o control de un no-objetivo. las células (B) HeLa fueron transfectadas con siRNAs dos PTPMT1 o un control no la orientación de 48 hr. En un experimento, PTPMT1 se sobreexpresa (con una etiqueta FLAG) durante 20 horas (en total siRNA tiempo de transfección de 48 horas) y la expresión se sondeó con un anticuerpo FLAG (panel superior). siRNA tumbar también se determinó para PTPMT1 endógena (panel central). Tubulina (panel inferior) demuestra la igualdad de carga de lisados de proteínas en todos los carriles. células (C-E) HeLa fueron transfectadas con siRNAs de control o PTPMT1 y se recogieron después de tiempos indicados, en la que la muerte celular se ensayó por exclusión de yoduro de propidio. Las barras de error indican la desviación estándar de tres experimentos. La significación estadística se calculó utilizando la prueba t de Student; * - P & lt; 0,05; ** - P & lt; 0,01; *** - P & lt; 0,001. células (F) HeLa fueron transfectadas con siRNAs de control o PTPMT1 y se ensayaron para la viabilidad en el tiempo real (& gt; 120 horas). utilizando el sistema de xCELLigence
Curiosamente, ambas de estas secuencias de siRNA causar la muerte celular después de 72 horas de caída, que se convirtió más prominente a las 96 y 120 horas después de la desmontables (Figuras 1C-e, F). Para determinar el porcentaje de células que experimentan muerte celular, se realizó un análisis FACS de células positivas de yoduro de propidio a 72, 96, y 120 horas después de la caída siRNA en células transfectadas con o bien PTPMT1 siRNA o un control no la focalización. Como se esperaba, las células transfectadas con un ARNsi de control no dirigidos mostraron poca muerte celular durante el período de 120 horas de seguimiento, con 10,8% de muerte celular máxima observada durante este marco de tiempo (que es sólo ligeramente mayor que las células HeLa tratadas basales (p = 0,2 -0.9, ns)). Por el contrario, ya sea la orientación PTPMT1 siRNA causado robusto muerte celular, particularmente evidente a las 96 horas (PTPMT1 siRNA#1 p & lt; 0,001; PTPMT1 siRNA#2 p & lt; 0,05) y 120 horas (PTPMT1 siRNA#1 p & lt; 0,01; PTPMT1 siRNA#2 p. & lt; 0,001), lo que resultó significativa tanto sobre las células no tratadas (0 condición hr, las Figuras 1C-e) y coincidentes en el tiempo los controles sin la orientación
Para determinar la cinética más precisas de esta muerte celular, que supervisó en tiempo real la viabilidad celular tras la transfección de células HeLa con o bien un control no dirigido siRNA (azul) o una de las dos secuencias únicas PTPMT1 siRNA (PTPMT1-1, verde; PTPMT1-2, naranja) (Figura 1F). Recapitulando los datos de muerte celular de yoduro de propidio, las dos secuencias de siRNA comenzó a disminuir la proliferación celular de aproximadamente 72 horas después de la transfección y promueven el desprendimiento celular significativa (indicativo de la muerte celular) a las 96 y 120 horas después de la transfección. Estos datos demuestran que se requiere la expresión de PTPMT1 para la viabilidad celular en células HeLa, y sugiere que PTPMT1 puede ser necesaria para la viabilidad en las células cancerosas.
PTPMT1 Desmontables Causas Bax /Bak Dependent Apoptosis
Anterior informes han asociado la regulación a la baja de los niveles de cardiolipina con la liberación del citocromo c y la sensibilización a la muerte celular por apoptosis en las células cancerosas, así como los cardiomiocitos [14]; [17]. Por lo tanto, la hipótesis de que el fenotipo de muerte celular visto en respuesta a PTPMT1 caída fue una respuesta intrínseca o mitocondrial dependiente, apoptótica. Para determinar si PTPMT1 knockdown induce apoptosis, ensayamos la caspasa-3 de escisión, así como la escisión de su sustrato bien caracterizado, PARP. Las Figuras 2A y B demuestran que a las 96 horas post-transfección, las células transfectadas con un siARN no director no muestran enriquecimiento en cualquiera de caspasa-3 o PARP de escisión. Sin embargo, la transfección con cualquiera de PTPMT1 de metas de siRNA indujo un enriquecimiento robusto, tanto en la caspasa-3 (Figuras 2C y D) y la escisión de PARP (Figuras 2E y F). Es importante destacar que tanto la caspasa-3 división y la pista de PARP división en estrecha colaboración en estos experimentos, haciendo hincapié en el fenotipo apoptótico después PTPMT1 caída.
células (A-F) HeLa fueron transfectadas con el control no siRNA dirigidos (A, D ), PTPMT1 siRNA#1 (B, E), o PTPMT1 siRNA#2 (C, F) durante 96 horas. Las células se recogieron y se tiñeron para la caspasa-3 escindido (paneles superiores) o PARP escindida (paneles inferiores) en cada condición, con positividad se indica como un aumento en la fluorescencia en el histograma FACS (cuadrante inferior derecho). células (G-I) HeLa fueron transfectadas con control, PTPMT1, y /o BAX /BAK siRNAs durante 96 horas. Las células se recogieron y se tiñeron para exfoliados caspasa-3 (G, H) o positividad de yoduro de propidio (I). Las barras de error indican la desviación estándar de tres experimentos. La significación estadística se calculó utilizando la prueba t de Student; * - P & lt; 0,05; ** - P & lt; 0,01; *** - P & lt; 0,001
Mientras que la caspasa-3 es un marcador de muerte celular por apoptosis, se activa en respuesta a ambas señales apoptóticas intrínsecos y extrínsecos.. Para determinar si PTPMT1 caída indujo la apoptosis mitocondrial dependiente, se utilizó para derribar siRNAs dualmente las proteínas pro-apoptóticas BAX y BAK, cuya expresión es necesaria para la apoptosis clásica, mitocondrial dependiente [18]. En presencia de un control no la orientación normalizada para la concentración de siRNA, PTPMT1 induce la caspasa-3 escisión con cinética similar como se ve en la Figura 2C (Figura 2G). Sorprendentemente, sin embargo, Bax /Bak doble caída eliminó por completo la inducción de apoptosis mediada por PTPMT1 (Figura 2H). Para asegurarse de que PTPMT1 caída no está causando una muerte de células no apoptóticas en presencia de Bax /Bak desmontables, repetimos estos experimentos y las células se ensayaron para la positividad de yoduro de propidio. De acuerdo con nuestros datos anteriores, PTPMT1 siRNA provoca un aumento de la positividad de yoduro de propidio sobre un control no dirigido (Figura 2I, barras azules). Este aumento en la muerte celular está completamente bloqueado por Bax /Bak desmontables, que proporciona una protección significativa de la captación de yoduro de propidio se ve en las células PTPMT1 desmontables (Figura 2I, barras verdes; p & lt; 0,01 para PTPMT1 siRNA#1, p & lt; 0,001 para PTPMT1 siRNA#2). Estos datos demuestran que se requiere la expresión de Bax /Bak para la muerte celular inducida por PTPMT1, y sugieren que PTPMT1 caída induce una muerte intrínseca, mitocondrial dependiente de la apoptosis celular que depende de la liberación del citocromo c.
PTPMT1 Derribo Causas apoptótica la muerte celular en múltiples líneas celulares de cáncer
Aunque nuestros datos ha demostrado que la superposición de dos no siRNAs independientes, PTPMT1 orientada promueven una muerte celular apoptótica en células HeLa, la inactivación de genes de PTPMT1 en fibroblastos de embriones de ratón o de células hematopoyéticas se poco efecto sobre la viabilidad celular. La hipótesis de que la regulación por disminución en las células transformadas podría tener un efecto alternativo de destino celular en relación con estas células no transformadas, primario. Para determinar si la pérdida de PTPMT1 induce la muerte celular sólo en un subpanel de líneas celulares (tales como HELAS), o tiene efectos similares en otras células transformadas, se optó por un panel de líneas celulares de cáncer que son altamente susceptibles de siRNA transfección (todos & gt ; 95% transfectable, datos no mostrados). Estas líneas celulares cubren una amplia gama de tipos de tumores (sarcomas y carcinomas); tejidos de origen (hueso, cerebro, pulmón y riñón); y tumorigenicidad
in vivo
. Al igual que en nuestros experimentos anteriores, estas líneas celulares fueron transfectadas con un no-siRNA dirigidos o PTPMT1 siRNA#1 o#2. 120 horas después de la transfección, se recogieron y analizaron para la apoptosis a través de positividad Anexina V (Figuras eje y 3A-C) y de propidio positividad yoduro de las células (eje x, las Figuras 3A-C). Como se muestra en las Figuras 3B y C, la transfección de ambos PTPMT1 siRNAs causada robusto aumentado en Anexina V y tinción PI, lo que indica que estos siRNAs causan estas líneas celulares a someterse a apoptosis. En la mayoría de las líneas celulares de la prueba, esto era una respuesta sólida, con un promedio 3.8- y 3.9- veces de incremento en la muerte celular que se produce en 6 de 8 líneas celulares ensayadas con PTPMT1 siRNA#1 o#2 siRNA, respectivamente (Figura 3D). Se encontró que las células 786-0, un renales líneas celulares de carcinoma, no se vieron afectados significativamente por la caída PTPMT1 ya sea con siRNA (datos no presentados). Estos datos demuestran que PTPMT1 knockdown causa la muerte celular en este subgrupo de líneas celulares de cáncer, lo que sugiere su expresión es crítica para la supervivencia de estas líneas celulares.
(A-C) El pulmón línea celular de carcinoma H1299 y el osteosarcoma HOS de líneas celulares fueron transfectadas con no director (A), PTPMT1 siRNA#1 (B) o PTPMT1 siRNA#2 (C). Después de la transfección de estos siRNAs para 120 horas, la población de células sometidas a la muerte celular y la apoptosis se midió a través de propidio positividad yoduro (eje y) y V positividad Anexina (eje x). (D) Un panel de líneas celulares altamente transfectables derivadas de muchos tipos de tejidos (véase el mapa de calor por encima de etiquetas de colores) fueron transfectadas con la orientación o no PTPMT1 siRNAs. La muerte celular y apoptosis se ensayaron mediante yoduro de propidio y Anexina V positividad como en (A-C). Doblez se determinó el cambio en la apoptosis mediante la normalización de la muerte celular por ciento observada en las células transfectadas con un control no la orientación a 1, con el factor de cambio que refleja la cantidad de muerte celular por encima de este umbral en desmontables células PTPMT1. El mapa de calor muestra una serie de veces el cambio de 1 (cuadrados negros) a 5+ (cinco o más veces, al cuadrado rojo).
Titulación de PTPMT1 derribo Altera los Efectos sobre la viabilidad celular
p
RNAi titulación se ha utilizado anteriormente para determinar un umbral de la expresión del gen requerido para la viabilidad celular [19]. En estos experimentos, los oligonucleótidos de ARNsi se diluyeron y se titularon hasta un nivel nanomolar bajo de entender el nivel relativo de expresión de que un gen debe mantener para inducir o prevenir un destino celular específico, tal como la muerte celular. Para entender más a fondo la muerte celular inducida por ARNsi que habíamos visto en desmontables células PTPMT1, que titularon cada PTPMT1 siRNA, así como un control de siRNA no director, y examinamos los efectos de estas caídas diferenciales sobre la viabilidad de las células HeLa y proliferación. Como era de esperar, la valoración de un control no director desde 50 nM hasta 5 nM tuvo poco efecto sobre la capacidad de la viabilidad o la proliferación de células HeLa durante un período de tiempo 120 horas (Figura 4A, B, puntos de color azul marino de datos). expresión PTPMT1 se diferencialmente downregulated por titulación de ambos único PTPMT1 siRNAs, con el aumento de la eficiencia desmontables como cada concentración de siRNA aumentó de 5 nM a 50 nM (datos no mostrados). Curiosamente, la titulación de cada PTPMT1 siRNA alterado los perfiles de proliferación y viabilidad de las células desmontables PTPMT1; mientras que el 25 a 50 nM de PTPMT1 siRNA#1 o#2 es suficiente para inducir el desprendimiento celular, indicativo de la muerte celular, de 5 a 10 nM de este mismo siRNA parece detener la proliferación sin inducir el desprendimiento celular, como se indica por una pendiente neutral en el en tiempo real parcelas de viabilidad (Figura 4A, B).
células (a) HeLa fueron transfectadas con una dosis-respuesta de la no focalización (línea azul), PTPMT1#1 (línea verde) o PTPMT1#2 (naranja línea) siRNA más de 120 horas. Las células fueron transfectadas con 0, 5, 10, 25, o 50 nM de cada siRNA y en tiempo real la viabilidad fue rastreado utilizando xCELLigence. (B) Tasa de cambio en la impedancia celular, lo que refleja cambios en la proliferación (pendiente positiva) y /o la viabilidad (pendiente negativa) en las células transfectadas con el control o PTPMT1 siRNAs. Una tasa inferior de cambio en la impedancia se asocia con una disminución de la unión celular, indicativo de la muerte celular. Las barras de error indican la desviación estándar de tres experimentos. La significación estadística se calculó utilizando la prueba t de Student; * - P & lt; 0,05; ** - P & lt; 0,01; *** - P & lt; 0,001
Desmontables de PTPMT1 sensibiliza a las células del cáncer de subletal Las dosis de paclitaxel
La observación de que los niveles diferenciales de derribo de PTPMT1 cambió el destino de las células cancerosas planteó la posibilidad de que. knockdown subóptima de PTPMT1 (a un nivel que no es suficiente para inducir apoptosis) puede sensibilizar las células cancerosas a niveles bajos de quimioterapéutico que de otro modo serían relativamente ineficiente. Para probar esta hipótesis, transfectadas 5 nM de siRNAs de control o PTPMT1 específicos en células HeLa durante 30 horas antes de la exposición de estas células a bajas concentraciones (5 nm) del paclitaxel quimioterapéutico durante 24 horas adicionales. La Figura 5 demuestra que la transfección de células HeLa con bajos niveles de no director siRNA no promueve la sensibilización a dosis bajas de paclitaxel, con 5 nM paclitaxel inducir una reducción del 21% en la viabilidad celular no director siRNA (Figura 5A). La transfección de 5 nM PTPMT1 era suficiente para sensibilizar a las células a tratamiento con paclitaxel: mientras que el 21% de las células de control se sometieron a la muerte celular en presencia de 5 paclitaxel nM, 38% o 57% de 5 células tratadas con ARNsi nM PTPMT1 sometió significativamente más muerte celular bajo las mismas condiciones (siRNAs 1 y 2, respectivamente; p & lt; 0,01 para PTPMT1 siRNA#1, p & lt; 0,001 para PTPMT1 siRNA#2, las figuras 5B y C). Es importante destacar que, 5 nM de cada siRNA dirigidos PTPMT1 no causa toxicidad celular significativa a las 72 horas (Figura 5D, E), lo que demuestra que la muerte inducida por 5 nM PTPMT1 siRNA combina con es probable 5 nM tratamiento paclitaxel una interacción sinérgica. Para confirmar estas observaciones, se determinó la población de células que experimentan muerte celular tras la exposición paclitaxel después de la incubación con 5 nM PTPMT1 siRNA. Aunque ninguno de 0,1 nM ni 1 nM paclitaxel induce propidio positividad yoduro en las células transfectadas con un no-focalización siRNA (Figura 5F, barras negras), ambas de estas dosis de paclitaxel aumentar significativamente la población de células sometidas a la muerte celular después de la transfección con PTPMT1 siRNAs ( Figura 5F, barras grises). En general, estos datos demuestran que subletal RNAi mediada desmontables de PTPMT1 es suficiente para sensibilizar a las células HeLa a dosis subletales de paclitaxel quimioterapéutico.
células (A-C) HeLa fueron transfectadas con 5 nM no -targeting siRNA (a), PTPMT1 siRNA#1 (B), o PTPMT1 siRNA#2 (C) durante 30 horas antes del tratamiento con una respuesta a la dosis de paclitaxel subletal (hasta 5 nM) durante 24 horas. La viabilidad celular se midió utilizando Titulación Glo. (D) viabilidad de las células HeLa no tratadas transfectadas con cada siRNA en 54 horas. (E, F) La cuantificación de la viabilidad de las células HeLa (E) o HeLa muerte celular por exclusión de yoduro de propidio (F) con 5 nM no focalización o PTPMT1 siRNA (54 hr tratamiento total) y 5 del tratamiento con paclitaxel nM (24 hr tratamiento total) . Para cada experimento, las barras de error indican la desviación estándar de tres experimentos. La significación estadística se calculó utilizando la prueba t de Student; * - P & lt; 0,05; ** - P & lt; 0,01; . *** - P & lt; 0,001
PTPMT1 derribo Induce significativas metabólicos Los cambios en las células cancerosas
Después de ser identificado como una fosfatasa mitocondrial, la función PTPMT1 estaba vinculado con el metabolismo mitocondrial cuando estaba muestra que PTPMT1 caída provoca un aumento robusto de los niveles celulares de ATP en células beta pancreáticas [7]. Recientemente, PTPMT1 fue identificado como una fosfatasa clave en la biosíntesis de cardiolipina, un lípido mitocondrial clave vinculado tanto el metabolismo mitocondrial y apoptosis. Es importante destacar que las deficiencias en los niveles de cardiolipina celulares se han relacionado con la apoptosis [14], [20], que nos lleva a investigar si PTPMT1 caída en las células del cáncer altera este lípido mitocondrial. Las células HeLa fueron transfectadas con un no-focalización o la piscina de PTPMT1 siRNAs (siRNAs#1 +#2) durante 72 horas, después de lo cual los lípidos celulares fueron radiomarcado, se extrajo, y se resolvieron mediante cromatografía en capa fina. Consistente con los resultados publicados previamente [9], la ablación de la expresión PTPMT1 causa una disminución en los niveles de cardiolipina robusto con respecto a las células que expresan un control no focalización (77% de disminución, p & lt; 0,001, las Figuras 6A y B). Estos cambios en la composición lipídica mitocondrial se han demostrado para alterar la capacidad metabólica de las células, con la pérdida de expresión PTPMT1 resulta en un aumento en los niveles de ATP que resultan de un cambio compensatorio a la glucólisis mejorada [9]. Para determinar si el metabolismo mitocondrial se altera en desmontables células PTPMT1, los niveles de ATP se midieron en células que expresan ya sea un no-orientación o la piscina PTPMT1 siRNA (siRNAs#1 +#2). Como se muestra en la Figura 6C, desmontables células PTPMT1 tienen significativamente más ATP por célula que las células transfectadas con un control no la orientación cuando se cultivan en medios estándar que contienen glucosa (40,5% más ATP /célula, p & lt; 0,001). Para determinar si este incremento depende de metabolismo de la glucosa, también se realizó este experimento en células cultivadas en medios que contienen sólo piruvato como fuente de carbono, no permitir el programa glycolyic para acoplarse. En estas condiciones, no hay ningún cambio significativo en los niveles de ATP en las células desmontables PTPMT1 en relación con las células de control (10% más de ATP /célula, la Figura 6C, p = 0,178). En conjunto, estos datos sugieren que PTPMT1 caída disminuye los niveles de cardiolipina en células HeLa, que lleva a un aumento transitorio de los niveles de ATP independientes del metabolismo mitocondrial, muy probablemente debido a la glucólisis mejorada.
(A, B) se transfectaron células HeLa con la no focalización o un grupo de PTPMT1 siRNAs (# 1 +#2) durante 72 horas. Las células se incubaron con
32P-ortofosfato y radiomarcados se extrajeron los lípidos y resueltas mediante cromatografía en capa fina. La cardiolipina se muestra como el punto más alto captación de imagen sobre las placas de TLC (A), y se cuantificaron los niveles totales de cardiolipina (B). (C) Total ATP /célula se ensayó en células transfectadas con un no-orientación o la piscina PTPMT1 de siRNAs durante 72 horas. ATP /célula se determinó en células en crecimiento en ambos medios que contienen glucosa altos o medios que contienen sólo piruvato. Las barras de error indican la desviación estándar de al menos tres experimentos. La significación estadística se calculó utilizando la prueba t de Student; * - P & lt; 0,05; ** - P & lt; 0,01; . *** - P & lt; 0,001
alexidina Dihydrochloride Inhibe PTPMT1
in vitro
e induce la apoptosis en células de cáncer
Una publicación reciente ha identificado el compuesto dihidrocloruro alexidina en como un inhibidor selectivo de la PTPMT1
in vitro
[15]. Hemos tratado de validar estos datos utilizando PTPMT1 recombinante. Como control, también a prueba la capacidad de dihidrocloruro de alexidina para inhibir MKP-3, una fosfatasa de especificidad dual con poca homología con PTPMT1. En consonancia con los datos generados por Doughty-Shenton et al., Dihidrocloruro de alexidina inhibe la actividad fosfatasa de PTPMT1 con un IC significativamente menor
50 que otras fosfatasas, incluyendo MKP-3 (2,5 M durante PTPMT1 v. 265 M durante MKP-3 , la Figura 7A). Antes de su identificación como un inhibidor específico de la actividad de la fosfatasa PTPMT1, dihidrocloruro de alexidina había demostrado inducir apoptosis en células de cáncer [21]. Para determinar si dihidrocloruro alexidina indujo la muerte celular en nuestro sistema experimental, se realizó un sencillo experimento de respuesta a dosis en los que expusieron células HeLa a dos veces diluciones en serie de dihidrocloruro de alexidina durante 24 horas. En consonancia con el informe anterior, dihidrocloruro alexidina promueve la muerte celular robusto, con un EC
50 cerca de 2,8 M (Figura 6B). Es importante destacar que esta concentración está cerca de la concentración que inhibe específicamente PTPMT1 recombinante
in vitro
, lo que sugiere que la orientación específica de esta fosfatasa podría ser responsable de este fenotipo muerte celular.
(A) recombinante PTPMT1 y MKP-3 fueron tratados con diferentes concentraciones de dihidrocloruro alexidina,
in vitro se realizaron ensayos de fosfatasa
, y los efectos resultantes sobre la actividad enzimática medidos. El IC
50 para cada enzima se calcula y se muestra utilizando SigmaPlot. las células (B) HeLa fueron tratados con una respuesta a la dosis de dihidrocloruro de alexidina durante 24 horas y los cambios resultantes en la viabilidad se midieron utilizando Cell Titer Glo. células (C, D) HeLa fueron tratados con dihidrocloruro de alexidina durante 24 horas antes de medir la muerte celular (C) por tinción con yoduro de propidio (C) o la inducción de la apoptosis mediante tinción con anexina V (D). Para cada experimento, las barras de error indican la desviación estándar de tres experimentos. La significación estadística se calculó utilizando la prueba t de Student; * - P & lt; 0,05; ** - P & lt; 0,01; . *** - P & lt; 0,001
Para confirmar que diclorhidrato alexidina fue inducir una muerte celular apoptótica similar a lo que vimos con PTPMT1 siRNA desmontables, expusimos las células HeLa a una respuesta a la dosis de dihidrocloruro de alexidina, determinar qué concentraciones de inducir la muerte celular (a través de la tinción de yoduro de propidio) y si esta muerte celular era apoptótica (mediante la determinación de Anexina V positividad). Estos datos demuestran que hay un aumento espectacular en la muerte celular HeLa entre 2,5 y 5 mM tratamiento dihidrocloruro alexidina (Figura 7C), que está de acuerdo con nuestra curva de respuesta a la dosis inicial. Es importante destacar que este cambio a la muerte celular es apoptótica, ya que un aumento similar en las células positivas anexina V se ve con la misma respuesta a la dosis (Figura 7D), y está en el intervalo micromolar bajo, que dirige específicamente la actividad de fosfatasa PTPMT1
in vitro
. Estos datos sugieren que el fenotipo de apoptosis inducida por el tratamiento dihidrocloruro alexidina podría ser debido a la inhibición de la actividad de la fosfatasa PTPMT1.
subletal Las dosis de alexidina Dihydrochloride son suficientes para sensibilizar a las células cancerosas a los bajos niveles de paclitaxel, pero no son completamente Dependiendo La inhibición PTPMT1
Nuestros datos sugieren que desmontables sub-letal de PTPMT1 puede sensibilizar a las células a dosis subletales de quimioterapéutico sugieren que las dosis subletales de dihidrocloruro alexidina también podrían resensitize células para quimioterapéutico. Usando las curvas de respuesta de dosis analizadas en la Figura 6, se trataron células HeLa con una dosis subletal de cualquiera de 0,5 M o 1 M de dihidrocloruro de alexidina durante 24 horas. Es importante destacar que, ni la concentración de la muerte celular inducida por fármacos en este marco de tiempo (Figura 7B-D). A continuación, las células tratadas expuestos dihidrocloruro alexidina, o células tratadas con un vehículo único control, a una respuesta a la dosis de paclitaxel durante 24 horas adicionales antes de ensayar la viabilidad. Ambas dosis de dihidrocloruro de alexidina eran suficientes para sensibilizar a las células a una amplia gama de concentraciones de paclitaxel. Curiosamente, 0,5 dihidrocloruro alexidina mu M no fue capaz de sensibilizar a las células de manera significativa a la dosis de paclitaxel por debajo de sus CE
50 (dosis que van desde 0,01 hasta 7,8 nM, Figura 8A). Sin embargo, a dosis más altas, todos los cuales exceden 15,6 nM paclitaxel, alexidina pre-tratamiento dihidrocloruro es capaz de sensibilizar significativamente las células a tratamiento con paclitaxel (por 15,6 dosis nM, p & lt; 0,05, por 31,25 a 250 nM de paclitaxel, p & lt; 0,01, Figura 8A). En comparación, 1 dihidrocloruro alexidina M sensibiliza a las células de paclitaxel a todas las dosis examinadas (por 0,01 nM dosis, p & lt; 0,05; para el resto de las dosis, p & lt; 0,001, Figura 8B). Para confirmar estos datos, se determinó el porcentaje de células expuestas a niveles subletales de dihidrocloruro de alexidina (0,5 M o 1 M) que mancha positiva para yoduro de propidio después de tratamiento con 1 nM de paclitaxel. Mientras que el tratamiento de las células con un vehículo sólo tiene efectos mínimos para el control de las células expuestas a paclitaxel (8,0% v. 8,6% de muerte celular, p = 0,24, NS, Figura 8C), el tratamiento previo de las células, ya sea con alexidina 0,5 M o 1 M