Extracto
El receptor de laminina no integrina, aquí designado el /67-kDa del receptor de laminina de 37 kDa (PRL /LR), que está involucrado en muchos procesos fisiológicamente relevantes, así como numerosas condiciones patológicas. La sobreexpresión de PRL /LR en diversas líneas celulares cancerosas juega un papel crítico en la metástasis del tumor y la angiogénesis. Este estudio investigó si LRP /LR está implicado en el mantenimiento de la viabilidad celular en el pulmón y líneas celulares de cáncer de cuello uterino. Aquí nos muestran una reducción significativa de la viabilidad celular en las líneas celulares mencionadas anteriormente, como resultado de la regulación a la baja siRNA mediada de LRP. Esta reducción en la viabilidad celular se debe a un aumento de los procesos de apoptosis, reflejados por la pérdida de la integridad nuclear y el aumento significativo en la actividad de la caspasa-3. Estos resultados indican que la PRL /LR está implicado en el mantenimiento de la viabilidad celular en el pulmón y las células tumorigénicas cuello uterino a través del bloqueo de la apoptosis. Desmontables de PRL /LR de siRNA podría representar una estrategia terapéutica alternativa para el tratamiento de cáncer de pulmón y cáncer de cuello uterino
Visto:. Moodley K, Weiss SFT (2013) regulación a la baja de la laminina de receptores no integrina Reduce celular Viabilidad por La inducción de la apoptosis en células de pulmón y cáncer de cuello uterino. PLoS ONE 8 (3): e57409. doi: 10.1371 /journal.pone.0057409
Editor: Elad Katz, AMS Biotecnología, Reino Unido
Recibido: 21 Noviembre 2012; Aceptado: January 21, 2013; Publicado: 5 de Marzo, 2013
Derechos de Autor © 2013 Moodley, Weiss. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. NRF, Sudáfrica. MRC, Sudáfrica. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
lamininas pertenecen a una gran familia de proteínas de matriz extracelular que están involucrados en una serie de procesos biológicamente importantes, incluyendo la diferenciación celular, la migración, la adhesión, el crecimiento y la señalización [1]. Los efectos de la laminina a menudo están mediados por su interacción con proteínas de unión a laminina-integrina y no integrina, que funcionan como receptores y enlace laminina en la matriz extracelular a intracelular de cascadas de señalización [1].
A de unión a laminina importante socio es una proteína multifuncional, designado aquí como el receptor de laminina de 37 kDa /67-kDa (LRP /LR). El receptor de laminina de 67 kDa se forma a partir del precursor del receptor de laminina de 37 kDa [2], [3]. El mecanismo exacto de esta conversión es actualmente todavía difícil de alcanzar, sin embargo, algunos estudios han sugerido que la forma no glicosilada de 37 kDa se convierte acila en Ser2 a través de la acción de los ácidos grasos; y esta acilación es un paso crítico en la conversión de la forma de 37 kDa a la forma 67 kDa [4], [5].
LRP /LR es un receptor de superficie de células no integrina mostrar un elevado afinidad para laminina-1 [6], y se ha encontrado para localizar en el citoplasma [7], [8], [9], en la superficie celular [10], [11], en el compartimiento perinuclear [7], [12], [13] y en el núcleo [12], [13]. En cada uno de estos lugares, LRP /LR está implicado en numerosos procesos fisiológicos, incluyendo la síntesis de proteínas [8], la maduración de la subunidad ribosómica 40S [8], que actúa como un receptor para componentes de la matriz extracelular por ejemplo hidratos de carbono y la elastina [14], las interacciones con la proteína priónica celular [13], [15] y asociaciones con las histonas [12].
Además de sus numerosas funciones fisiológicas, LRP ha sido implicado en una serie de procesos patológicos - sirve como un receptor para los priones infecciosos [16], ciertas bacterias [17], y varios virus [18], [19], [20]. En particular, un número de tipos de cáncer, tales como gástrico [21], de colon [22], de colon [23], cervical [24], de mama [25], de pulmón [26], de ovario [27], de páncreas [28] y de próstata [29] tipos de cáncer, revelan una sobreexpresión de la 67-kDa LR en su superficie celular, el uso de anticuerpos específicos anti-LRP /LR redujo significativamente la adherencia y la invasión de células de cáncer
in vitro
[6 ], [30], los componentes clave de la metástasis. Una fuerte correlación también se ha establecido entre LRP /LR y la angiogénesis del cáncer, con la expresión de esta proteína se correlaciona con aumento de la angiogénesis del tumor [31]; recientemente hemos descubierto que que la PRL /LR anticuerpo específico, W3, la angiogénesis [32] bloqueado.
Desde la focalización de PRL /LR sobre las células cancerosas se ha demostrado tener éxito en lo que respecta a la reducción de la metástasis tumoral [6], [30], el papel de este receptor en la viabilidad de células de cáncer y la supervivencia se ha convertido en un tema de gran interés. Este estudio, por lo tanto, con el objetivo de evaluar el efecto de la caída siRNA mediada de LRP sobre la viabilidad y supervivencia de células de pulmón y cáncer de cuello uterino y para determinar la posible los enfoques mecanicistas de los efectos observados. Pulmón y células de cáncer cervical fueron escogidos para este estudio, ya que representan los dos principales tipos de cáncer diagnosticados en los hombres y mujeres del sur de África, respectivamente. Hemos demostrado en este estudio que el knockdown siRNA mediada de LRP /LR en A549 y células HeLa causó una reducción significativa en la viabilidad de estas células. Además, se demostró que esta reducción en la viabilidad celular era como consecuencia de las células que experimentan apoptosis.
Materiales y métodos
cultivo celular y Condiciones
células A549 y HeLa se obtuvieron a partir de ATCC, se cultivaron en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 1% de penicilina /estreptomicina y se mantuvieron en un incubador humidificado a 37 ° C con 95% de aire y 5% de CO
2.
citometría de Flujo
la citometría de flujo se realizó para determinar los niveles de PRL de la superficie celular en células HeLa y A549. Brevemente, se separaron las células, se sedimentaron y se fijaron en 4% de paraformaldehído. Las células fueron incubadas en 30 mg /ml de la primaria-LRP específica anticuerpo IgG1-IS18 en Epopeyas ™ fluido de funda para 1 h. Las células fueron lavadas en Epopeyas ™ fluido de funda y se incubaron en 30 mg /ml de cabra anti-IgG de conejo-FITC anuncios humanos anticuerpo secundario (Beckman Coulter) en Epopeyas ™ fluido de funda. Posteriormente, las células se lavaron en Epopeyas ™ fluido de funda y se analizaron.
se utilizó Western Blotting
transferencia Western para determinar los niveles totales y downregulated proteínas de LRP (β-actina utilizados como control de carga ) después de la transfección con siRNA-LAMR1. Brevemente, se lisaron las células, los niveles de proteína cuantificados y 5 g de lisado celular bruto resolvieron en un gel de poliacrilamida al 12%. Las proteínas se transfirieron posteriormente a una membrana de nitrocelulosa mediante electro-secante para 45 min semi-seco. La membrana se bloqueó en 3% de BSA, se incuban en una solución 01:10 000 de la LRP-específica anticuerpo primario IgG1-IS18 en 3% de BSA en PBS-Tween durante 1 hora a 4 ° C con agitación. La membrana se lavó posteriormente en PBS-Tween, se incubaron adicionalmente en una solución 01:10 000 de anti-humano POD anticuerpo secundario en 3% de BSA en PBS-Tween durante 1 hora a 25 ° C con agitación, se lavaron como antes y se analizó.
regulación a la baja de siRNA mediada PRL
células A549 y HeLa fueron transfectadas por caída LRP con siRNA comprado de Dharmacon, Cat#J-013303-08, de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando DharmaFECT® 1 transfección reactivo. Control de siRNA utilizado - Cat#D-001810-01-05
Ensayo MTT
0,6 × 10
4 A549 y 3 × 10
3 células HeLa fueron sembradas en el. pocillos de una placa de 96 pocillos. Las células fueron transfectadas con siRNA-scr o siRNA-LAMR1, como se describe, y se dejó incubar en un incubador humidificado a 37 ° C con 95% de aire y 5% de CO
2 para 72 h. 10 g de MTT disuelto en PBS a continuación, se añadió a cada pocillo una se dejó incubar durante 2 h como antes. Los medios de comunicación se descartó de cada pocillo y los cristales de formazán púrpura disolvió en 200 l de DMSO. La absorbancia de cada pocillo se midió a 570 nm usando un lector de placas de ELISA.
inmunofluorescencia Microscopía
4 × 10
5 A549 y 3,5 × 10
se sembraron 5 células HeLa en cubreobjetos en los pocillos de una placa de 6 pocillos. Las células fueron transfectadas con siRNA-scr y siRNA-LAMR1, como se describe, y se incubaron en un incubador humidificado a 37 ° C con 95% de aire y 5% de CO
2 para 72 h. Los cubreobjetos se retiraron y las células se fijaron en paraformaldehído al 1%, se tiñeron con Hoechst 33342 (1:10 000 en PBS) y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia.
caspasa-3 Ensayo de Activación
4 × 10
5 A549 y 3,5 × 10
5 células HeLa se sembraron en los pocillos de una placa de 6 pocillos. Las células fueron transfectadas con siRNA-scr y siRNA-LAMR1, como se describe, y se incubaron en un incubador humidificado a 37 ° C con 95% de aire y 5% de CO
2 para 72 h. La actividad de la caspasa-3 se analizó mediante el caspasa-3 Kit de ensayo (Sigma-Aldrich) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Evaluación estadística
Los datos se analizaron estadísticamente mediante la prueba de Dunnett usando GraphPad INSTAT. Los resultados se consideraron estadísticamente significativas cuando el valor de p fue inferior a 0,05.
Resultados
células
pulmón y cáncer de cuello uterino mostrar los niveles altos de superficie celular de PRL /LR total y los niveles de PRL
Dado que la sobreexpresión de LRP se ha observado en numerosas líneas de células cancerosas, los niveles de superficie celular de LRP /LR y los niveles totales de LRP en A549 y células HeLa se determinó mediante análisis de citometría de flujo y transferencia Western, respectivamente (Figura 1). Citometría de flujo revelaron que 83% y 80% de A549 y células HeLa, respectivamente, expresados LRP /LR en su superficie celular (Figura 1A y 1B), estos valores son altos en comparación con el /LR nivel de la superficie celular LRP (57%) de la línea de células no tumorigénicas, NIH 3T3, (datos no mostrados) y confirma los resultados obtenidos en estudios previos [30]. LRP se encontró que se expresa en las dos líneas celulares por transferencia Western, además, el análisis densitométrico posterior de las señales de transferencia de Western obtenidos reveló que A549 y células HeLa mostrar niveles similares de esta proteína (Figura 1C).
A) 83% de A549 y B) 80% de las células HeLa que se muestra LRP /LR en su superficie (picos izquierdo y derecho son representativos de las células no marcadas y células incubadas inicialmente con el anticuerpo anti-LRP IgG1-IS18 y, posteriormente, con el anti cabra -rabbit IgG-FITC anuncios humanos anticuerpo secundario, respectivamente). C) A549 (carriles 1-3) y HeLa (carriles 4-6) células PRL expresa y análisis densitométrico reveló no significativa (p & gt;. 0.05) en los niveles totales de PRL entre las dos líneas celulares
Determinación de la regulación a la baja de siRNA mediada por la expresión de PRL en las células del pulmón y el cáncer cervical
el nivel de expresión de PRL en A549 y células HeLa después de la transfección con siRNA-LAMR1 se determinó mediante Western Blot y cuantificados por densitometría (Figura 2). El análisis densitométrico de las señales de transferencia de Western obtenidos reveló que A549 (Figura 2A) y HeLa (Figura 2B) Las células transfectadas con siRNA-LAMR1 expresado 80% y 60% menos de LRP, respectivamente, en comparación con los controles no transfectadas que se fijaron a 100% .
El nivel de expresión de PRL en A549 y células HeLa se investigó 72 h después de la transfección con siRNA-LAMR1. El análisis densitométrico de las señales de transferencia de Western reveló una disminución significativa (** p & lt; 0.01) 83% y 60% de reducción en la expresión de proteínas LRP en A) A549 y B) células HeLa, respectivamente, en comparación con las células control no transfectadas (ajustado a 100% ).
el derribo siRNA mediada por la expresión de PRL provoca una reducción significativa en la viabilidad de pulmón y células de cáncer cervical
el efecto de la regulación a la baja de siRNA mediada por la expresión de proteínas LRP en la viabilidad celular en A549 y células HeLa se determinó usando un ensayo de MTT. Las células se incubaron con PCA mM 8 (un compuesto conocido para disminuir la viabilidad celular a través de la inducción de la apoptosis [33]) como control positivo y se transfectaron con un siRNA no director (siRNA-scr) como un control negativo. 8 valores de PCA mM y siRNA-LAMR1 se compararon con los valores de siRNA-scr, que habían sido fijados en 100%. Los resultados de este ensayo indican que la significativa (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01) disminución de la viabilidad de A549 y células HeLa (13% y 18%, respectivamente) es como resultado de la reducción de la expresión de esta proteína (Figura 3).
La viabilidad de A549 y células HeLa se analizó 72 h después de la transfección usando un ensayo MTT. A) A549 y B) células HeLa transfectadas con ARNsi-LAMR1 revelaron una disminución significativa (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0.01) 13% y 18% de disminución en la viabilidad celular, respectivamente, en comparación con siRNA-scr que se había establecido a 100% (8 mM PCA se utilizó como control positivo).
La regulación a la baja de siRNA mediada por la expresión de PRL provoca una pérdida de la morfología nuclear en células de pulmón y cáncer de cuello uterino
Para investigar un posible mecanismo para la muerte observada en la viabilidad celular en respuesta a LRP caída en A549 y células HeLa, se evaluó la morfología nuclear de las células antes mencionadas. células A549 y HeLa fueron transfectadas con siRNA-LAMR1, se incubaron con PCA 8 mM (un conocido inductor de apoptosis [33]) como control positivo y se transfectaron con ARNsi-scr (control negativo). Después las células se tiñeron con el colorante nuclear fluorescente Hoechst 33324 y vieron en un microscopio de inmunofluorescencia. Las imágenes nucleares obtenidos para siRNA-LAMR1 se compararon con siRNA-scr - los núcleos aparecen pérdida constreñido y definida de la morfología y la integridad nuclear se observa (figura 4-blancas flechas). Además, el porcentaje de células que muestran los cambios morfológicos se determinó contando el número de células con y sin cambios morfológicos nucleares en 3 micrografías. 56% de las células A549 y 91% de las células HeLa mostraron cambios morfológicos nucleares en la respuesta al tratamiento siRNA-LAMR1 (7% y 8% de siRNA-scr tratado células A549 y células HeLa, respectivamente, mostraron cambios morfológicos nucleares).
72 h después de la transfección, A549 y células HeLa se tiñeron con Hoechst 33342 y vistos por microscopía de inmunofluorescencia. Las células transfectadas con siRNA-LAMR1 muestran una disminución de la integridad nuclear - indicada por las flechas blancas (8 mM PCA se utilizó como control positivo)
Derribo siRNA mediada de PRL provocó un aumento significativo de la caspasa-3 actividad. en células de pulmón y cáncer de cuello uterino
la actividad de la proteína efectora asociado a la apoptosis, la caspasa-3, en respuesta a la regulación a la baja de siRNA mediada por la expresión de PRL en A549 y células HeLa se evaluó mediante una activación de la caspasa-3 ensayo. células A549 y HeLa fueron transfectadas con siRNA-LAMR1, se incubaron con PCA mM 8 (un inductor de la apoptosis [33] - control positivo) y transfectadas con siRNA-scr (control negativo). La actividad de la caspasa-3 de células transfectadas con siRNA-LAMR1 se comparó con las transfectadas con siRNA-scr (que había sido ajustado a 100%); estos resultados ponen de manifiesto una disminución significativa (** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001). aumento de la actividad de caspasa-3 en A549 y células HeLa transfectadas con ARNsi-LAMR1 (9% y 83%, respectivamente) (Figura 5)
la actividad de la proteína de la apoptosis asociada, se analizó la caspasa-3, en A549 y células HeLa 72 h después de la transfección. A) A549 y B) células HeLa transfectadas con ARNsi-LAMR1 revelan una significativa (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,001) 9% y 83% de aumento en la actividad de caspasa-3, respectivamente, en comparación con el siRNA-scr que tiene ha establecido en 100% (8 mM PCA se utilizó como control positivo).
Discusión
el papel del receptor de laminina en la progresión del cáncer ha sido un tema de gran interés para muchos años y, por tanto, ha sido ampliamente investigado. Numerosos estudios han implicado a la superficie celular LRP /LR en la progresión del cáncer - este receptor se sobreexpresa en la superficie de un número de líneas celulares cancerosas, que les ofrecen la capacidad de metástasis e invadir los tejidos circundantes [6], [30]. Dado que la PRL /LR está involucrado en una serie de procesos celulares y se encuentra en numerosas localizaciones celulares (la superficie celular, el citoplasma, el compartimiento perinuclear y en el núcleo), funciones adicionales de este receptor en la progresión del cáncer se han sugerido.
Para confirmar la expresión de PRL /LR en células HeLa y A549, la superficie celular y los niveles totales de esta proteína se investigó mediante citometría de flujo y transferencia Western, respectivamente (Figura 1). Las células de pulmón y el cáncer cervical tumorigénicas tanto muestran LRP /LR en su superficie, y se encontró que el nivel de esta proteína en la superficie de estas células para ser más alto que el nivel observado en la línea de células no tumorigénicas NIH 3T3 (fibroblastos de embriones de ratón ). Este hallazgo confirma la investigación anterior, y sugiere un papel de este receptor en la progresión de las células de ser normal a convertirse en cancerosas. Además, el pulmón y cervical tumorigénicos células cancerosas tanto expresa PRL internamente, y la diferencia en el nivel interno de esta proteína en estas líneas celulares es insignificante.
Para investigar el papel de PRL /LR en el cáncer relacionados /citotóxico procesos, su expresión se redujo significativamente en el pulmón y tumorigénicos células de cáncer cervical. siRNA dirigido contra LRP mRNA se transfectó en las células antes mencionados y el porcentaje de LRP regulación a la baja evaluada por análisis densitométrico de las señales de transferencia de Western obtenidos (Figura 2). El nivel de expresión LRP se redujo en un 83% y 60% en A549 y células HeLa, respectivamente, lo que indica la eficacia del ARNsi utilizado
.
El efecto de la caída de la expresión de la PRL en la viabilidad de células cancerosas , que es una característica importante de la enfermedad, se investigó. Se encontró LRP regulación a la baja se correlaciona con una reducción significativa en la viabilidad de A549 y células HeLa (Figura 3), lo que indica un papel crucial para la PRL en este proceso. Dado que el mantenimiento de la viabilidad celular es imprescindible para la propagación de células cancerosas, la sugerencia de que la PRL está involucrado en el mantenimiento de este procedimiento adicional implica esta proteína en la enfermedad.
Una reducción en la viabilidad celular fue sin embargo también notó entre las no transfectadas y las muestras de siRNA-SCR en células HeLa (datos no mostrados) y el reactivo de transfección DharmaFECT® 1 ha demostrado ser el agente causal de esta disminución (véanse los datos suplementarios - Figura S1).
para investigar si se indujo apoptosis (una forma de muerte celular programada) en el pulmón tumorigénico y células de cáncer cervical como consecuencia de LRP caída, y por lo tanto ser responsables de la reducción observada en la viabilidad celular, se evaluó los posibles cambios en la morfología nuclear de la célula y el nivel de actividad de la proteína efectora apoptosis asociada a - caspasa-3 (procesos clave indicativas de la inducción de la apoptosis [34], [35], [36], [37], [38]). La presencia de apoptosis A549 y células HeLa después de la transfección con siRNA-LAMR1 fueron identificados por interrupciones visibles en su morfología nuclear (Figura 4), así como por el aumento significativo de la actividad de la caspasa-3 (Figura 5).
el papel de la LRP en el mantenimiento de la viabilidad celular se ha informado en estudios anteriores [7], además, la inducción de la apoptosis en células cancerosas en respuesta a la regulación a la baja LRP también se ha demostrado [39]. Este estudio ha confirmado el papel de LRP en el mantenimiento de la viabilidad celular, así como la inducción de la apoptosis posterior a la caída de esta proteína. Además, este estudio ha revelado que la inducción de la apoptosis está mediada por tanto una pérdida de integridad nuclear y aumentó significativamente la actividad de la caspasa-3 en estas células.
Dado que el receptor de laminina es fisiológicamente funcional en el compartimiento perinuclear [ ,,,0],7], [12], [13] y el núcleo [12], [13], no fue sorprendente que la caída de este receptor podría afectar a la integridad del núcleo. Tanto la interrupción de la morfología nuclear y el aumento de la actividad de la proteína de la apoptosis asociada, caspasa-3, son indicativos de apoptosis, lo que sugiere un papel fundamental para la PRL /LR en el bloqueo de esta forma de muerte celular. Sin embargo, la cuantificación reveló que 91% de siRNA-LAMR1 tratada células HeLa pero sólo 56% de siRNA-LAMR1 tratada células A549 reveló cambios morfológicos nucleares (7% y 8% de siRNA-scr tratado células A549 y HeLa, respectivamente, reveló nuclear morfológico cambios). Dado que la caída de PRL en las células HeLa (60%) fue menor en comparación con las células A549 (83%) que sugerimos que la PRL /LR impide la apoptosis en mayor medida en células de cáncer de cuello uterino en comparación con las células de cáncer de pulmón. Desde 83% de las células HeLa pero sólo 9% de las células A549 revelaron aumento de la caspasa-3 actividad después del tratamiento siRNA-LAMR1, sugerimos además que la apoptosis en células de cáncer de pulmón puede ocurrir predominantemente a través de la caspasa-3 mecanismos independientes como EndoG y /o AIF procesos mediados
Las funciones de PRL /LR en la propagación del cáncer son numerosas: aumento de la invasión. [6], [30], metástasis [6], [30] y la proliferación celular [7], así como una disminución celular viabilidad [7] y la apoptosis [39] están mediadas por esta proteína. Por lo tanto, la orientación PRL /LR puede ser desarrollado como una estrategia para obstaculizar los procesos mencionados anteriormente implicados en la progresión del cáncer. Además, la orientación PRL /LR para el posible tratamiento de estos procesos se han logrado en una serie de líneas de células cancerosas. Por lo tanto, esto sugiere que un /terapia relacionada LR LRP potencialmente podría utilizarse para el tratamiento de numerosos tipos de cáncer diferentes. Sin embargo, debe hacerse hincapié en que este receptor está implicado en muchos procesos fisiológicos en las células normales, incluyendo el crecimiento celular, la diferenciación, el movimiento y el apego [9], [11], y la caída de la PRL en estas células podría ocasionar fallos homeostáticos indeseables. La focalización de PRL únicamente en las células cancerosas tanto, es imperativo para su uso como una alternativa terapéutica.
Apoyo a la Información
Figura S1. Francia El efecto de siRNA-SCR y DharmaFECT® 1 reactivo sobre la viabilidad celular. Se incubaron las células con siRNA-scr, DharmaFECT® 1 reactivo o ambos, y 72 h más tarde, la viabilidad celular se evaluó usando un ensayo MTT. Las células transfectadas con siRNA-scr muestran viabilidad similar, mientras DharmaFECT® 1 y siRNA-scr + DharmaFECT® 1 células tratadas muestran una disminución del 8% y el 9% en la viabilidad celular, respectivamente, en comparación con las células control (incubado durante 72 h en DMEM que contenía 10% (v /v) FCS)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0057409.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
Agradecemos a Uwe Reusch, Stefan Knackmuß y Melvyn poco de ayuda la producción de IgG1-IS18. Se agradece al Dr. Clemente Penny para obtener ayuda con la microscopía de inmunofluorescencia.