Extracto
MicroARN regula las respuestas celulares a la radiación (IR) ionizante a través de control de la traducción de los genes diana. Se analizaron los cambios de series temporales en la expresión de microARN siguientes γ-irradiación en células H1299 con cáncer de pulmón utilizando el análisis de microarrays. Se seleccionaron cambiado significativamente microRNAs IR-sensibles basadas en el análisis de análisis de la varianza, y predijo ARNm diana fueron enriquecidos en la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) de señalización. El análisis simultáneo de ARNm de series temporales y perfiles de microARN descubrió que la expresión de miR-26b fue regulada hacia abajo, y su objetivo la activación del factor de transcripción 2 (ATF2) mRNA fue regulada hasta en las células H1299 gamma-irradiado. IR en el miR-26b sobreexpresa células H1299 no pudo inducir la expresión de ATF2. Cuando la actividad de la quinasa c-Jun N-terminal se inhibió mediante SP600125, la expresión de miR-26b fue inducida después de γ-irradiación en células H1299. A partir de estos resultados, se concluye que el IR-inducida sobre regulación de ATF2 fue coordinada por la supresión mejorada de miR-26b en células de cáncer de pulmón, lo que puede aumentar el efecto de IR en la vía de señalización MAPK
Cita.: Arora H, R Qureshi, Parque AK, WY (2011), coordinado por el Reglamento de ATF2 miR-26b en células γ-irradiado del cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (8): e23802. doi: 10.1371 /journal.pone.0023802
Editor: Sangdun Choi, Universidad Ajou, Corea
Recibido: 16 Junio, 2011; Aceptado: July 26, 2011; Publicado: 25 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Arora et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este papel con el apoyo de una beca de la Fundación Corea Ciencia e Ingeniería (KOSEF) (M20706000020-07M0600-02010), y por el programa Laboratorio de Investigación básica (BRL) a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (2009 -0087452) y por la Corea Healthcare Technology R & amp; D Proyecto, Ministerio de Sanidad, Bienestar Social y Asuntos de la Familia (A084022). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los microARN son transcritos por la ARN polimerasa II y se unen a la región no traducida 3 '(UTR) para suprimir la traducción de ARNm diana [1]. A nivel postranscripcional, microRNAs están implicados en muchos procesos biológicos, incluyendo el desarrollo [2], la proliferación, la muerte celular [3], y la tumorigénesis [4]. Muchos estudios han analizado la regulación de la transcripción de los ARNm y microARN en células gamma-irradiado para comprender las respuestas celulares a la radiación (IR) ionizantes [5], [6], [7].
La proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) juega un papel importante en diversos procesos biológicos, tales como apoptosis, proliferación, diferenciación, señalización de Wnt, y la señalización de p53. la señalización de MAPK es a menudo desregulado en los cánceres humanos, lo que lleva a la proliferación celular no controlada y la supervivencia [8]. IR puede inducir la activación de las vías de MAPK para controlar la supervivencia celular de una manera dependiente del tipo de célula [9]. La activación sensible IR de MAPK vías de señalización está relacionada con la proliferación celular [10].
La mayoría de las vías de señalización celular pueden ser reguladas por el control transcripcional y postraduccional de genes. El microARN miR-7, miR-4, miR-79, miR-2, y miR-11 participan en vías de señalización Notch apuntando a los motivos de secuencias reguladoras en el 3 'UTR de los genes diana [11]. miR-15 y miR-16 están implicados en la vía de señalización nodal [12]. factor nuclear de ligera kappa promotor de gen del polipéptido en las células B 1, un mediador de señalización de daño en el ADN, está regulada por miR-9 y let-7 g en respuesta a IR en líneas celulares de cáncer de pulmón [7]. En el presente estudio, se analizó el perfil de expresión de series de tiempo de microRNAs en líneas celulares de cáncer de pulmón gamma-irradiado. Tratamos de identificar microRNAs IR-sensibles que regulan la expresión de los genes de señalización de MAPK a través del análisis simultáneo de perfiles de microARN y ARNm. Hemos demostrado la regulación coordinada de la activación del factor de transcripción 2 (ATF2), que está codificada por un gen de señalización MAPK, por miR-26b en respuesta a la IR.
Resultados
Para entender el control postranscripcional de las respuestas celulares a IR por microRNAs, el perfil de expresión de todo el genoma de microRNA se examinó en células de cáncer de pulmón humano H1299 a las 0, 4, 8, 12, y 24 horas después del tratamiento con 2Gy de γ-radiación. El perfil de expresión de microARN se analizó mediante un análisis de varianza (ANOVA) para seleccionar microRNAs IR-sensibles. Entre 328 microARN humanos en el microarray, la expresión de 56 (17,1%: 30 hasta regulada y 26 de las reguladas) se cambió significativamente en las células H1299 (P & lt; 0,05; Figura 1 y Tabla S1). Se observaron cambios prominentes a las 8 horas después de la irradiación gamma-en la mayoría de los microRNAs IR-sensibles.
a transcripción inversa ARN pequeños de cada punto de tiempo se marcaron con Cy5. El código de color representa la expresión relativa de los microARN que se indican para cada punto de tiempo. Una lista de todos los microARN está disponible en la Tabla S1.
Para explorar el significado fisiológico de IR-sensibles microARN, que enumeramos predijo mRNAs objetivo de microARN IR-sensibles y las vías de señalización enriquecidos fueron seleccionados sobre la base de enriquecimiento y análisis estadístico de ARNm diana predicho por dIANA-microT-3.0. Entre las vías de señalización de la lista, nos centramos en las 10 primeras vías en función de la significación estadística (tabla 1). Elegimos especialmente la vía para su posterior análisis de señalización MAPK, porque esta vía de señalización es esencial para la supervivencia en respuesta al daño del ADN [13].
Para validar la regulación de la vía de señalización de MAPK por microRNAs IR-sensibles, nos meta-análisis de perfiles de expresión de mRNA de las mismas células H1299 gamma-irradiado de nuestros conjuntos de datos publicados [14]. En el análisis simultáneo de ARNm diana y IR-sensible microRNA, hemos aplicado dos criterios: 1) cambios estadísticamente significativos (p & lt; 0,05) en la expresión de mRNA sobre γ-irradiación por análisis de ANOVA y 2) el valor de correlación alta inversa (r & lt; -0,4 ) entre el ARNm y la expresión de microARN. Como se resume en la Figura 2 y la Tabla S2, se identificaron 35 pares de microARN IR-sensibles y ARNm diana, incluyendo 19 y 23 microRNAs ARNm que no se superponen para señalización MAPK vía de los genes en las células H1299.
validado los patrones de expresión de microRNAs y ARNm diana IR-sensibles de la vía de señalización MAPK. Entre 35 pares, se seleccionaron y analizaron cuatro (miR-26b: ATF2, miR-7: FOS, miR-20a: MAP3K5, y miR-128: PPARg) pares de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR; Figura 3A , B, C y D). Tal como se detecta en los microarrays de datos (Figura 2), se encontró que ATF2, FOS, MAP3K5 y fueron hasta reguladas y PPARg se reguló hacia abajo a la exposición IR. Los microARN como miR-26b, miR-7, y miR-20a se regularon hacia abajo, y miR-128 fue hasta reguladas tras la exposición IR. Por tiempo real de RT-PCR, hemos demostrado que los patrones de expresión de microRNAs seleccionados IR-sensibles y ARNm diana fueron bien adaptado a los de los datos de microarrays de expresión.
La expresión de cuatro pares de micro ARN y ARNm objetivo tales como (A) miR-26b: ATF2, (B) miR-7: FOS, (C) miR-20a: MAP3K5, y (D) de miR-128: PPARg) se cuantificó usando inversa en tiempo real en cadena de la polimerasa reacción (RT-PCR) en el momento indicado. Los valores se normalizaron con gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) ARNm de los ARNm diana y U6B pequeños ARN de microARN. Todos los valores se presentan como media ± desviación estándar (SD) a partir de experimentos por triplicado.
regulados hacia abajo microRNAs IR-sensibles pueden aumentar la función del ARNm diana. Para poner a prueba la relación entre los microARN IR-sensibles y reguladas por los mRNAs objetivo, seleccionamos el par de ATF2 y miR-26b entre los 35 pares de demostrar una regulación coordinada entre los microARN y ARNm diana tras la exposición IR. Un objetivo predicho fue identificado para miR-26b en la posición 112-118 de la ATF2 3 'UTR, como se muestra en la Figura 3A. La sobreexpresión de miR-26b en las células H1299 podría suprimir el nivel de expresión de ARNm ATF2. Además, el nivel de proteína de ATF2 se redujo en las células sobreexpresados-miR-26b (Figura 4A). En ensayos de luciferasa, miR-26b suprime la traducción de luciferasa en construcciones con la 3 'UTR de ATF2, pero no los que no tienen el 3'UTR (Figura 4B). El efecto supresor de miR-26b en ATF2 también se observó en las células H1299 gamma-irradiados (Figura 4C), que se mantuvo hasta 12 horas después de la exposición IR.
(A) En el miR-26b transfectaron células H1299, la expresión de microARN fue confirmada por tiempo real de RT-PCR. La expresión de mRNA en células ATF2 miR-26b transfectadas se mide por tiempo real de RT-PCR. Los niveles relativos de expresión ATF2 se normalizaron en contra GAPDH y se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos. El nivel de proteína ATF2 también fue examinado por Western blot en células transfectadas de microARN. (B) Las células fueron transfectadas con el gen informador de luciferasa de Renilla vacío (psiCHECK2) o el gen reportero fusionado a la ATF2 3 'UTR. Además, las células fueron co-transfectadas con miR-26b o sin miR-26b; Los resultados se expresan como unidades relativas de luz (RLU) y se normalizaron con la actividad de la luciferasa constitutivamente expresada por el vector psiCHECK2. (C) La expresión relativa de ATF2 en el miR-26b transfectadas e IR células expuestas a las 4 (blanco), 8 (gris) y 12 (negro) horas, respectivamente.
A continuación, hemos querido confirmar el efecto de señalización MAPK en la regulación a la baja de miR-26b en las células gamma-irradiado. Nos inhibió la vía de señalización MAPK utilizando SP600125, un inhibidor de la quinasa c-Jun N-terminal (JNK), en células H1299 gamma irradiados. El tratamiento con SP600125 no cambió el nivel de expresión basal de ATF2; Sin embargo, la inducción de ATF2 sobre γ-irradiación fue bloqueado notablemente en células H1299 SP600125 tratados hasta 12 horas después de la exposición IR (Figura 5A). Expresión de ATF2 requiere la activación de la señalización de MAPK, que fue inhibida a JNK por el inhibidor químico. Por el contrario, la expresión de miR-26b se indujo por tratamiento con SP600125 en H1299 células de cáncer de pulmón (figura 5B). Los efectos de SP600125 sobre la expresión de ARNm de ATF2 y miR-26b también se confirmaron en la línea celular de cáncer de pulmón A549 (Figura 5).
H1299 y A549 células fueron tratadas con 10 SP600125 M durante 30 minutos, y luego expuesto a IR. Las expresiones relativas de ATF2 mRNA (A) y miR-26b (B) se normalizaron al nivel de expresión de control en 0 hr en ambos de control y células tratadas con SP600125 en 4 (blanco), 8 (gris) y 12 (negro ) horas. (C) La radiación ionizante induce la expresión de ATF2, que el regulado la expresión de miR-26b en células de cáncer de pulmón gamma-irradiado.
Discusión
Las respuestas celulares a la estimulación exógena pueden ser monitoreados por alteraciones en la expresión génica, incluyendo la expresión de microRNAs. IR puede inducir cambios progresivos en la supervivencia celular, el crecimiento y la proliferación al afectar la expresión génica. Los informes anteriores han sugerido que la radiación puede cambiar el patrón de expresión de genes [15], [16]. Se analizaron los perfiles de microARN para comprender el mecanismo de respuestas celulares microRNA mediada a IR, y para identificar la regulación de la vía de señalización MAPK por microRNAs IR-sensibles. En el presente estudio, hemos dilucidado la represión transcripcional mediado por JNK de miR-26b en las células gamma-irradiados, para lo cual microARN puede suprimir la traducción de ARNm diana ATF2, un miembro de la vía de señalización MAPK. A partir de estos resultados, se sugiere que la respuesta celular a IR está coordinadamente regulada por la interacción entre la vía de señalización MAPK y microARN.
ATF2 es una proteína de respuesta a cAMP elemento vinculante (CREB) con una cremallera de leucina básica (bZIP) de dominio, a través del cual ATF2 interactúa con otras proteínas bZIP como junio, FOS, CREB, y ATF1 [17], [18]. daño del ADN y las citoquinas pro-inflamatorias pueden inducir la activación de la actividad transcripcional ATF2 por JNK [19]. El papel de la diversa señalización en la activación de ATF2 también se ilustra por los socios heterodiméricos de ATF2, que también se activan de una manera-estímulo específico. Por lo tanto, un estímulo particular puede conducir a diferentes complejos ATF2, activando de este modo o la represión de diferentes sub-conjuntos de genes diana [20].
miR-26b es un microRNA intrónica que reside en el intrón IV de CTDSP1, C-terminal dominio pequeño fosfatasa 1. El control transcripcional del anfitrión CTDSP1 mRNA no se entiende completamente, pero existen muchos supuestos sitios de unión para factores de transcripción tales como CREB en ENCODE Transcription Factor Binding Analysis [21]. ATF2 pudo reprimir la transcripción de genes diana a través de la dimerización con otros factores de transcripción bZIP. La sobreexpresión de proteínas bZIP tales como ATF2 y CREB alteró la expresión génica en células miometriales humanos [22]. El meta-análisis sobre esta microarrays de datos en la órbita geoestacionaria (GSE1059) reveló la baja regulación de CTDSP1 en las células ATF2 sobreexpresado. Tenemos que analizar más a fondo el control transcripcional de miR-26b por ATF2 en células de cáncer de pulmón; sin embargo, la actividad JNK y la expresión de ATF2 reprimidos expresión de miR-26b se lleva a cabo en el estudio actual.
La desregulación de la vía de señalización MAPK puede ser inducida por daño en el ADN IR inducida por [23]. En el presente estudio, se encontró que la señalización de MAPK se induce en las células H1299 gamma irradiados, lo que podría mediar en la supervivencia de las células de cáncer de pulmón H1299 tras la exposición IR. Además, la activación de la señalización de MAPK llevó a la baja regulación de miR-26b, que apoyó el mantenimiento de la actividad ATF2 a su vez. A partir de estos resultados, hemos podido demostrar que la exposición de las células de cáncer de pulmón H1299 a IR señalización de MAPK inducida seguido de supresión de la expresión de miR-26b, que dio lugar a la fuga de ATF2 ARNm de la supresión posterior a la traducción por miR-26b. Proponemos que el miR-26b media coordinar la regulación de ATF2 y la vía de señalización MAPK en respuesta a la IR.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
células de cáncer de pulmón humano
H1299 eran mantuvieron en medio RPMI 1640 y las células A549 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y 2 mM L-glutamina [ambas líneas celulares se adquirieron de ATCC]. Las células cultivadas fueron o bien expuestos a 2 Gy de radiación usando un acelerador lineal 4-MV (Clinac 4/100; Varian, Palo Alto, CA, EE.UU.) o izquierda no irradiado como un control negativo. El SP600125 específico inhibidor de JNK se adquirió de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). células H1299 se incubaron con SP600125 10 M durante 30 min, y luego expuestas a IR (2 Gy) seguido de aislamiento de ARN total en los tiempos indicados.
MicroARN microarray
MicroARN de cada línea celular se extraído utilizando el kit de aislamiento de mirVana micro ARN (Ambion, Austin, TX, EE.UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante. microRNAs purificados se marcaron utilizando el Kit de matriz Etiquetado mirVana microARN y se acoplan a la Cy5 Post-Etiquetado del tinte reactivo (Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ, EE.UU.). Las muestras marcadas se lavaron y se hibridaron por duplicado a mirVana microARN Bioarrays (Ambion), utilizando el Kit de mirVana microARN Bioarray Essentials. intensidades de fluorescencia se procesaron y se midieron utilizando el escáner GeneChip 7G 3000 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). Los niveles de hibridación microRNA se determinaron usando software GenePix Pro 6.0 como se recomienda por el fabricante. La intensidad de fondo ajustada para cada microRNA se sometió a un procedimiento de estabilización de la varianza normalización mundial [24]. Toda la información es compatible con MIAME y los datos en bruto ha sido depositado en una base de datos compatible con MIAME (GEO) (número de acceso - GSE30075).
Estadística y análisis bioinformática
Para identificar microRNAs para los que los niveles de expresión cambiado significativamente a lo largo del transcurso de tiempo, se utilizó el análisis unidireccional ANOVA. Teniendo en cuenta la estructura de correlación de repeticiones dentro de la gama [25] en mirVana microARN Bioarrays, se realizó un análisis unidireccional ANOVA en 328 microARN humanos. DIANA (http://diana.cslab.ece.ntua.gr/), que integra los microARN humanos y de ratón en vías de predecir los objetivos de microARN [26], se realizó inicialmente para identificar las vías.
Preparación de ARN y cuantitativa en tiempo real PCR
ARN total fue extraído a partir de líneas celulares utilizando el método de TRIzol, y después a transcripción inversa a ADN complementaria usando transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y oligo (dT) 12-18 cebadores de acuerdo con el protocolo del fabricante. La RT-PCR cuantitativa para los genes indicados se llevó a cabo en una mezcla de reacción que contiene SYBR Premezcla Ex Taq (Takara Bio Inc., Shiga, Japón). La cuantificación de microARN se realizó mediante ensayos de microARN TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), según el protocolo del fabricante. Las muestras se analizaron utilizando el PRISM 7000 sistema de detección de secuencias ABI (Applied Biosystems). Todos los PCRs se realizaron por triplicado, y la especificidad de la reacción se determinó por análisis de la curva de fusión en la etapa de disociación. Se sintetizaron cebadores específicos para ATF2 (adelante: 5'-AGATTTATTAATTTTTCTGTGCTCAA-3 '; inversa: 5' ACACCCCCATTTATTAAAACACC-3 '), FOS1 (adelante: 5'-TGTGTTCCTGGCAATAGTGTG-3'; inversa: 5'-CAATGAACATTGATGTTGAAGAAA-3 '), MAP3K5 (adelante: 5'-GCAGCAGCTATTGCACTTCA-3 '; inversa: 5'-TGGTCACATTTTGGTTTTGTTC-3') y PPARg (adelante: 5'-CCTGCAGGAGATCTACAAGGA-3 '; inversa: 5'-GGTGTCAGATTTTCCCTCAGA-3'). El método cuantitativo relativo se utilizó para el análisis cuantitativo. El calibrador era el? Ct promedio de las células no tratadas. El control endógeno era gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) de genes y U6B para microRNAs.
Western blotting
Las células se recogieron y se lisaron en NP-40 tampón que contiene fluoruro de fenilmetilsulfonilo y cóctel inhibidor de la proteasa (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). Los extractos de proteína se separaron a continuación por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, y después se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Las membranas se incubaron con un anticuerpo ATF2 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology Inc.) en solución salina tamponada con Tris Tween 20 tampón con leche seca no grasa, y después se incubaron con anticuerpo secundario de rábano picante conjugada con peroxidasa (dilución 1:5000; Bio -Rad). Las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando el Oeste-Q-Plus Kit sustrato quimioluminiscente (BIOTANG, Waltham, MA, EE.UU.).
Las construcciones, transfección, y el ensayo de luciferasa
El precursor de miR-26b se clonado en pcDNA3 (Invitrogen) mediante PCR genómica de ADN con cebadores (adelante: 5'-CCGGAATTCCGGATGGGAATTGGATACAT-3 '; inversa: 5'-ATTGCGGCCGCAGCTACCCTGACCACTGCTGC-3'). Los 3 'UTRs de ATF2 se clonaron aguas abajo del gen de la luciferasa de Renilla en el psiCHECK2vector (Promega, Fitchburg, WI, EE.UU.). La construcción se transfectó usando FuGENE HD reactivo (Roche, Basilea, Suiza) en tiempo real de RT-PCR, transferencia Western, y ensayos de luciferasa. Los ensayos de luciferasa se realizaron utilizando el kit de ensayo Dual-Luciferase (Promega). Normalización de la expresión de Renilla se realizó utilizando luciferasa de luciérnaga presente en el vector psiCHECK2.
Apoyo a la Información sobre Table S1. List de microRNAs seleccionados a partir de las células H1299.
doi: 10.1371 /journal.pone.0023802.s001 gratis (XLSX)
Tabla S2.
mRNA seleccionada: pares de microARN de la vía de señalización MAPK en base al análisis de enriquecimiento.
doi: 10.1371 /journal.pone.0023802.s002 gratis (XLSX)
Reconocimientos
Los autores agradecen a los miembros del laboratorio Parque de discusión, así como H.-S . Shin y H.-J. Jeon para microarrays de microARN.